Summary
Этот протокол описывает изготовление больших масштабах, мультиплексированных двумерный ДНК или антител массив, с потенциальными приложений в сигнальных исследований клеток и выявления биомаркеров.
Introduction
Антитела микрочипов были широко использованы в протеомическим исследований в течение многих десятилетий, чтобы исследовать присутствие целевых протеинов, в том числе белковых биомаркеров 1-3. Хотя это поле в настоящее время сталкивается с серьезными проблемами из других технологий высокой пропускной такие как масс-спектрометрии (МС), есть еще много места для утилиты микрочипов антител, в основном потому, что эти устройства позволить себе простую интерпретацию данных и удобный интерфейс с другими анализами. В последние годы, интеграция микрочипов в микрочип лесов предоставил антитело микрочипов новую возможность процветать 4-7. Например, штрих-код микрочипов интегрированы в одноклеточного микрочипа был использован в исследованиях 8,9 сотовой связи. Эта технология имеет свои отличительные преимущества перед другими доступными технологиями микрочипов. К услугам гостей элементы массива в 10-100 мкм, намного меньше, чем типичный 150 мкм размер, используемый в обычных микрочипов ElemenTS. Строительство небольших элементов массива достигается с помощью систематических подходов потока паттерна, и это приводит к компактных микрочипов, которые могут обнаружить одноклеточного секретируемые белки и внутриклеточные белки. Еще одним преимуществом является использование простого прибора, свободной установки. Это особенно важно, потому что большинство лабораторий и небольшие компании не могут иметь доступ к микрочипов основные средства. Такой штрих-микрочипов антител функция расширенного анализа пропускной способности и может быть использован для выполнения чрезвычайно мультиплексированных анализов на отдельные клетки при достижении высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой с обычной сэндвич иммуноферментного анализа (ELISA) 8. Эта технология нашла широкое применение в выявлении белков из глиобластомы 9-11 Т-клетки 12 и циркулирующих опухолевых клеток 13. Кроме того, ДНК-чипы штрих одна были использованы в точного позиционирования нейронов и астроцитов для подражатьING сборку в естественных условиях ткани головного мозга 14.
Этот протокол фокусируется только на экспериментальных шагов и наращивание блоков двумерного (2-D) штрих-кодов микрочипов антитела, который имеет потенциальные приложения в обнаружении биомаркеров в жидкостных образцов и в одиночных камерах. Технология основана на адресуемой одноцепочечной, одномерных (1-D) микрочипов ДНК, сконструированной с использованием ортогональных олигонуклеотиды, которые узорчатые пространственно на стеклянных подложках. 1-D структура сформирована при параллельных проточных каналов используются на этапе потока узора, и такая картина выглядит как дискретные полосы визуально похожими на 1-D универсальный код продукта (UPC) штрих-кодов. Строительство массива антител в 2-D (п х м) - напоминает 2-D Быстрый ответ (QR-код) матрицы - нуждается в более сложные стратегии паттерна, но позволяет для иммобилизации антител при высокой плотности 8,15. Изготовлениетребует двух шагов паттерна ДНК, с первого рисунка перпендикулярно второму. Точки пересечения этих двух моделей представляют собой н х м элементы массива. Эффективно выбора последовательности одноцепочечной ДНК (оцДНК), используемого в проточной паттерна, каждый элемент данного массива присваивается определенный адрес. Это пространственная привязка необходима различения сигналов флуоресценции на микрочипов слайда. Массив оцДНК преобразуется в массив антител путем включения дополнительных ДНК-конъюгаты антител, образуя платформу под названием библиотеку ДНК закодированный антитела (ДЕЛО 16).
Этот протокол ролик описывает основные шаги в создании NxM массивы антител, которые включают подготовку полидиметилсилоксана (PDMS) штрих-кодов формы, поток-паттерна оцДНК в двух направлениях, подготовка антитело-олигонуклеотидных конъюгатов сделки, и преобразования массив 3 х 3 ДНК в 3х 3 массива антитела.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Внимание: многие химические вещества, используемые в настоящем протоколе являются раздражителями и являются опасными в случае контакта с кожей. Обратитесь Паспорта безопасности (MSDS) и носить соответствующие средства индивидуальной защиты, прежде чем выполнять этот протокол. Пиранья раствор, используемый на стадии (1.1.1) является весьма агрессивной и должны быть готовы, добавив перекись медленно кислоты при перемешивании. Ручка это решение с особой осторожностью в вытяжном шкафу. Используйте соответствующую защиту для глаз и кислотоупорные перчатки. Триметилхлорсилан (ТМЦ) является коррозию, легковоспламеняющиеся химических веществ, используемых в необязательной стадии после (1.1.6). Ручка этого химического вещества в вытяжном шкафу.
Примечание: Выполните изготовление штрих-кодов слайд и критические процедуры потока паттерна в чистой комнате, чтобы свести к минимуму загрязнение твердыми частицами. Частицы пыли могут блокировать порты и микроканалов PDMS формы и мешать потока-паттерна.
1. Строительство One-dimensionaл ДНК Штрих Презентация
- Подготовка СУ-8 хозяина для моделей потока штрих-кодов
Примечание: Рисунки для перпендикулярных картины течения (1А-B) создаются с помощью программного обеспечения автоматизированного проектирования (САПР). Эти модели оказываются на хромированной фотошаблона. Прозрачные области маски соответствуют особенностям СУ-8 хозяина.- Очистить кремниевой пластины (диаметр 100 мм) тщательно в смеси 3 H 2 SO 4: 1 30% Н 2 О 2 (пираньи раствор), нагретого до 96 ° С. Промыть пластины деионизированной воды и изопропилового спирта с последующим высушиванием с продувать азотом пистолета.
