Summary
इस प्रोटोकॉल माउस preimplantation भ्रूण में वंश विनिर्देश अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के सीटू विश्लेषण में मात्रात्मक, एकल कोशिका प्रदर्शन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। ब्लास्टोसिस्ट के संग्रह के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं, पूरे माउंट प्रोटीन के immunofluorescent का पता लगाने, एक confocal खुर्दबीन और परमाणु विभाजन और छवि विश्लेषण पर नमूनों की इमेजिंग वर्णित हैं।
Abstract
इस प्रोटोकॉल एक विधि मात्रात्मक प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत करता है, बगल में एकल कोशिका वंश विनिर्देश अध्ययन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करती है माउस preimplantation भ्रूण में। भ्रूण संग्रह, immunofluorescence, एक confocal खुर्दबीन पर इमेजिंग, और छवि विभाजन और विश्लेषण के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं वर्णित हैं। इस विधि के कई परमाणु मार्करों की अभिव्यक्ति और स्थानिक (xyz) के quantitation भ्रूण में सभी कोशिकाओं के निर्देशांक की अनुमति देता है। यह मिनट, विशेष रूप से preimplantation भ्रूण और भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) कालोनियों के confocal छवियों के विश्लेषण के लिए विकसित की एक छवि विभाजन सॉफ्टवेयर उपकरण का लाभ लेता है। मिनट एक्स, वाई और जेड आयाम भर में पूछना परमाणु विभाजन किया जाता है, और कम से कम उपयोगकर्ता इनपुट के साथ सभी चैनलों के लिए तीन आयामी अंतरिक्ष में सेल की स्थिति के बारे में जानकारी, साथ ही परमाणु प्रतिदीप्ति स्तरों पैदा करता है। इस प्रोटोकॉल छवियों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया गया है जबकिpreimplantation चरण माउस भ्रूण की, यह आसानी से एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात और जहां उच्च परमाणु घनत्व (भ्रूणीय स्टेम सेल की अभिव्यक्ति विश्लेषण छवि विभाजन के लिए एक बाधा बन गया है जैसे।, प्रदर्शन किसी अन्य नमूनों के विश्लेषण (ईएससी के लिए अनुकूलित किया जा सकता ) कालोनियों संस्कृति में कोशिकाओं, अन्य प्रजातियों या चरणों, आदि) के भ्रूण का फर्क।
Introduction
माउस preimplantation भ्रूण सेल भाग्य विनिर्देश और स्तनधारियों में नए सिरे से epithelialization के अध्ययन के लिए उद्भव और इन विवो में pluripotency के रखरखाव, साथ ही एक मॉडल का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिमान है। और दो extraembryonic प्रजातियों, ट्रोफेक्टोडर्म (ते) और - जो सबसे दैहिक ऊतकों और जनन कोशिकाओं को जन्म देता है - स्तनधारी विकास की preimplantation चरणों तीन सेल प्रजातियों कि ब्लास्टोसिस्ट, अर्थात् pluripotent आद्यबहिर्जनस्तर बनाने की स्थापना के लिए समर्पित कर रहे हैं आदिम endoderm (पूर्व) (चित्रा 1 ए) 1,2। इस प्रोटोकॉल (1) फसल और ठीक preimplantation चरण माउस भ्रूण के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, (2) immunofluorescence प्रदर्शन हित के प्रोटीन लेबल करने के लिए, (3) पूरे माउंट बाहर ले जाने के जेड सेक्शनिंग क्षमताओं और के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग इमेजिंग (4) confocal छवियों और बाद में मात्रात्मक छवि का विश्लेषण के परमाणु विभाजन प्रदर्शन करते हैं। इस पाइपलाइन टी की अनुमति देता हैवह सेल पहचान के काम में सीटू कोशिकाओं के उप-जनसंख्या को चिह्नित करने के लिए प्रोटीन के स्तर की माप निष्पक्ष। 4 दिन एक भी कूड़े (आम तौर पर 10 माउस भ्रूण तक) के लिए, भ्रूण संग्रह से डेटा विश्लेषण (चित्रा 1 बी) के लिए - इस प्रोटोकॉल बाहर के रूप में छोटे रूप में 3 में किया जा सकता है। कई litters के एक साथ विश्लेषण और इमेजिंग डेटा विश्लेषण समय का बोझ बढ़ जाएगा, इस प्रकार प्रोटोकॉल की कुल लंबाई का विस्तार।
Preimplantation चरण माउस भ्रूण एक प्रयोगात्मक विनयशील प्रणाली है जो, अपने छोटे आकार और आकृति विज्ञान टकसाली 3 दी, अच्छी तरह से एकल कोशिका संकल्प के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं की पूर्ण इमेजिंग में के लिए अनुकूल है। एक निष्पक्ष, सिस्टम-स्तर भ्रूण की एक सांख्यिकीय प्रासंगिक संख्या के विश्लेषण से बाहर ले जाने के लिए, एक स्वचालित, मात्रात्मक विश्लेषण पाइपलाइन वांछनीय है। हालांकि, आंतरिक कोशिका द्रव्यमान का उच्च घनत्व परमाणु ब्लास्टोसिस्ट की (आईसीएम) की वजह से (
विश्लेषण यहाँ प्रस्तुत पाइपलाइन MATLAB आधारित छवि विभाजन उपकरण मॉड्यूलर इंटरएक्टिव परमाणु विभाजन (मिनट) 4 के आसपास घूमती है। मिनट पीconfocal जेड के ढेर के बड़े समूहों पर पूछना परमाणु विभाजन erforms के बाद उपयोगकर्ता, छवि गुण की एक न्यूनतम संख्या की स्थापना की है एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) (तालिका 1) 4 का उपयोग कर। इस पाइपलाइन प्रोटीन अभिव्यक्ति और दोनों जंगली प्रकार में सेल स्थानीयकरण पर उच्च throughput डेटा की पीढ़ी के लिए कुशल साबित कर दी है, प्रयोगात्मक इलाज किया और आनुवंशिक रूप से संशोधित भ्रूण और ESCs 5-7। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम preimplantation चरण भ्रूण छवियों के विभाजन मिनट के आवेदन का वर्णन है। ESCs पर मिनट प्रदर्शन के उदाहरण के लिए 4,7 देखें। स्वचालित परमाणु विभाजन कदम काफी, सेल पहचान की प्रक्रिया के समय बोझ कम कर देता है, जबकि स्थानिक और प्रतिदीप्ति तीव्रता माप भ्रूण में सेल पहचान के लिए एक निष्पक्ष दृढ़ संकल्प और जीन अभिव्यक्ति डोमेन और सेल की स्थिति के तीन आयामी नक्शे की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं (चित्रा 1C 5,6 के भ्रूण की बड़ी साथियों के माध्यम से अलग-अलग litters के विश्लेषण के लिए लागू करता है। मिनट (सॉफ्टवेयर एक MATLAB लाइसेंस की आवश्यकता है) http://katlab-tools.org पर आसानी से उपलब्ध है।
कोई दृष्टिकोण की तारीख करने के लिए विकसित प्रोटीन अभिव्यक्ति और माउस preimplantation भ्रूण में सेल स्थानीयकरण पर ऐसे में गहराई से डेटा की पीढ़ी की अनुमति देता है। सभी प्रयास इस प्रकार अब तक के आंकड़ों के इन प्रकार बढ़ाता पर भ्रूण में मैनुअल दृढ़ संकल्प और विभिन्न आबादी के लिए सेल नंबर के quantitation (या तो पूरी तरह से मैन्युअल, या सॉफ्टवेयर की मदद से) 9-19 के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। यह दृष्टिकोण (मिनट सॉफ्टवेयर को शामिल) के लिए रुझान और माउस preimplantation भ्रूण और ESCs पर परीक्षण किया गया है; फिर भी, उच्च घनत्व के साथ परमाणु अन्य प्रणालियों पर अपने प्रदर्शन हालांकि अभी तक अपरीक्षित, बराबर होने की उम्मीद है।
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Protocol
आचार कथन: सभी जानवर काम, पशुपालन, प्रजनन और बलिदान सहित मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC), प्रोटोकॉल # 03-12-017 द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. भ्रूण संग्रह
नोट: सभी जानवर काम करना चाहिए संस्थागत और स्थानीय अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है और स्थानीय और संस्थागत नियमों के अनुरूप।
- वांछित जीनोटाइप के एक उपजाऊ संवर्धन पुरुष के साथ एक कुंवारी महिला माउस दोस्त।
नोट: प्राकृतिक matings की स्थापना, estral चक्र के मद चरण में महिलाओं का चयन वांछित तिथि पर शयन की संभावना बढ़ जाती है। अगर superovulation उत्प्रेरण, 20 में वर्णित प्रोटोकॉल को देखें। - एक कुंद जांच का उपयोग सुबह में एक योनि प्लग की उपस्थिति की जाँच करें। आदर्श रूप में, दोपहर (12:00 बजे) से पहले इस कर के रूप में शयन प्लग दिन भर में खो रहे हैं। Noo पर विचारयोनि प्लग भ्रूण दिन (ई) 0.5 का पता लगाने के एन।
- वांछित दिन और भ्रूण के विकास के समय पर, M2 या निस्तब्धता पकड़े मध्यम (FHM) आर टी करने के लिए या, अधिमानतः 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म। नोट: या तो M2 या FHM निस्तब्धता और हैंडलिंग भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जब उपयोग में नहीं, 4 डिग्री सेल्सियस पर इन मीडिया की दुकान। प्रत्येक गर्भाशय के लिए माध्यम की ~ 2 मिलीलीटर के उपयोग का अनुमान है।
- पिघलना जमे हुए 4% paraformaldehyde (पीएफए) फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या में कुछ ताजा समाधान तैयार है। एक 4 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 4% पीएफए समाधान के 500 μl का अनुमान है। एक 4 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं पर एक कूड़े को ठीक करें। नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 96 अच्छी तरह से थाली को ठीक करने और दुकान भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग करते हैं, अच्छी तरह से प्रति पीएफए समाधान के 100 μl का उपयोग करें।
- एक खुला लौ का उपयोग कर नोक पर एक केशिका अंत आकर्षित करने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक खींचो।
- ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 साँस लेना द्वारा महिला बलिदान, या के रूप में स्थानीय और संस्थागत नियमों द्वारा अपेक्षित। यह अक्सर desirabl हैई ग्रीवा अव्यवस्था से जानवर की इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
- 70% इथेनॉल के साथ पशु के पेट स्प्रे बाल बहा को कम करने और एक पेट चीरा, त्वचा के माध्यम से पहले और बाद में शरीर की दीवार (पेरिटोनियम) के माध्यम से विसरा को बेनकाब करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए।
नोट: निम्न चरणों के E3.25 और E4.5 (चित्रा 1 ए) के बीच किसी भी स्तर पर एक गर्भवती महिला के गर्भाशय से माउस blastocysts इकट्ठा करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन। E3.25 पहले की तुलना में preimplantation भ्रूण के संग्रह पर प्रोटोकॉल के लिए, 20 को देखें। - गर्भाशय का पता लगाएँ और जानवर से हटा दें। संदंश की एक जोड़ी के साथ गर्भाशय की ग्रीवा अंत होल्डिंग, गर्भाशय ग्रीवा के माध्यम से कटौती और धीरे दोनों गर्भाशय सींग फैलाने के लिए अपने आप को रोकना।
- गर्भाशय से वसा ट्रिम, देखभाल करने के गर्भाशय की दीवार बेध नहीं। यह हटाने के समय में आसानी से किया जा सकता है, जबकि अभी भी जानवर के शरीर से जुड़ा है, के रूप में गर्भाशय बाहर बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यहबाद में किया जा सकता है, एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे, आरटी पीबीएस में। गर्भाशय के विच्छेदन पर एक अधिक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, देखें प्रोटोकॉल 5 और 8 से 20
- oviducts ऊपर कट, अंडाशय के नीचे, एक पेट्री डिश पर पूरे गर्भाशय, जगह जारी है और पीबीएस के साथ कवर करने के लिए।
नोट: यह कदम भी गर्भाशय, जो बाद ब्लास्टोसिस्ट कटाई की सुविधा से अतिरिक्त रक्त या अन्य मलबे की धुलाई की अनुमति देता है। - गर्भाशय ग्रीवा के दोनों किनारों पर समीपस्थ अंत के माध्यम से काटने, और गर्भाशय ग्रीवा त्यागने से अलग दोनों गर्भाशय सींग। Isthmus है कि उन्हें (चित्रा 1 ए) से जोड़ता नीचे काटने से गर्भाशय से प्रत्येक डिंबवाहिनी अलग करें। भ्रूण संग्रह और हेरफेर के लिए जोड़-तोड़ मध्यम (या तो M2 या FHM) की एक बूंद के लिए दोनों सींग स्थानांतरण।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, गर्भाशय के बाहर और 0.5 मजबूर द्वारा माध्यम में फ्लश ब्लास्टोसिस्ट्स - ग्रीवा खोलने से प्रत्येक गर्भाशय सींग के माध्यम से M2 या FHM के 1 मिलीलीटर। एक 1 का प्रयोग करेंएक hypodermal सुई के साथ मिलीलीटर सिरिंज। ध्यान दें: हालांकि यह महत्वपूर्ण नहीं है सुई, एक फाइलिंग पत्थर का उपयोग ग्रीवा फाड़ से बचने के लिए पा लिया जा सकता है। गर्भाशय निस्तब्धता के लिए विस्तृत चित्र 21 में पाया जा सकता है।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ब्लास्टोसिस्ट, जो मध्यम की बूंद भर में बिखर जाएगा पता लगाने। ब्लास्टोसिस्ट्स निस्तब्धता के बाद डिश के नीचे सिंक करने के लिए 2 मिनट - अप करने के लिए 1 की अनुमति दें। एक केशिका अंत के साथ मुंह नियंत्रित, कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, सभी blastocysts इकट्ठा करने और मीडिया के एक ताजा बूंद के लिए स्थानांतरण।