- Налейте около 4 мл SU-8 2025 фоторезиста на пластине. Использование программируемого отжима нанесения покрытий, чтобы равномерно распределить фоторезиста на пластине в течение 10 сек при 500 оборотах в минуту, то 30 сек при 3000 оборотов в минуту. Это создает слой фоторезиста толщиной ~ 25 мкм. Постепенно позволяют спиннинг, чтобы замедлить до остановки - это в МАИntain равномерного покрытия на поверхности пластины в.
- Печь с покрытием пластины на плите в течение 1 мин при 65 ° С, затем в течение 5 мин при 95 ° С. Этот шаг позволяет покрытию затвердеть. Охлаждают до комнатной температуры в течение 5 мин.
- Поместите хром маску (рис 1С) на фоторезиста пальто. Выявить особенности маски в ближнем УФ-света (350-400 нм, энергетической экспозиции 150-160 мДж / см 2) в течение 20 сек.
Примечание: Конструкция на хромированной маской содержит 20 каналов, каждый из которых шириной 50 мкм с шагом 20 мкм. Каналы обмотки от одного конца образца к противоположному концу. В целом, 20 каналов покрывают прямоугольную область с длиной ~ 40 мм и шириной ~ 20 мм. Каждый канал между двух круговых функций, которые соответствуют входным отверстием и выходным отверстием. Входы и выходы являются взаимозаменяемыми. - Выпекать подвергается пластины на плите в течение 5 мин при 95 ° С. Охлаждают до комнатной температуры в постепенно.
- Погрузитесь пластины в СУ-8 разработчика при перемешиваниив течение 5 мин. Промыть пластины с небольшим количеством свежего СУ-8 разработчика, а затем изопропиловым спиртом. Высушите пластины, используя удар азота пистолет. Жесткий-печь пластины на 200 ° C плитке в течение 30 мин, и позволяют пластины постепенно остыть до комнатной температуры.
Примечание: Разработка может осуществляться в течение более длительного времени, если белый налет наблюдается после промывки на этом этапе.
Дополнительно: Silanize Су-8 мастер подвергая его триметилхлорсилана пар в закрытой посуде Петри в течение 10 мин.
- Подготовка штрих-кода форму PDMS
- Смешайте 40,0 г силиконового эластомера с базой 4,0 г отвердителя. Перемешать смесь форполимерный энергично в течение 10 мин. Дега в течение 20 мин в вакууме.
Примечание: Как правило, использовать 10: 1 (база: отвердитель) отношения масс. - Налейте форполимера в чашку Петри, содержащую кремниевой пластины с СУ-8 хозяина рисунка штрих-кода. Высота смеси PDMS должно быть около 7,5 мм или выше. Дегазации смеси в Petrя блюдо для второй раз, чтобы удалить оставшиеся пузырьки любые, то испеките смеси в течение 1 ч при 75 ° С, чтобы вылечить PDMS.
Примечание: Важно, чтобы поддерживать достаточную толщину плиты PDMS при ~ 7,5 мм или выше, чтобы избежать добавления слишком много напряжение в PDMS-стекла связи при введении выводов / трубки через отверстия в пресс-форме PDMS на стадии (1.3.3.1) - Использование скальпеля, осторожно обвести области плиты PDMS, который содержит элементы пресс-форм штрих-кодов и очистить плиту от пластины.
- Обрезать края плиты, чтобы достичь желаемого форму штрих форму PDMS. Удар 20 отверстий (диаметр 1,0 мм), через форму с помощью биопсии удар с плунжером. Убедитесь, что отверстия были выровнены с круговой особенностей рисунка штрих-кода. Эти отверстия служат входов и выходов.
- Смешайте 40,0 г силиконового эластомера с базой 4,0 г отвердителя. Перемешать смесь форполимерный энергично в течение 10 мин. Дега в течение 20 мин в вакууме.
- Одномерный структурирование поли-L-лизин (PLL)
- Для удаления пыли на поверхности поли-L-лизин покрытием стекло с использованием продувать азотом пистолет. АТТАСч PDMS плесень чистой стекло. Убедитесь, что края кристаллизатора и ползуна выровнены.
- Выпекать в течение 1,5 ч при 75 ° С, чтобы усилить связь между формой и PDMS ползуна ФАПЧ покрытием. Между тем, подготовить 20 штук гибкой трубки из полиэтилена (3- 4-дюймовые части, с внутренним диаметром 0,5 мм и внешним диаметром 1,5 мм).
Примечание: количество штук трубки соответствует количеству впускных отверстий в штрих-код пресс-формы PDMS. Трубка служит для соединения каналов на PDMS штрих плесени в резервуар азота, снабженной регулятором давления. - К одному концу каждой части трубки, прикрепить нержавеющей стали полый штифт (диаметр 1 мм). Аспирируйте стерильно фильтруют поли-L-лизин решение через вывод, по крайней мере до 1 см трубки не заполнен раствором.
- Закрепите штифты (подключенные к решению заполненные трубки) на входы в PDMS штрих форму (рис 1E). Прикрепите другой конец трубы, чтобыбак азота давления регулируется настройки. Разрешить решение течь через форму, используя диапазон давления 0,5-1 атм из, по крайней мере 6 часов.
Примечание: Обратитесь к шагу (1.3.3) для всех процедур потока паттерна.
- Закрепите штифты (подключенные к решению заполненные трубки) на входы в PDMS штрих форму (рис 1E). Прикрепите другой конец трубы, чтобыбак азота давления регулируется настройки. Разрешить решение течь через форму, используя диапазон давления 0,5-1 атм из, по крайней мере 6 часов.