- ताजा M2 या FHM के 3 बूँदें - 2 के माध्यम से उन्हें ले जाकर ब्लास्टोसिस्ट्स कुल्ला। एक समय में 10 ब्लास्टोसिस्ट्स - 5 के समूह में भ्रूण ले जाएँ।
नोट: किसी भी एक समय प्रक्रिया को गति देगा में बड़े समूहों चल रहा है, लेकिन यह भी गलती से कई भ्रूण खोने की संभावना में वृद्धि होगी। अगर मुंह नियंत्रित pipettes के उपयोग में अप्रशिक्षित, भ्रूण में गड़बड़ी और हस्तांतरण का अभ्यास ख से पहले विचार किया जाना चाहिएप्रयोग eginning। - संक्षेप में उन्हें अम्लीय Tyrode समाधान में धोने से unhatched blastocysts से zona pellucida (जिला परिषद) (आम तौर पर <E4.0) निकालें। जैसे ही जिला परिषद अब कोई दिखाई दे रहा है, के रूप में हेरफेर मीडिया को वापस ब्लास्टोसिस्ट्स हस्तांतरण। केवल एसिड Tyrode में भ्रूण रखने के रूप में लंबे समय के रूप में के लिए सख्ती जरूरी है, क्रम में कोशिकाओं को नुकसान को रोकने के लिए।
- जब denuded blastocysts से निपटने ख्याल रखना है, के रूप में वे करने के लिए कांच और प्लास्टिक की सतहों बहुत आसानी से पालन करें। हेरफेर मध्यम गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) लगाव को रोकने के लिए की 4 मिलीग्राम / एमएल होते हैं, लेकिन एसिड Tyrode या पीबीएस ऐसा नहीं है, इसलिए, क्षति या भ्रूण के नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए अधिक से अधिक 2 लेने नहीं है - 5 denuded ब्लास्टोसिस्ट्स ऐसे समय में जब उन्हें बीएसए मुक्त या सीरम मुक्त पीबीएस या एसिड Tyrode की जोड़ तोड़ में।
नोट: वैकल्पिक रूप से, कोट उपयोग करने से पहले 1% बीएसए के साथ कांच पिपेट कांच की सतह को भ्रूण के पालन को कम करने के लिए।
- जब denuded blastocysts से निपटने ख्याल रखना है, के रूप में वे करने के लिए कांच और प्लास्टिक की सतहों बहुत आसानी से पालन करें। हेरफेर मध्यम गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) लगाव को रोकने के लिए की 4 मिलीग्राम / एमएल होते हैं, लेकिन एसिड Tyrode या पीबीएस ऐसा नहीं है, इसलिए, क्षति या भ्रूण के नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए अधिक से अधिक 2 लेने नहीं है - 5 denuded ब्लास्टोसिस्ट्स ऐसे समय में जब उन्हें बीएसए मुक्त या सीरम मुक्त पीबीएस या एसिड Tyrode की जोड़ तोड़ में।
- कोट प्रत्येक के नीचे अच्छी तरह से1% अगर की एक पतली परत के साथ एक 4 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान की, 0.9% सोडियम क्लोराइड प्लास्टिक का पालन करने से भ्रूण को रोकने के लिए। वैकल्पिक रूप से, 4 मिलीग्राम / पीबीएस (पीबीएस बीएसए) को बीएसए की मिलीलीटर जोड़ें।
- आरटी पीबीएस (या पीबीएस बीएसए) के 500 μl के साथ लेपित 4 अच्छी तरह से टिशू कल्चर पकवान की एक अच्छी तरह से और पीबीएस में 4% पीएफए की एक और अच्छी तरह से 500 μl भरें।
- आरटी पीबीएस में blastocysts कुल्ला और आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पीएफए में तय कर लो। निर्धारण के बाद पीबीएस (या पीबीएस बीएसए) पर स्थानांतरण।
- भ्रूण तुरंत कार्रवाई की जा करने के लिए नहीं जा रहे हैं, पीबीएस खनिज तेल की एक परत के साथ भ्रूण युक्त (नमूना के सुखाना के लिए अग्रणी) वाष्पीकरण को रोकने और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट स्टोर करने के लिए कवर।
नोट: विभिन्न निर्धारण के तरीकों और कई बार प्रयोग के आधार पर किया जा सकता है, ब्याज की epitopes और एंटीबॉडी इस्तेमाल किया जाएगा। जो भी पसंद की विधि, भर बराबर प्रयोगों के परिणाम के बाद धुंधला तुलना की सुविधा के लिए लगातार हो।
नोट: रोकेंबिंदु: भ्रूण अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कई सप्ताह तक के लिए पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। सुनिश्चित करें पीबीएस बाँझ है और / या 100 यू / मिलीलीटर जोड़ने पेनिसिलीन + 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (कलम strep) यदि लंबे समय तक भंडारण की आशंका (खासकर जब पीबीएस बीएसए का उपयोग) जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए।
2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- किसी भी प्रोटोकॉल है कि पहले परीक्षण किया गया है और पूरे माउंट immunofluorescence के लिए मजबूत साबित हो immunofluorescence का उपयोग कर प्रदर्शन करना। नोट: हम 22 और 11 में वर्णित उन सलाह देते हैं। वर्तमान लेख में पूर्व वर्णित किया जाएगा। जो भी पसंद की विधि, भर बराबर प्रयोगों धुंधला परिणामों की तुलना की सुविधा के लिए लगातार हो।
- इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के अनुक्रमिक चरणों को बाहर ले जाने के लिए एक लचीला, polyvinyl, स्पष्ट, यू-नीचे 96 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग करें। 50 के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक को भरने - समाधान के 100 μl और एक समाधान के लिए कदम से भ्रूणएक एल के आकार का मुंह पिपेट का उपयोग करने के लिए एक और। नोट: इस दृष्टिकोण अभिकर्मकों के उपयोग को कम करता है और कदम पर नज़र रखने के साथ ही कई प्रयोगात्मक समूहों के समानांतर धुंधला की सुविधा।
- वैकल्पिक: कोट 1% अगर की एक पतली परत के साथ कुओं के नीचे, 0.9% सोडियम क्लोराइड प्लास्टिक को भ्रूण के आसंजन को रोकने के लिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस समाधान करने के लिए बीएसए न जोड़ें।
- पीबीएक्स (पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100) तैयार करें। कई immunofluorescence प्रयोगों के प्रदर्शन की आशंका है, तो प्रयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएक्स और दुकान की 50 मिलीलीटर तैयार करते हैं।
- permeabilization समाधान (0.5% ट्राइटन X-100, पीबीएस में 100 मिमी ग्लाइसिन) तैयार करें। 1 मिलीलीटर (या जो भी राशि आवश्यक) एक प्रयोग के लिए ताजा permeabilization समाधान के बनाओ।
- अवरुद्ध समाधान (2% घोड़े सीरम (एचएस) या 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (पीबीएस में कलम strep साथ एफबीएस)) तैयार करें। प्रयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर और दुकान तैयार करें।