- Одномерная паттерна одноцепочечной ДНК 14
Примечание: фосфатно-солевой буфер (PBS), используемый в последующих стадий получали из 137 мМ NaCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, и 2 мМ KH 2 PO 4 рН 7,4 буфер.- Подготовьте 2 мМ бис (сульфосукцинимидил) суберат (БС3) решение в PBS. Подготовьте 300 мкМ решения A, B, C и одноцепочечной ДНК (5'-амин изменены, 80 нуклеотидов) в PBS или сверхчистой воды.
Примечание: Используйте БС3 решение в течение примерно 30 минут после приготовления, так как -hydroxysuccinimide эфир N легко подвергается гидролизу. - Смешайте 2,5 мкл 300 мкМ A, B, C или оцДНК с 2,5 мкл 2 мМ бис (sulfosuccinimидиллия) суберат в PBS для каждого канала. А, Б, В и С ДНК обозначены на каналы 1, 2 и 3, соответственно. Этот порядок также применяется к оставшимся наборов каналов 3 (фиг.2А).
- Выполните шаг (1.3.3). На этот раз, аспирации 5-мкл решения БС3 / ДНК через контакты из нержавеющей стали и труб в полиэтиленовой, то соедини PDMS плесень источника азота. Разрешить решение BS3 / ДНК проходить через штрих-кода пресс-формы в течение приблизительно 40 мин или до по крайней каналы заполнены.
- Остановка потока сразу все каналы заполнены, то инкубировать решение BS3 / ДНК в штрих-коде при КТ в течение 2 ч. Не позволяйте решение высохнуть. Печь пресс-формы PDMS с прикрепленной штрих слайд в течение 1 ч при 75 ° С.
Примечание: Чтобы облегчить регулировку на последующих стадиях потока паттерна, края узора канала на штрих-слайд можно выделить. Это делается путем тщательного царапин на поверхности стекла, используя алмазную Scribе генерировать выравнивания маркеров на нижней части стекло. Выравнивание на более поздних стадиях протокола могут быть проверены под микроскопом. - Удалить плесень PDMS от штрих-кода слайда. Промыть слайд осторожно 0,01% SDS один и три раза сверхчистой воды.
- Высушите штрих слайд, используя предметное стекло счетчик. Хранить штрих слайд в чистом центрифужную пробирку на 50 мл для последующего использования.
- Подготовьте 2 мМ бис (сульфосукцинимидил) суберат (БС3) решение в PBS. Подготовьте 300 мкМ решения A, B, C и одноцепочечной ДНК (5'-амин изменены, 80 нуклеотидов) в PBS или сверхчистой воды.
2. Подтверждение одномерной узор на штрих Slide
Примечание: Этот протокол проверки также могут быть адаптированы для использования в оценке качества последующих шагов поток паттерна.
- Блокирование слайд
- Готовят 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Фильтр на этот раствор через фильтр в шприце 0,45 мкм перед его использованием. Использование геля-наливного наконечника, применяются 50 мкл 1% раствора BSA, чтобы один край штрих слайда.
- Выдержите 1% BSA Solutион в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубация с цианиновых 3 (Cy3) -conjugated комплементарной ДНК
- Подготовка коктейль A ', B', и олигонуклеотиды C ', конъюгированный с Cy3 на одном конце. Последовательности А ', В' и С 'дополняют те A, B, и С, соответственно. Рабочий концентрация Cy-3 ДНК 0,05 мкм в 0,1% BSA.
- Удалить решение BSA от слайда с помощью пипетки, а затем применить 30 мкл ДНК раствора коктейль на той же краю слайда. Инкубируйте коктейль Cy-3 ДНК на слайде при комнатной температуре в течение 1 часа. Выполните эту инкубационный шаг в темноте, чтобы защитить группу от Cy3 фотообесцвечивания.
- Анализ интенсивности флуоресценции
- Пипетировать из коктейль Cy-3 ДНК и мыть стекло в 1% BSA, PBS, и, наконец, в разбавленном PBS (1 рИскусство PBS с 50 частями воды высшей степени очистки). Высушите слайд, используя счетчик.
- Соблюдайте флуоресценции (рис 2B), используя флуоресцентный микроскоп или микрочипов сканер. При использовании микрочипов сканер, установите длину волны излучения лазера на длине волны 532 нм, размер пиксела в 5 микрон, ФЭУ (ФЭУ) усиления на 450 и силы на 15%.
3. Изготовление массива 2-мерный (3x3) ДНК 14
- Подготовка штрих-кода форму PDMS
- Выполните процедуру (1.1) построить еще один СУ-8 хозяина, но на этот раз использовать хромированную маску с рисунком потока перпендикулярно, что первой конструкции. Выполните процедуру (1.2) построить новый PDMS плесень с перпендикулярной рисунком.
- Двумерная поток паттерна одноцепочечной ДНК
- Для массива 3 х 3, подготовить 150 мкМ исходные растворы Х-я, b'-II, III-c', Х-IV, V-В', Сх-VI, Х-VII, B"-viii и С'-IX ДНК в 3% БСА / ЗФР. Эти олигонуклеотиды служить «наведения последовательностей» (рис 2А). Объедините олигонуклеотидных решения (решения от 1 до 3) такие, что рабочая концентрация 50 мкМ для каждого олигонуклеотида. Используйте инструкцию, представленную в таблице 1.
- Поток 3% BSA / PBS блокирующего раствора во все 20 каналов в течение 1 ч при 0,5-1 МПа.