- कोई मतभेद के बीच मनाया गया है या तोसीरम के प्रकार, हालांकि, बराबर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल अवरुद्ध समाधान के चुनाव में लगातार हो।
- पीबीएक्स में आरटी पर 5 मिनट (~ 100 μl) के लिए तय भ्रूण कुल्ला।
- permeabilization समाधान में आरटी पर 5 मिनट (~ 100 μl) के लिए भ्रूण Permeabilize।
- पीबीएक्स में आरटी पर 5 मिनट (~ 100 μl) के लिए भ्रूण कुल्ला।
- 30 मिनट 1 आरटी पर मानव संसाधन के लिए ब्लॉक भ्रूण अवरुद्ध समाधान के ~ 100 μl में। खनिज तेल की एक परत के वाष्पीकरण को रोकने या एक humidified कक्ष में रखने के लिए समाधान के साथ कवर।
नोट: भ्रूण के लिए हे ऊपर / उल्लेखनीय सुधार या हानि के बिना 4 डिग्री सेल्सियस पर एन अवधि जब 30 मिनट अवरुद्ध कदम की तुलना में अवरुद्ध किया जा सकता है। - भ्रूण हे / एन सेते प्राथमिक एंटीबॉडी में 4 डिग्री सेल्सियस पर / एंटीबॉडी समाधान (~ 100 μl) अवरुद्ध में पतला। खनिज तेल की एक परत के वाष्पीकरण को रोकने या एक humidified कक्ष में रखने के लिए समाधान के साथ कवर।
- प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम पहले से कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैं। देखें घएंटीबॉडी के एक नंबर का परीक्षण किया dilutions के लिए iscussion और सामग्री अनुभाग।
- हे / एन ऊष्मायन के बाद कुल्ला भ्रूण पीबीएक्स में आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक (~ 100 μl) के लिए 3x।
- 30 मिनट 1 आरटी पर मानव संसाधन के लिए ब्लॉक भ्रूण अवरुद्ध समाधान के ~ 100 μl में। खनिज तेल की एक परत के वाष्पीकरण को रोकने या एक humidified कक्ष में रखने के लिए समाधान के साथ कवर।
- अवरुद्ध समाधान के ~ 100 μl में 4 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में पतला एंटीबॉडी / एंटीबॉडी में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 घंटा के लिए भ्रूण सेते हैं। खनिज तेल की एक परत के वाष्पीकरण को रोकने या एक humidified कक्ष में रखने के लिए समाधान के साथ कवर।
- भ्रूण कुल्ला पीबीएक्स में आरटी पर प्रत्येक 5 मिनट के लिए 2x।
- प्राथमिकता दी डीएनए दाग को भ्रूण ले जाएँ। Hoechst 33342 का उपयोग करते हैं, 5 माइक्रोग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर पतला। खनिज तेल की एक परत के वाष्पीकरण को रोकने या एक humidified कक्ष में रखने के लिए समाधान के साथ कवर।
नोट: रोकें बिंदु: भ्रूण तुरंत imaged नहीं किया जा रहा है, वे यू के लिए रखा जा सकता हैपरमाणु धुंधला समाधान में कई हफ्तों के लिए पी। इस मामले में, यह सुनिश्चित पीबीएस बाँझ है और / या बैक्टीरिया विकास और प्रदूषण को रोकने के लिए कलम strep या सोडियम azide जोड़ें।
3. Confocal इमेजिंग
नोट: व्यक्तिगत confocal खुर्दबीन विन्यास प्रणाली और जगह में सॉफ्टवेयर के लिए समायोजित करने की विशिष्ट अधिग्रहण पैरामीटर की आवश्यकता होगी। हालांकि, निम्नलिखित खंड का पालन करने के लिए है कि किसी भी स्थापना करने के लिए लागू किया जाना चाहिए सामान्य नियमों का एक सेट प्रदान करता है।
- ठीक एक मुँह पिपेट का उपयोग करना, पीबीएस या एक 35 मिमी गिलास नीचे पकवान की कांच की सतह पर परमाणु दाग समाधान के microdrops बनाने के लिए और खनिज तेल के साथ कवर किया। एक विकल्प के रूप में, सिलिकॉन विभाजक के साथ एक नियमित coverslip का उपयोग भ्रूण को नुकसान पहुँचाए से बचने और एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड के साथ कवर करने के लिए। नोट: एक नियमित रूप से coverslip का उपयोग करते हैं, भ्रूण नहीं कर सकते बाद में फिर से तैनात या जीनोटाइपिंग के लिए बरामद किया है, इसलिए हम दृढ़ता से गिलास नीचे के इस्तेमाल की सिफारिशव्यंजन।
- microdrops में रखें भ्रूण और बेहतर करने के लिए कांच की सतह आईसीएम गुहा धुरी के समानांतर के साथ एक सुसंगत तरीके से व्यवस्था। माइक्रोस्कोप धारक पर डिश सेट करें। नोट: लेजर स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी पर प्राप्त छवियों प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक जेड अक्ष जुड़े नुकसान से पीड़ित हैं। इसलिए, व्यवस्था में स्थिरता अलग भ्रूण पर बराबर क्षेत्रों के बीच तीव्रता की तुलना के लिए महत्वपूर्ण है।
- जंगली प्रकार भ्रूण है कि उपचार के किसी भी प्रकार है कि जीन अभिव्यक्ति को बदल सकता है के अधीन नहीं किया गया संदर्भ का उपयोग कर मानकों को निर्धारित करें।
- आदेश में डेटा है कि सही विभाजन मिनट उपकरण 4 का उपयोग की सुविधा होगी प्राप्त करने के लिए एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (यानी, 40X या अधिक) का उपयोग कर छवियों मोल।
नोट: एक 20x उद्देश्य पर डिजिटल जूम का प्रयोग मिनट का उपयोग कर विभाजन के लिए पर्याप्त संकल्प की छवियों को नहीं निकलेगा। एक भी उद्देश्य के काम दूरी (DD) को ध्यान देना चाहिए, जैसा कि होना चाहिएएक जेड ढेर है कि एक पूरे ब्लास्टोसिस्ट तक फैला है, इस प्रकार एक लंबे डब्लू डी के अधिग्रहण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त (~ 130-150 माइक्रोन) उद्देश्य आम तौर पर आवश्यक है। आंकड़े 2 में दिखाया छवियों - 4 210 माइक्रोन की दूरी काम के साथ एक 40X / NA 1.30 तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर हासिल किया गया। - सबसे कम लेजर उत्पादन है कि fluorophores विरंजन के बिना एक मजबूत संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करता है का प्रयोग करें।
- लाभ को समायोजित और नमूना overexposing बिना व्यापक गतिशील रेंज प्राप्त करने के लिए ऑफसेट। छवियों को उजागर करने का सबसे को कवर, या अवधि पूरी, ग्रे स्केल रेंज छवियों के बीच तीव्रता में छोटे मतभेदों का पता लगाने की सुविधा होगी।
- एक छोटी सी (1 माइक्रोन) z कदम का प्रयोग करें, क्योंकि जेड अक्ष संकल्प मिनट के साथ सटीक विभाजन के लिए महत्वपूर्ण है।
नोट: XY आयाम परमाणु विखंडन प्रक्रिया, केवल छवि फ़ाइल आकार को प्रभावित नहीं करते। आम तौर पर, 512 x 512 पिक्सल compromi बिना प्रकाशन गुणवत्ता छवियों के लिए एक पर्याप्त XY संकल्पहार्ड ड्राइव अंतरिक्ष गाते हैं। - महत्वपूर्ण कदम: के रूप में तो नमूनों की तुलना में सक्षम होना करने के लिए इमेजिंग के भीतर और एक ही प्रयोग की इमेजिंग सत्र में लगातार मानकों को रखें।