- Решения потока 1, 2, и 3 в каналы 1, 2, и 3, соответственно. Следуйте этот порядок для последующих наборов 3 каналов. Поток обычно заканчивают в 40 мин вокруг. Инкубируйте растворы ДНК при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы позволить ДНК для гибридизации.
- Поток 3% BSA / PBS блокирующего раствора во все 20 каналов в течение 1 ч при 0,5-1 МПа для удаления негибридизированным ДНК. Снимают плиты PDMS, и мыть полученную ДНК микрочипов слайд погружением предметного стекла в 3% БСА / ЗФР один раз и два раза PBS, а затем разбавленной PBS (1 часть PBS и 50 частей воды) сверхчистой. DРай на слайд, используя предметное стекло счетчик.
- Выполните второй шаг проверки (рис 2С), аналогичный в разделе 2. Использование олигонуклеотидов я ", чтобы IX ', которые являются Су3-сопряженными. Храните массива слайда в центрифужную пробирку на 50 мл для последующего использования 3 х 3.
Примечание: микрочипов ДНК можно хранить при комнатной температуре в эксикаторе в течение нескольких месяцев.
4. Преобразование в массив ДНК 3 х 3 в массив антитела
- Подготовка антитело-олигонуклеотидных (АКЦИЯ) конъюгатов
- Готовят растворы 200 мМ сукцинимидил-4-формилбензойной кислоты (S-4FB) и 40 мМ сукцинимидил-6-hydrazinonicotinamide (S-ГНА) в безводном N, N-диметилформамиде (ДМФ).
- Подготовка до 7 отдельных растворов захвата антител (1 мг / мл) в PBS.
Примечание: Если антитела растворы содержат азид натрия бактериостат, выполните буфера обмена с помощью PBS спин обессоливающей Columns с 7 кДа молекулярной массы отсечки (MWCO). - Подготовьте отдельные 400 мкм решений я ', II', III ', IV', V, VI ', и ДНК VII. Связать каждый захват антитела к одной последовательности олигонуклеотидов. Комбинат 40 мкл 400 мкм ДНК с 12.25 мкл ДМФ в микропробирок и спин вниз тщательно перемешать.
- Для каждого решения ДНК / DMF, добавить 2,3 мкл 200 мМ S-4FB в DMF. Для каждого 100 мкг захвата антитела, добавить 2,25 мкл 40 мМ S-ГНА в DMF.
- Инкубируйте антитело / решения S-ГНА и ДНК / S-4FB в течение 4 ч при комнатной температуре.
- В рамках подготовки к реакции антитело-ДНК связи, подготовить новые спина обессоливания колонн (по одному для каждого раствора ДНК и один для каждого антитела), вымойте их с цитрат буфер при рН 6.
- Через 4 часа инкубации выполнения замены буфера для каждого антитела / S-ГНА и раствор ДНК / S-4FB. Объедините S-4FB-сопряженных
- Инкубируйте реакции O / N при 4 ° C.
- Очистка антитела олигонуклеотидных (АКЦИЯ) конъюгатов
Примечание: для очистки антител конъюгатов олигонуклеотид, выполнить быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) на стандартной системе FPLC, снабженной GL колонке Superose 6 10/300.- Установка длины волны УФ-детектора системы FPLC до 280 нм. Использование изократического поток PBS (рН 7,4) при 0,3 мл / мин, чтобы отделить конъюгатов антитело-олигонуклеотид от избыточного S-4FB-ДНК.
- Объединяют фракции, содержащие конъюгат и концентрат фракции до объема 150 мкл с использованием спиновых фильтров с 10 кДа MWCO.
- Двумерная рисунка антител
- Подготовьте другой PDMS плесень с микрокамеры или микро-скважин насING процедуры изготовления на этапе (1.2). PDMS плесень может содержать микролитр в нанолитровых скважин для иммунологических.
Примечание: Для общего обнаружения биомаркеров в жидкостных образцов, плесень PDMS с несколькими скважинами в паре с массива слайда. Особенности формы PDMS зависит от изучаемой системы. Например, обнаружение белков из экспериментов одной клетки может быть выполнена с плесенью PDMS, содержащего микрокамеры с 0,15-NL объемов. - (Необязательно) Тема на PDMS плесень на плазме уборка (18 Вт) в течение 1,5 мин, чтобы сделать его узорчатую поверхность гидрофильной. До плазменной очистки, используют клейкую ленту, чтобы блокировать все другие поверхности, которые будут непосредственно связан с массива слайда 3 х 3.
Примечание: Шаг (4.3.2) не является обязательным, но обычно выполняется, когда форма ПДМС предназначен для использования в экспериментах одну ячейку. - Mate форму PDMS с массивом слайд 3 х 3, то блок слайд с 1% BSA в PBS. Инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Meanwhiле, подготовить коктейль (200 мкл конечный объем) антитела-олигонуклеотид конъюгатов. Рабочая концентрация каждого конъюгата составляет 10 мкг / мл в 1% BSA / PBS.
- Добавьте антитело-олигонуклеотид коктейль, то инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С, чтобы позволить олигонуклеотид фрагмент конъюгатов для гибридизации с конкретным пятен на 3 х 3 массивов, тем самым преобразуя массив ДНК в массив антител.
- Повторите шаг (3.2.4), чтобы очистить и высушить слайд. Максимальное значение может быть достигнуто, если массив антитела использовали немедленно. Длительное хранение может привести к потере чувствительности.
- Подготовьте другой PDMS плесень с микрокамеры или микро-скважин насING процедуры изготовления на этапе (1.2). PDMS плесень может содержать микролитр в нанолитровых скважин для иммунологических.
- Обнаружение белков
- Восстановить рекомбинантные белки или приготовить фильтрованную образец клеток.
- Mate микрочипов с специально разработанный чип, и блокируют поверхность с 3% БСА в PBS в течение 1 часа. Затем удалить раствор BSA, и применять образцы и инкубируют в течение 2 ч.
- Смыть образцы, используя 3% BSA в PBS в три раза, А.Н.D затем добавить антитела обнаружения в концентрации, представленной спецификации продукта. Инкубируют в течение 2 часов.
- Смыть антитела обнаружения от 3% BSA в PBS в три раза, а затем добавить цианиновых 5 (Cy5) -streptavidin на 1 мкг / мл, а затем инкубировали в течение 1 часа.
- Повторите шаг (3.2.4), чтобы очистить и высушить слайд для сканирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проекты для PDMS формы (1А-1B) были сделаны с помощью программы CAD (AutoCAD). Две конструкции, показанные художественные каналы для потока паттерна, один горизонтальный и один вертикальный. Левые и правые части каждой конструкции являются симметричными; либо из них может быть входа или выхода. Каждый из 20 каналов обмотки от одного конца до упора до другого конца. Каждый дизайн печатается на хромированной фотошаблона (рис 1в). Сфабрикованный СУ-8 мастер на подложке показан на рис 1D. Для облегчения потока-паттерна PLL или ДНК, форма PDMS был связан с потоком газообразного азота настройке (рис 1E).
Есть три шага потока паттерна, используемые в настоящем протоколе. Первым шагом удерживает PLL на стеклянной подложке, в то время как последующие шаги и ввести олигонуклеотидных решения. В таблице 1, oligonucleotide композиции Solutions 1-3 приведены. Рабочая концентрация каждого олигонуклеотида 50 мкм, а общий объем каждого раствора составляет 39 мкл. Эти растворы получают путем объединения 13 мкл каждого олигонуклеотида маточного раствора (150 мкМ).
В узорные микрочипов единиц ДНК повторяются и прилегающих по всей стекло. В течение 3 х 3 микрочипов, максимальная плотность составляет около 400000 точек на одном предметном стекле. Бок-о-бок сравнение с коммерческой микрочипов ДНК показывает, что наша технология примерно в 5 раз более чувствительны при связывании с Cy3 помечены комплементарных ДНК. В узорные ДНК относительно равномерным ~ 5% вариации на нескольких повторов. Эти особенности обещают высокую количественного способность нашей технологии при измерении содержания белка из биологических образцов. Кроме того, ортогональность ДНК в сочетании с конструкцией проточного канала предложить flexibiliти паттернов в различных геометрий (рис 2D).
После преобразования массив ДНК в массив антител путем гибридизации с ДНК-антитела конъюгатов (Фиг.3В), в результате панель антитело используют в мультиплексном детектирования, в основном через сэндвич платформы ELISA, как показано на фиг.3С. В сэндвич-ELISA биотинилированные вторичные обнаружения) (антитела связываются с захваченных белков, и последующее мечение флуорофора-конъюгированный стрептавидин позволяет флуоресценции на основе обнаружения (3С-E). Обнаружение белков шоу <10% вариации от одного конца до другого конца стекло (рис 3D). С 3 х 3 массива, мы можем обнаружить до 7 белков, в то время как назначение одного элемента массива в качестве ссылки (Су3 помечены) и еще один элемент в качестве отрицательного контроля. Например, в эксперименте одноклеточного выполняется дляисследования опухоли, белки интерлейкина-6 (ИЛ-6), матрица metallopeptidase 9 (ММР9), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интерлейкина-8 (ИЛ-8) и ингибирования миграции макрофагов фактор (MIF) из одной клетки могут быть обнаружены одновременно (рис 3E).
Мы также откалиброван систему с помощью рекомбинантных белков в различных концентрациях. На фиг 3F, калибровочные кривые для рекомбинантных белков интерферона-гамма (IFN-gamma), фактор некроза опухоли α (ФНО альфа), интерлейкин-13 (ИЛ-13), фактора некроза опухоли β (TNF & beta;), гранзима, интерлейкин -4 (ИЛ-4), и интерлейкин-8 (ИЛ-8) показаны. Чувствительность обнаружения очень похож на том, что обычного сэндвич ELISA на луночных планшетах даже при более высоком содержании НОО и, возможно, антител на подложке.
Штрих-код antibodу микрочипов может быть использован для обнаружения биомаркеров в жидкостных образцов, а также в одиночных клеток. Так анализ отдельных клеток не является предметом этого протокола, мы просто примером применения антител микрочипов 3 х 3 в обнаружении цитокинов. Через антитело-поверхностным маркером взаимодействий, кластер дифференцировки 8 (CD8) -положительные клетки были захвачены на одном из элементов микрочипов (рис 3G; чип ПДМС сверху), а остальные элементы были использованы для выявления секретируемых цитокинов ( Рисунок 3Н). С помощью этого метода захвата клеток, "клеточные массивы" могут быть сформированы. Эта методика захвата массива также позволяет контролировать количество клеток, подвергнутых каждом эксперименте ELISA. Клетки физически изолированы в микрокамеры так, что обнаруженные белки относились к конкретным одиночных клеток. На фиг 3H, показано, что каждая Микрокамера оснащен 16 микрочипов элементы, обеспечивающие инкапсуляциюполная 3 х 3 микрочипов множество.