- आदेश में डेटा है कि सही विभाजन मिनट उपकरण 4 का उपयोग की सुविधा होगी प्राप्त करने के लिए एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (यानी, 40X या अधिक) का उपयोग कर छवियों मोल।
- भ्रूण के बैच इमेजिंग:
- एक ही सत्र में छवि सुसंगत समूह (litters, प्रयोगों) जब भी संभव है।
- एक ही प्रयोग की प्रतिकृति के लिए भीतर और इमेजिंग सत्र में लगातार मानकों को रखें।
- पूरे (पूरे जेड अक्ष) छवि भ्रूण हर कोशिका पर कब्जा करने के लिए।
नोट: अगर वांछित, भ्रूण जीनोटाइपिंग 23 में वर्णित के रूप में इमेजिंग के बाद किया जा सकता है। नेस्टेड पीसीआर के लिए जरूरत के अनुभव से निर्धारित किया जाना है और ठिकाना विश्लेषण किया जाना और इस्तेमाल प्राइमरों पर निर्भर करेगा।
- पूर्वव्यापी छवियों भ्रूण मैच में सक्षम होना करने के लिए सुनिश्चित करें।
4. छवि विश्लेषण और डेटा पूर्व प्रसंस्करण
- डाउनलोड और http से 4 मिनट स्थापित: // कतलाb-tools.org (MATLAB लाइसेंस की आवश्यकता)।
- छवि विभाजन प्रदर्शन:
- एक confocal छवि लोड या हार्ड ड्राइव से हो चुकी है, नाभिक और खंड की छवि का पता लगाने के मिनट के ग्राफिक यूजर इंटरफेस (जीयूआई) का पालन करें। लोड माइक्रोस्कोप (.lsm, .lif, .oif, आदि) द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा की पूरी जेड हो चुकी है। और हर कदम पर जानकारी के निर्देश http://katlab-tools.org और 4 पर पाया के लिए 2 टेबल देखें। एक बार जब पूरा, इसी 'देखें' बटन पर क्लिक करके प्रत्येक चरण के परिणाम देख सकते हैं। बटन के ऊपर पीले रंग टैग प्रक्रिया में ऑपरेशन इंगित करता है, एक हरे रंग की टैग कार्रवाई पूर्ण इंगित करता है।
नोट: मिनट वर्तमान में .czi फ़ाइलों का समर्थन नहीं करता है, दृश्यों या बहु स्थिति फ़ाइलों झगड़ा - प्रत्येक Z ढेर एक स्वतंत्र फ़ाइल की जरूरत है। - संतोषजनक विभाजन के बाद, बनाया तो यह अन्य भ्रूण या litters के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता पाइपलाइन बचाने के लिए।
- एक confocal छवि लोड या हार्ड ड्राइव से हो चुकी है, नाभिक और खंड की छवि का पता लगाने के मिनट के ग्राफिक यूजर इंटरफेस (जीयूआई) का पालन करें। लोड माइक्रोस्कोप (.lsm, .lif, .oif, आदि) द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा की पूरी जेड हो चुकी है। और हर कदम पर जानकारी के निर्देश http://katlab-tools.org और 4 पर पाया के लिए 2 टेबल देखें। एक बार जब पूरा, इसी 'देखें' बटन पर क्लिक करके प्रत्येक चरण के परिणाम देख सकते हैं। बटन के ऊपर पीले रंग टैग प्रक्रिया में ऑपरेशन इंगित करता है, एक हरे रंग की टैग कार्रवाई पूर्ण इंगित करता है।
- बैच मोड विभाजन:
नोट: Single फ़ाइलों को व्यक्तिगत रूप से खंडित किया जा सकता है। हालांकि, यह देखते हुए कि एक कूड़े या प्रयोग के भीतर भ्रूण तुलनीय चरण के आम तौर पर कर रहे हैं, मिनट पर्यवेक्षण के बिना उनमें से एक समूह के लिए एक एकल छवि के लिए बनाया विभाजन पाइप लाइन आवेदन कर सकते हैं।- बैच मोड में चलाने के मेनू से, क्लिक करें 'फ़ाइलें जोड़ें' और लोड सभी फाइलों को एक बार में कार्रवाई की जा सके। नोट: विभिन्न स्रोतों से फ़ाइलें विभाजन कतार में शामिल किया जा सकता है।
- 'शुरू बैच मोड रन' और सॉफ्टवेयर फाइलों पर कार्रवाई करने के लिए समय की अनुमति पर क्लिक करें। नोट: विभाजन उत्पादन में एक ही निर्देशिका जहां मूल फाइल जहां स्थित में बचाया जाएगा।
- विभाजन आकलन और मैनुअल सुधार
नोट: मिनट खंडों बहुत ही उच्च सटीकता (> 85%) के साथ छवियों, तथापि, धुंधला और इमेजिंग की गुणवत्ता, साथ ही भ्रूण के मंच, मिनट के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है। आम तौर पर, भ्रूण के भीतर उच्च परमाणु घनत्व, अधिक संभावना है कि विभाजन त्रुटियों Plac लगेगाई (आंकड़े 2 डी, 3)। इस प्रकार, विभाजन सटीकता प्रत्येक नमूना के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए और यदि आवश्यक हो मैन्युअल सही। त्रुटियों के दो प्रकार के आम तौर पर पाए जाते हैं: अति-विभाजन और विभाजन के तहत।- अति-विभाजन का हल
- झूठी सकारात्मक पहचानें - apoptotic पुटिकाओं (चित्रा 3 ए ए, बी, डी, तारक) या अन्य तत्वों है कि अक्षुण्ण नाभिक नहीं हैं, लेकिन जो मिनट से इस तरह के रूप में पहचान की गई है हो सकता है।
नोट: आम तौर पर इस तरह की झूठी सकारात्मक वास्तविक नाभिक से एक छोटे आकार की है और, मामलों के बहुमत में है, आसानी से पहचान की है और स्प्रेडशीट पर हल किया जा सकता है। हालांकि, दृश्य परीक्षा पुरजोर सिफारिश की है, के रूप में बार बार नाभिक केवल आंशिक रूप से खंडित किया जा सकता है एक छोटे, लेकिन वैध खंडों मात्रा (चित्रा 3 ए बी, नोक) में जिसके परिणामस्वरूप। - * Statistics.csv फ़ाइल से झूठी सकारात्मक के लिए इसी रिकॉर्ड को हटाएँ। रक्षित मूल * आँकड़े.csv भविष्य में संदर्भ और संपादित केवल इसकी एक प्रति के लिए फ़ाइल।
- एक नाभिक से अधिक खंडों और 2 या अधिक नाभिक (चित्रा 3 ए सी, तीर और तीर) के रूप में प्रस्तुत किया है, या तो, उनकी तीव्रता के स्तर के औसत से रिकॉर्ड विलय या, इसी तरह की है कि अगर सेल के लिए रिकॉर्ड में से एक रखने के लिए और त्यागने किया गया है आराम।
- झूठी सकारात्मक पहचानें - apoptotic पुटिकाओं (चित्रा 3 ए ए, बी, डी, तारक) या अन्य तत्वों है कि अक्षुण्ण नाभिक नहीं हैं, लेकिन जो मिनट से इस तरह के रूप में पहचान की गई है हो सकता है।
- अंडर विभाजन का हल
- जहां मिनट दो या अधिक नाभिक के बीच सीमा का पता लगाने में नाकाम रही है और इसके परिणामस्वरूप उन्हें एक ही नाभिक के रूप में खंडित घटनाओं की पहचान (चित्रा 3 ए डी तीर और 3 बी)। नोट: यह एक सटीक सेल गिनती के लिए एक समस्या बन गया है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रोटीन का स्तर बढ़ाता के लिए के रूप में स्तरों मापा कोशिकाओं है कि ग़लती से विलय कर दिया गया है की औसत हो जाएगा, और जो विभिन्न प्रजातियों के लिए संबंधित हो सकता है।