Рисунок 1. Проектирование и изготовление пресс-форм PDMS штрих-кодов для потока на основе паттерна ДНК. Панель (А) показывает рисунки AutoCAD для горизонтальных и вертикальных одномерных штрих-кодов моделей. Панель (б) показана накладываются горизонтальные и вертикальные узоры штрих из (а). Зеленые ящики вложить области узорные с дискретными 3 х 3 массивов. (С) Хром маска для изготовления СУ-8 хозяина. (D) СУ-8 мастер изготовлен на кремниевой пластине. (Е) Настройка для потока паттерна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Строительство и проверка массива 3 х 3 ДНК. Эта цифра была изменена с "количественного межклеточных Взаимодействие функции с приложениями к клеткам глиобластомы рака," Ванга, J. и др., 2012, Nano Lett 12 , Copyright 2012 Американского химического общества. Адаптировано с разрешения. (А) Схема шагов ДНК потока паттерна. Профиль (Б) Интенсивность флуоресценции 20 каналов в выбранной области (прослеживается по вертикали) от штрих-кода 1D. Cy3-сопряженных олигонуклеотиды гибридизовали с массивами ДНК для проверки. (С) флуоресценции профиль интенсивности массивов проверенных с Су3-сопряженного ДНК после завершения второго этапа паттерна ДНК. (D), альтернативные модели флуоресцентные из разных Флоридавл-паттерна стратегии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Применение по 3 х 3 микрочипов. (A) Схема синтеза антител олигонуклеотид АКЦИЯ конъюгатов. (В) Схема для преобразования массива ДНК в массиве антител путем гибридизации с антителами олигонуклеотид конъюгатов. (С) Схема использования 3 х 3 микрочипов в сэндвич ELISA платформы. Эта цифра была изменена с "количественного межклеточных Взаимодействие функции с приложениями к клеткам глиобластомы рака," Ван, J. и др., 2012, Nano Lett 12. Copyright 2012 Американского химического общества. Адаптировано с разрешения. Панель (D) показывает флуоресценции считывание сгенерированный под Cy5 канале. Это соответствует сэндвич ELISA эксперимента, который обнаружил 6 белков. Панель (Е) в увеличенном масштабе профиля 3 х 3 массива считывания под Cy3 и Cy5 каналов. Панель (F) показывает сэндвич ELISA калибровочные кривые для рекомбинантных белков. Панель (G) показывает "массив ячеек", образованное путем захвата клетки путем связывания с антителами на массиве. Панель (Н) показывает результат обнаружения накладывается с микрокамеры в микрочипе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Решение | Состав олигонуклеотидов | Х-я, В'-II, III-C ' |
| 2 | Х-IV, V-В', Сх-VI |
| 3 | Х-VII, VIII В'-, Сх-IX |
Таблица 1. Состав Решения для 1-3 ДНК Flow паттерна.
| Анкерные последовательности | |
| ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCCTGGAGCTAAGTCCGTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | |
| В | GCCTCATTGAATCATGCCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCCTCATTGAATCATGCCTA- |
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | |
| С | GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GCACTCGTCTACTATCGCTA-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA |
| Преодоление последовательности | |
| Х-я | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGGTCGAGATGTCAGAGTA |
| В'-II | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATGTGAAGTGGCAGTATCTA |
| Сх-III | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATCAGGTAAGGTTCACGGTA |
| Х-IV | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GAGTAGCCTTCCCGAGCATT |
| В'-V | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-ATTGACCAAACTGCGGTGCG |
| Сх-VI | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TGCCCTATTGTTGCGTCGGA |
| Х-VII | TACGGACTTAGCTCCAGGAT-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TCTTCTAGTTGTCGAGCAGG |
| В'-VIII | TAGGCATGATTCAATGAGGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-TAATCTAATTCTGGTCGCGG |
| Сх-IX | TAGCGATAGTAGACGAGTGC-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-GTGATT AAGTCTGCTTCGGC |
| Cy3-сопряженных олигонуклеотиды для проверки | |
| А ' | TACGGACTTAGCTCCAGGAT |
| B " | TAGGCATGATTCAATGAGGC |
| С " | TAGCGATAGTAGACGAGTGC |
| я' | TACTCTGACATCTCGACCAT |
| II ' | TAGATACTGCCACTTCACAT |
| III " | TACCGTGAACCTTACCTGAT |
| IV " | AATGCTGGGGAAGGCTACTC |
| v ' | CGCACCGCAGTTTGGTCAAT |
| VI ' | TCCGACGCAACAATAGGGCA |
| VII ' | CCTGCTCGACAACTAGAAGA |
| VIII " | CCGCGACCAGAATTAGATTA |
| IX ' | GCCGAAGCAGACTTAATCAC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Шаблон потока является первым важным шагом в изготовлении 2-D микрочипов. Для генерации два перекрывающихся образцы ДНК на стеклянную подложку, особенности канале первой конструкции должны быть перпендикулярны к тем второго (фиг.1А-В). Проекты также рассмотреть вниз по течению приложений на микрочипе. В случае анализа клеточной одного года микрочипов используется для обнаружения белков из одиночных клеток, заключенных в микрокамеры, поэтому размеры канала выполнены совместимы с микрокамеры, которые выравнивают с 2-D массивов. Каждая конструкция оказывается на фотошаблон и стандартные методы фотолитографии использованы для изготовления функции каналов в SU-8 на кремниевой пластине (рис 1С-D). Это служит в качестве ведущего для формования PDMS. После пресс-формы была изготовлена, она связана с горкой ФАПЧ покрытием, а затем в сочетании с током азота настройке (рис 1E). Набор-до насИспользование простой и имеет то преимущество, что легко включены в любой лаборатории с источником газообразного азота под давлением регулируемой. Мы используем сборку недорогих нескольких 3-ходовых клапанов, связанных с баком азота. Поток воздуха для структурирования необходимо поддерживать на низких давлениях (0,5-1 PSI), чтобы избежать отслаивания стекло из формы. Утечки в пределах формы PDMS может нарушить целостность шаблонов.
Шаги паттерна потока ДНК в этом протоколе использовать оцДНК с тщательно отобранными ортогональных последовательностей (рис 2А). До течь-паттерна, уникальные последовательности на этих олигонуклеотидов должны быть проверены на отсутствие перекрестных помех. Простой тест для перекрестных помех производится путем изменения процедуры проверки введем в наш протокол (этап 2). Вместо того чтобы использовать коктейль из Cy3-тегами комплементарную ДНК, только один тип комплементарной последовательностью используется одновременно для выбранной области слайда, на котором несколькоПоследовательности ДНК иммобилизуют. При отсутствии ДНК перекрестных помех, только один полоса (для массива 1-D ДНК) или одно место (для массива 2-D ДНК) следует флуоресцентный под Cy3 фильтра. Примеры тщательно проверенных ортогональных последовательностей могут быть найдены в таблице материалов и оборудования. Первый шаг рисунка ДНК представляет три вида «якорных» олигонуклеотидов. Эти 80-NT последовательностей состоит из двух областей 20-мерных поли-которые чередуются с двух уникальных 20-мерных последовательностей. Модификация 5'-амин этих анкерных последовательностей необходимо амина к амин сшивающего 17 с ФАПЧ, опосредованного BS3. Второй этап формирования рисунка ДНК не требует сшивающего агента. Этот шаг представляет "Преодоление" олигонуклеотиды, которые частично гибридизуются с анкерными последовательностей. Каждый 60-нт последовательности перемычки состоит из области 20-мерной дополняют друг якорной последовательности, в 20-мерной поли-A распорки, и уникальной последовательности 20-мерного. Проверка массивов ДНК (Figurе 2B-C), выполняется после каждого ДНК потока узора этапе для оценки качества шагов паттерна и чтобы убедиться в отсутствии перекрестного загрязнения 14. Это выполняется путем введения Cy-3 конъюгированный олигонуклеотидных зондов, которые гибридизуются с узорами ДНК. С параметрами, указанными в пункте (2.3.2) для анализа интенсивности флуоресценции, образцы ДНК должны обладать интенсивности флуоресценции, по меньшей мере 40000 а.е., чтобы максимизировать чувствительность ниже по течению иммуноанализа выполняется с использованием микрочипов. Стратегическое использование разных наборов Cy-3 ДНК в процессе проверки приводит к альтернативных моделей (рис 2D), тем самым демонстрируя гибкость паттерна ДНК шаги 8. Неспособность добиться единых шаблонов могут возникнуть в результате утечки или механических препятствий (например, частиц пыли) встречается в шагах потока паттерна.
Подготовка антитело-олигонуклеотидных конъюгатов АКЦИЯ еще один важный шаг в гоэто протокол. Выбор антител диктуется биологической изучаемой системы. Олигонуклеотиды, используемые в сопряжении должны иметь последовательности, комплементарные тем, которые закреплены в массиве ДНК. Исходные растворы линкерам S-4FB и S-ГНА должна быть свежеприготовленной и держать подальше от влаги, чтобы избежать гидролиза. Время инкубации, используемые в нашем протоколе сопряжения достаточно долго, чтобы ввести желаемые функциональные на антитела и ДНК. Конечный реакцию сочетания только гасили путем удаления непрореагировавших S-4FB-конъюгированные с помощью FPLC олигонуклеотидов. Таким образом, очистка ЖЭХБ должны быть выполнены сразу же после завершения сопряжения. При выполнении FPLC с системой, описанной в нашей протокола, более низких скоростях потока (0,2-0,25 мл / мин) также могут быть использованы, чтобы улучшить качество изображения. Конъюгаты элюируют, как широкого пика (объем элюирования около 9-15 мл), который появляется, прежде чем более узкой и более высокий пик ДНК (17-20 мл объем элюирования). Мы не рекомендуем хранить решенияконъюгатов с избыточным S-4FB-ДНК, поскольку это может привести к потере их антигенсвязывающих сайтов в антителе при конъюгации с избыточным функционализированные ДНК. Чувствительность, специфичность, воспроизводимость и сэндвич ИФА с использованием конъюгатов сделки были продемонстрированы в предыдущих исследованиях. 8,9,11,12,16 Для оценки качества конъюгатов антитело-ДНК, сопряженные можно инкубировать в массивах ДНК, чтобы генерировать Антитело массив, который затем используется в сэндвич-ELISA экспериментов генерировать калибровочные кривые для обнаружения белка (рис 3F). Для получения этих калибровочных кривых, могут быть использованы рекомбинантные белки, представленные в обычном сэндвич ELISA комплекта. Использование высококачественных конъюгатов должно приводить к линейных диапазонов и нижних пределов обнаружения, сопоставимых с комплекта. В качестве примера, нижние пределы для INFγ и TNF, для сэндвич ELISA на массиве антител (рис 3F) являются ~ 50-100 пг / мл, и состоялот с линейной зоне обнаружения ~ 15-1,000 пг / мл, указанной в спецификации продукции для обычного бутерброда ELISA комплекта. Плохо считывания сигнала, полученного в низовьях экспериментов сэндвич ELISA может быть связано с низким качеством массива ДНК, вмешательства избыточного ДНК в сопряженных решений, или, наоборот, неполной сопряжения ssDNAs с антителами.