- जहां मिनट एक नाभिक को पूरी तरह से पता लगाने में नाकाम रही है घटनाओं को पहचानें।
- इन उदाहरणों (4.4.2.1 और 4.4.2.2) में, एफ औसत ग्रे के स्तर को मापनेया ऐसे ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) के रूप में संयुक्त राष्ट्र के तहत या खंडों सेल (ओं) में प्रत्येक चैनल के लिए एक वैकल्पिक उपकरण का उपयोग कर, और सही स्तर के साथ गलत रिकॉर्ड की जगह। भविष्य में संदर्भ के लिए मूल * statistics.csv फ़ाइल को बचाना है और इसके बारे में केवल एक प्रतिलिपि को संपादित करें। ImageJ का उपयोग कर ऐसा करने के लिए, इन चरणों का पालन करें:
- ImageJ पर प्रासंगिक मल्टी चैनल ढेर खोलें और एक आभासी ढेर ( 'फ़ाइल'> 'आयात'> 'झगड़ा आभासी ढेर ...') के रूप मिनट द्वारा उत्पन्न इसी * overlaid.tiff फ़ाइल आयात करते हैं।
- संयुक्त राष्ट्र के तहत या खंडित नाभिक के एक औसत दर्जे का अनुभाग ढूंढें।
- मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग डीएनए दाग चैनल पर संयुक्त राष्ट्र के तहत या खंडित नाभिक की परिधि रूपरेखा।
- प्रेस सीआरएल + M (एक लबादा पर अध्यक्ष तथा प्रबंध निदेशक + M) या विश्लेषण मेनू में जाना और 'उपाय' का चयन करें। इस कार्रवाई के क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए मतलब ग्रे मूल्य रिकॉर्ड होगा और एक नई विंडो पर यह प्रदर्शित करेगा। 'विश्लेषण' के लिए> जाओ9; सेट मापन ... 'और सुनिश्चित करें कि' ग्रे मूल्य मतलब 'चुना जाता है। मापा जा करने के लिए किसी भी अन्य मापदंडों का चयन करें।
- एक ही क्षेत्र कदम 4.4.2.3.3 में उल्लिखित का उपयोग करना, ब्याज की प्रतिदीप्ति चैनलों में से प्रत्येक के लिए माप दोहराएँ। परिणाम माप 'परिणाम' विंडो पर पिछले एक के लिए संलग्न किया जाएगा।
- * Statistics.csv फाइल में गलत अभिलेखों को बदलने के लिए माप प्राप्त प्रयोग करें। नाभिक खंडित नहीं किया गया था, एक नई पंक्ति सम्मिलित यह एक नया सेल आईडी आवंटित करने और मूल्यों प्रत्येक चैनल के लिए इसी कॉलम के तहत ImageJ में प्राप्त परिचय। यह सेल स्थानिक निर्देशांक (एक्स, वाई और जेड मान) नहीं होगा। नाभिक undersegmented किया गया था, इसके पंक्ति नकल प्रत्येक नए सेल करने के लिए अलग सेल आईडी निर्दिष्ट करने तथा मूल्यों के इसी कॉलम के तहत ImageJ में प्राप्त परिचय। इस मामले में, दोनों कोशिकाओं स्थानिक निर्देशांक का हिस्सा होगा।
नोट: स्थानिक वितरण का विश्लेषण किया जा रहा है, तो हम recommend XYZ को छोड़कर, इन कोशिकाओं के निर्देशांक के रूप में वे ओवरलैप जाएगा। यह अंत करने के लिए, जब नए रिकॉर्ड बनाने, कि आसानी से (उदाहरण के लिए, गैर पूर्णांक संख्या के लिए) मूल लोगों से प्रतिष्ठित हैं उन्हें करने के लिए सेल आईडी को आवंटित।
- कोशिकाओं को विभाजित स्कोर। नोट: मिनट mitotic के साथ ही Interphase नाभिक का पता लगाता है, लेकिन उन दोनों के बीच भेद नहीं कर सकते।
- mitotic नाभिक विश्लेषण में अलग से विचार किया जाना है, तो स्वयं इन स्कोर और डेटा फ़ाइल को यह जानकारी जोड़ें। mitotic कोशिकाओं को रिकॉर्ड करने के लिए, * statistics.csv डेटा फाइल करने के लिए एक नया चर (स्तंभ) जोड़ने और mitotic और नाभिक अंतरावस्था करने के लिए विभिन्न मूल्यों आवंटित।
- अति-विभाजन का हल
- डेटा पूर्व प्रसंस्करण।
नोट: एक बार स्प्रेडशीट खत्म लिए सही किया गया है और अंडर विभाजन वे विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। विश्लेषण की प्रक्रिया और डेटा प्रस्तुति विशिष्ट प्रयोग पर निर्भर करेगा। हालांकि, नीचे कुछ सामान्य डेटा परिवर्तनों हैंहम विश्लेषण करने से पहले बाहर ले जाने की सलाह:- डेटा के बिखराव को कम करने के लिए उनके लघुगणक या वर्गमूल में प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों रूपांतरण। यह भी दृश्य में मदद करता है, के रूप में कच्चे डेटा साजिश की कुल्हाड़ियों के पास ध्यान केंद्रित करते हैं (देखें चित्र 4 बी, सी)।
- सही प्रतिदीप्ति की जेड जुड़े क्षीणन:
नोट: लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी छवियों में प्रतिदीप्ति तीव्रता Z पर गहरा कम हो जाती है धुरी एक टुकड़ा (चित्रा 4E, एफ) स्थित है।- अगर epitopes नमूने में पाया की एक एक सर्वव्यापी और एक ही ढंग से व्यक्त हाउसकीपिंग परमाणु मार्कर है, हाउसकीपिंग मार्कर की समान मूल्य द्वारा प्रत्येक कोशिका में उनके मूल्यों को विभाजित करके अन्य epitopes की प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक के अनुसार।
- इस तरह के एक संदर्भ मार्कर के अभाव में, क्षतिपूर्ति निम्नलिखित तरीके से प्रतिदीप्ति की जेड जुड़े नुकसान:
- प्रत्येक मार्कर के मूल्यों साजिश (Yसाजिश एक साथ सभी नियंत्रण, जंगली प्रकार भ्रूण (चित्रा 4F) के लिए मूल्यों - ग्राफ) Z स्थिति पर (ग्राफ के एक्स अक्ष) की धुरी जेड से अधिक तीव्रता में कमी कल्पना करने के लिए।
- एक रेखीय मॉडल (प्रतिगमन वक्र) साजिश (तीव्रता जेड खत्म मान) प्रत्येक मार्कर (चित्रा 4F) के लिए पिछले चरण में प्राप्त करने के लिए फिट बैठते हैं।
- निम्न सूत्र का उपयोग कर प्रत्येक मार्कर के लिए सभी मूल्यों को सही:
लॉग (मूल मूल्य) + Z * मॉडल (चित्रा 4 डी, जी) की ढलान।
नोट: इस सुधार के लिए इस्तेमाल किया (आर, MATLAB, आदि) के विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर निर्भर करेगा प्रदर्शन करने के लिए विशेष कदम। अगर आर का उपयोग, डेटा के लिए एक रेखीय मॉडल फिट करने के लिए निम्न सूत्र चलाने:
> एल एम (लॉग (चैनल) ~ जेड, डेटा = dataframe)
जहां, चैनल, प्रतिदीप्ति चैनल को सही किया जा रहा है जेड जेड का समन्वय है और dataframe वांछित भ्रूण (एस) (* स्टेट के लिए सभी मूल्यों से युक्त तालिका हैistics.csv मिनट या इसके बारे में एक संशोधन के द्वारा उत्पन्न फाइल)।
नोट: उपरोक्त सूत्र के उत्पादन में निम्न स्वरूप होगा:
(अवरोधक) Z
४.७६३७३ -०.०१,९४७
जहां, मूल्य जेड कि डाटासेट के लिए प्रतिगमन लाइन है, जो निरपेक्ष मूल्य सूत्र 4.5.2.2.3 में दिए गए मूल मान को संशोधित करने के लिए (एक उदाहरण के लिए चित्रा 4 जी देखें) इस्तेमाल किया जाना चाहिए की ढलान है।