Основные проблемы для выполнения сэндвич ELISA на антитела включают массива перекрестные помехи между реагентами и является ли сигнал отражает реальные события биологические. Ортогональные ДНК мы используем в этом протоколе были тщательно проверены, чтобы менее 0,1% перекрестных помех. Поэтому любой перекрестные помехи наблюдались на стадии иммуноанализа, в основном, из антитела и ELISA реагентов. Тестирование на перекрестных помех среди антител в массиве должны быть выполнены до проведения анализов на реальных образцах. После того, как панель антитела конструируют, несколько сэндвич контрольные эксперименты ELISA должны быть перфорацияormed при следующих условиях: 1. Без антигенов, антител 2. Без обнаружения и 3. антител обнаружения и маркировки только реагентов. Если перекрестные помехи наблюдается на стадии иммуноанализа, пары антител и / или ELISA реагенты должны быть заменены. Следует отметить, что использование коммерчески доступных антител от обычных наборов ELISA не гарантирует применимость к базе массивов сэндвич ELISA техники.
Заслуги этой технологии включают в себя недорогую производство, миниатюрные размеры и гибкость конструкции. Наш протокол изготовление не требуется микрочипов корректировщик, что не могут быть доступны для многих пользователей массивов антител. Поток рисунка настройки могут быть легко собраны в простые лабораторий. Для лабораторий, которые не оборудованы приборами для фотолитографии, САПР конструкций, которые мы предоставляем в нашем протоколе могут быть направлены компаниям, которые предлагают услуги микротехнологий. Сокращение штатов обычный микрочипов вкомпактный массив изготовлены с нашего протокола обеспечивает совместимость с микрочипов, используемых в одноклеточных экспериментов. Наш протокол имеет производство массива как массив оцДНК, прежде чем преобразования в массиве антител. Предварительный рисунка с ssDNAs имеет ряд преимуществ. Во-первых, ssDNAs химически более стабильны по сравнению с антителами, таким образом оцДНК узором горки можно хранить в эксикаторе в течение по крайней мере 6 месяцев без значительного ухудшения 8,16. Во-вторых, наш подход предлагает конечному пользователю возможность выбрать необходимые анализов, путем простого смешивания селективные конъюгаты вместе в растворе без изменений микрочипа; Напротив, обычные белковые / антитело массивы заранее разработанных и фиксируется на подложке, таким образом, изменение анализов потребует узора / печати протеинов / антител с самого начала. Представительства исследования иллюстрируют использование микрочипов штрих антител в высокой пропускной detectioп нескольких сигнальных белков из отдельных клеток. Изменяя дизайн картина течения и / или решения олигонуклеотид паттерна, используемые, множество макетов массива могут быть изучены. В качестве примера этого приложения, функциональные белки из отдельных клеток могут быть изучены. Чип для анализа одноклеточного охватывает так много, как ~ 8700 микрокамеры, каждый выровнены с полным набором 3 х 3 антитела (рис 3Н). Такой набор вверх позволяет обнаруживать с высокой пропускной. Белков, секретируемых клетками, культивируемыми в микрокамеры могут быть обнаружены с помощью этой матрицы. Универсальная конструкция микрочипов позволяет также мультиплексной детекции белков из сыворотки, лизаты клеток, и отдельных клеток после объединения микрочипов с другими родовых компонентов 8,15. В дополнение к обнаружению белка, массив 3 х 3 антитела также полезно в захвате клеток (рис 3G).
Основным недостатком этого подхода является его дополнительным сбореexity сравнению с производством обычных микрочипов. Стратегии структурирования и дизайна массива должны быть тщательно концептуально при рассмотрении конкретных приложений изготовленного массива. Этот подход также требует ряд важных шагов, включая процедуры проверки и испытаний для перекрестных помех. Массив 3 х 3 построены с использованием наш протокол ограничивается обнаружения 7 белков одновременно. Тем не менее, этот предел может быть превзойден создания крупных массивов. Протокол признакам здесь не ограничивается изготовления 3 х 3 микрочипов. Мы были в состоянии успешно изготовить 5 х 5 микрочипов и другие размеры элементов массива. В принципе, другие м массивы н х могут быть изготовлены с использованием методов, аналогичных тех пор, пока олигонуклеотидные наборы, используемые в создании предварительного массив ДНК узором ортогональны, чтобы избежать перекрестных помех между элементами массива. Создание расширенных массивов достигается потока patterniнг н типы одноцепочечной ДНК на якорь для первой стадии узора ДНК, с последующим н х м мостиковому последовательности оцДНК для второго этапа структуризации. Например, чтобы создать массив 5 х 5, якорь последовательности от А до Е может быть использован, в то время как последовательности мостиковых Х-я E'-XXV используются. Для автоматизации процесса паттерна потока, робототехники платформа была разработана 18, хотя это только используется одно ДНК поток паттерна шаг. В принципе, таким же платформа может быть распространен на втором этапе, перпендикулярной паттерна потока, в то время как переключение между двумя шагами может потребовать ручного отслаивания первого PDMS формы после первой стадии узора, с последующей промывкой и сушкой слайде (этот шаг будет принять около 10 мин), перед спариванием слайд с другой PDMS формы для облегчения ориентированы перпендикулярно второй шаг паттерна.
Мы обсудили подробные процедуры для изготовления массив NxM рисункомс антителами в высокой плотности, которая держит большое обещание для будущих применений в протеомных исследований и клеточной сигнализации. Протокол, представленные здесь, могут также служить в качестве руководства для строительства более сложные массивы ДНК / антител для других целей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see Table 2. | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter) | Ted Pella, Inc. | 15110-10 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