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Representative Results
डेटा की व्याख्या और प्रस्तुति की सुविधा के लिए, देखभाल संग्रह और हेरफेर के दौरान भ्रूण को नुकसान नहीं है, ताकि सभी कोशिकाओं और उनके रिश्तेदार की स्थिति का विश्लेषण किया जा सकता है लिया जाना चाहिए चित्रा 2A - डी। एक विस्तारित गुहा के साथ विभिन्न स्तरों पर बरकरार ब्लास्टोसिस्ट का उदाहरण दिखाता है। घटित नुकसान चाहिए, अतिरिक्त ध्यान जब विश्लेषण और परिणामों की व्याख्या लिया जाना चाहिए।
गुणवत्ता और इस प्रोटोकॉल का उपयोग उत्पन्न आंकड़ों की विश्वसनीयता निर्धारण की गुणवत्ता पर और ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी का संकेत करने वाली शोर अनुपात पर निर्भर है। हमेशा ताजा लगानेवाला का उपयोग करें और नई एंटीबॉडी परीक्षण, उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के साथ, प्रयोगों का एक सेट की शुरुआत से पहले। चित्रा 2A परमाणु प्रोटीन के एक नंबर के लिए अच्छा एंटीबॉडी का उदाहरण दिखाता है। चित्रा 2 बी एक exampl चलताएक cytoplasmic प्रोटीन (DAB2) के लिए एक अच्छा एंटीबॉडी के ई। चित्रा -2 सी एक बुरा धुंधला हो जाना, कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ, जहां नमूना केवल 10 मिनट के लिए तय की गई थी की एक उदाहरण दिखाता है। इस मामले में, GATA4 के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी (सांताक्रूज, अनुसूचित जाति-1,237) हे / एन निर्धारण एक मजबूत संकेत (फिक्स्ड हे / एन और इस एंटीबॉडी के साथ दाग भ्रूण के मामलों के लिए 24 देखें) प्रदान करने की आवश्यकता है। बाद के प्रसंस्करण के दौरान संकेत स्तर बढ़ाने से एक बहुत शोर छवि का पता चलता है। इसके विपरीत करके विरोधी GATA4 चित्रा 2A (SC-9053) के लिए इस्तेमाल केवल 10 मिनट निर्धारण के बाद उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात प्रदान करता है। इन के लिए विवरण और अन्य मजबूत एंटीबॉडी सामग्री अनुभाग में प्रदान की जाती हैं।
एक अच्छा मिनट विभाजन के लिए सीमित कारकों क) इमेजिंग के लिए इस्तेमाल उद्देश्य से बढ़ाई, ख) जेड संकल्प और ग) परमाणु धुंधला की गुणवत्ता। चित्रा 2 डी एक ओय साथ imaged भ्रूण के उदाहरण से पता चलता है1.30 की एक एनए और एक 0.21 मिमी डब्लू डी के साथ एल विसर्जन 40x उद्देश्य। मध्य पैनलों ICMS जहां व्यक्तिगत नाभिक और उन दोनों के बीच सीमा प्रतिष्ठित किया जा सकता का आवर्धन दिखा। डीएनए धुंधला का उपयोग नहीं करते हैं (यानी।, Hoechst, DAPI, यो-YO1, आदि-PRO3 के लिए) मात्रा का ठहराव के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों, अधिग्रहण पैरामीटर व्यक्तिगत रूप से सबसे अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। नीचे पैनलों बताएंगे कि कैसे अधिक भ्रूण, उच्च घनत्व परमाणु और इस प्रकार अधिक विभाजन त्रुटियों (नोक और तीर) की संभावना को उन्नत चित्रा 3 (त्रुटियों कि मिनट प्रतिबद्ध कर सकते हैं, इस तरह की जीवित कोशिकाओं के रूप में apoptotic नाभिक का पता लगाने के रूप में के उदाहरण से पता चलता है। चित्रा 3AA, एबी, विज्ञापन) में पैनल में तारों, अति-विभाजन (तीर और चित्रा 3AC) में या के तहत विभाजन तीर (चित्रा 3AD में तीर)। चित्रा 3 बी के तहत एक-विभाजन की घटना जेड स्लाइस के एक दृश्य से पता चलता है, जहां दो कोशिकाओं से एक के रूप में पहचान की गई है। नोट कैसे मिनट विभाजन एक खंड है कि सभी स्लाइस जहां एक दिया सेल मौजूद है शामिल खंड के खाते में जेड अक्ष लेता है।
अंत में, डेटा विश्लेषण के विशेष अध्ययन के तहत सवाल पर निर्भर करेगा, इसलिए, विश्लेषण की प्रक्रिया के लिए दिशा निर्देश नहीं यहाँ दी जा सकती है। हालांकि, हमने पाया है कुछ प्रारंभिक डेटा परिवर्तनों उपयोगी होने के लिए चित्रा 4 बी -।। डी मार्कर NANOG और भ्रूण के आईसीएम में gata6 चित्रा -4 ए में दिखाया गया के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों के भूखंडों से पता चलता चित्रा 4 बी मिनट से प्राप्त कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों से पता चलता है । चित्रा 4C पता चलता है एक लघुगणक परिवर्तन है, जो साजिश से अलग करती मूल्यों के बाद ही डेटा कुल्हाड़ियों (एक वर्गमूल परिवर्तन भी संभव है और एक समान साजिश पैदावार)। चित्रा 4D शो (तहत और अधिक विभाजन के मैनुअल सुधार के बाद) स्वचालित रूप से ग के बाद ही डेटाप्रतिदीप्ति में जेड जुड़े क्षीणन के लिए मूल्यों orrecting, के रूप में प्रोटोकॉल के कदम 4.5.2.2 में विस्तार से बताया। इस जेड जुड़े प्रतिदीप्ति क्षय के उदाहरण चित्रा 4E में छवि और 4F में भूखंडों में दिया जाता है। चित्रा 4 जी डाटा परिवर्तन के प्रभाव 4.5.2.2 में विस्तार से बताया चलता। या तो आद्यबहिर्जनस्तर (लाल, NANOG +, GATA6-) या पूर्व (नीले, NANOG-, gata6 +) पहचान का प्रतिनिधित्व रंग NANOG और gata6 मूल्यों के एक समारोह के रूप में साजिश करने के लिए जोड़ा गया है। इस विशेष उदाहरण में, जहां कोशिकाओं को लॉग इन के अनुपात [gata6] / log [NANOG]> 1.25 माना जाता था पूर्व, एक मध्यवर्ती के साथ कोशिकाओं को जहां प्रवेश के अनुपात [gata6] / log [NANOG] <1 महामारी माना जाता था, और कोशिकाओं अवचनबद्ध अनुपात (इस मामले में कोई नहीं) माना जाता था। सभी डेटा परिवर्तनों और भूखंडों Rstudio में किया गया है, हालांकि, सॉफ्टवेयर का चुनाव नहीं महत्वपूर्ण है और अंत उपयोगकर्ता पर निर्भर करेगा।
चित्रा 1. भ्रूण स्थान, समय और विश्लेषण पाइपलाइन। (क) एक के योजनाबद्ध (दो) के माउस गर्भाशय सींग और preimplantation विकास के चरणों में, जहां वे पाया जाना चाहिए सींग के क्षेत्र के साथ गठबंधन किया। (बी) के प्रत्येक चरण के लिए समय के साथ प्रायोगिक समय। प्रोटोकॉल और ठहराव अंक (नीला) के कदम संकेत कर रहे हैं। (सी) छवि अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन मिनट का उपयोग करने का सारांश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस और परमाणु घनत्व के उदाहरण हैं। (ए) परमाणु टीआर के लिए परीक्षण किया एंटीबॉडी के साथ अच्छा immunofluorescence परिणाम के उदाहरणanscription कारकों। एंटी CDX2 एक AlexaFluor 568 गधा विरोधी बकरी के साथ एक AlexaFluor 488 गधा विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी, एंटी-gata6 के साथ पाया गया था, एक AlexaFluor 647 गधा विरोधी खरगोश के साथ विरोधी NANOG, विरोधी GATA4 (सांता क्रुज़, अनुसूचित जाति-9053 ) एक AlexaFluor 488 गधा विरोधी खरगोश और एक AlexaFluor 647 गधा विरोधी माउस के साथ विरोधी OCT4 के साथ। सभी प्राथमिक एंटीबॉडी सामग्री तालिका में सूचीबद्ध हैं। Cytoplasmic GATA4 परमाणु धुंधला गैर विशिष्ट है, और Gata4 अशक्त भ्रूण में भी दिखाई देता है (नहीं दिखाया गया है)। (बी) के एक cytoplasmic प्रोटीन, DAB2 के लिए अच्छा immunofluorescence का उदाहरण है। यह एक AlexaFluor 488 गधा विरोधी माउस का उपयोग कर पाया गया है। (सी) बुरा immunofluorescence का उदाहरण है, एक परमाणु कारक के लिए एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ। और एक AlexaFluor 568 गधा विरोधी बकरी, GATA4 एक विरोधी GATA4 बकरी में उठाया (जबकि SC-9053 (खरगोश विरोधी GATA4) में इस्तेमाल किया गया था (ए) सांताक्रूज, अनुसूचित जाति-1,237) के साथ पाया गया है। (
चित्रा 3. मिनट त्रुटियों के उदाहरण। (क) एक भ्रूण से अलग-अलग जेड वर्गों के अनुक्रम मिनट विभाजन त्रुटियों के उदाहरण दिखा। Apoptotic कोशिकाओं जो फिर भी नाभिक के रूप में पहचाने जाते हैं पैनलों ए, बी और डी में एक तारांकित (*) से चिह्नित कर रहे हैं। पैनल बी, आईडी # 39 (नोक) में, बहुत छोटे यद्यपि, इसी नाभिक की पहचान करता है और इस प्रकार uncorrected छोड़ा जा सकता है। पैनल सी में, आईडी # 66 (तीर) के दो अलग अलग n तक फैलाuclei है, जो बारी में अलग से पहचान की गई (तीर, आईडी # 65 # 54 और # 53)। पैनल डी में, दो कोशिकाओं (आईडी # 63) (तीर पतली सीमा अंकन देखें) एक भी एक के रूप में पहचान की गई है और इस रिकार्ड इसलिए सेल गिनती प्रयोजनों के लिए दोहराया जाना चाहिए। (बी) मिनट जेड अक्ष के साथ कोशिकाओं का पता लगाता है। छवियों दो कोशिकाओं के जेड-स्लाइस है कि ग़लती से एक भी (# 123) के रूप में रन बनाए दिया के एक दृश्य दिखा। नोट कैसे नीले क्षेत्र नाभिक परिसीमन जेड के साथ सतत है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. विभाजन और डेटा परिवर्तनों का उदाहरण है। (ए) एक ब्लास्टोसिस्ट की आईसीएम कोशिकाओं NANOG के लिए दाग और gata6 और उसी के परमाणु विभाजन का स्नैपशॉट की छवियाँभ्रूण परमाणु धुंधला चैनल पर मिनट (Hoechst 33342) का उपयोग। (बी) मिनट से मापा आईसीएम कोशिकाओं में NANOG और gata6 प्रतिदीप्ति मूल्यों, कच्चे डेटा (बी) के रूप में साजिश रची लघुगणक परिवर्तन (सी) के प्रदर्शन के बाद और जेड अक्ष के साथ प्रतिदीप्ति क्षय के लिए मूल्यों को सही और सही के आधार पर सेल पहचान स्वचालित रूप से बताए के बाद मूल्यों (डी)। (ई - जी) जेड अक्ष के साथ प्रतिदीप्ति क्षय के लिए डेटा सुधार के उदाहरण हैं। (ई) एक ब्लास्टोसिस्ट Hoechst और विरोधी CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488) के साथ लेबल, जेड अक्ष के साथ प्रतिदीप्ति कमी दिखाने की छवियाँ। (एफ) (ई) में दिखाया गया एक सहित भ्रूण का एक पूल के लिए Hoechst और AF488 के लिए जेड अक्ष के साथ प्रतिदीप्ति मूल्यों के तितर बितर भूखंडों। ग्रे लाइन मूल्यों के प्रत्येक सेट के लिए प्रतिगमन वक्र का प्रतिनिधित्व करता है। (G) एफ के रूप में एक ही डेटा प्रत्येक कक्ष के लिए प्रतिदीप्ति क्षय compensating के बादनिम्नलिखित कारक का उपयोग: जेड के समन्वय * रेखीय मॉडल की ढलान (प्रोटोकॉल में कदम 4.5.2.2 देखें)। पैनलों ई - जी मूल रूप से नोड में लेखकों द्वारा प्रकाशित किए गए थे (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) प्रत्येक डॉट एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है। स्केल = 20μm। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| उपयोगकर्ता का इनपुट |
| चमक दहलीज * (मंद छवियों में परमाणु पता लगाने की सुविधा) |
| सापेक्ष एक्स / YZ संकल्प |
| खंड के लिए चैनल |
| परमाणु व्यास |
| छवि शोर का स्तर |
| मिनट आउटपुट |
| nucl साथ विभाजन Z ढेरEi आईडी को |
| परमाणु मात्रा |
| XYZ प्रत्येक नाभिक के लिए निर्देशांक |
| औसत और प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल और नाभिक के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों के माध्यम से योग |
| फायदे |
| ढेर भर नाभिक की सटीक विभाजन (> 85%) - आसन्न जेड वर्गों में एक नाभिक की सभी घटनाओं को पहचानता |
| एकल कोशिका संकल्प |
| भ्रूण के बैच के unsupervised विभाजन |
| विभाजन पाइपलाइनों को बचाया जा सकते हैं या तो कर सकते हैं और फिर से इस्तेमाल किया या एक विशेष भ्रूण के लिए समायोजित |
तालिका 1 मिनट सुविधाएँ
| लोड छवि | प्रॉम्प्ट पर, के लिए Z रिश्तेदार संकल्प का परिचयछवि। यह डिफ़ॉल्ट रीडर का उपयोग कर या निम्न फार्मूला लागू फ़ाइल मेटाडाटा से प्राप्त किया जा सकता है: एक्स (या Y) संकल्प / Z संकल्प (सभी माइक्रोन में)। |
| चैनल के लिए खंडित किया जा करने के लिए - क्रम संख्या (5 1) दर्ज करें। विभाजन के लिए डीएनए दाग चैनल का उपयोग कर छवि में सभी कोशिकाओं का पता लगाने जाएगा, हालांकि, अन्य चैनलों के लिए अलग से भी खंडित किया जा सकता है। | |
| (1 डिफ़ॉल्ट रूप से) में विभाजन शुरू करने के लिए फ्रेम दर्ज करें। केवल एकाधिक समय फ्रेम के साथ फाइल करने के लिए लागू होता है। | |
| छवि को बढ़ाने (वैकल्पिक) | छवि का सफेद और काले बिंदु का पता लगाने की सुविधा के लिए समायोजित किया जा सकता है। 255 (8 बिट छवियों के लिए) या 0 - - आम तौर पर करने के लिए 0 सफेद बिंदु और फिर से स्केलिंग को कम 4096 (12-बिट छवियों के लिए) छवि उज्जवल बनाने और मंद नाभिक का पता लगाने की सुविधा होगी। |
| का पता लगाने के नाभिक | अनुमान के अनुसार परमाणु व्यास का चयन करें (ब्लास्टोसिस्ट्स में 30 और 40 के बीच आम तौर पर पिक्सल)। |
| शोर छवियों के लिए शोर स्तर समायोजित किया जा सकता है। अन्यथा, डिफ़ॉल्ट मान लागू किया जाएगा। | |
| खंड नाभिक | तयशुदा मापदंडों का प्रयोग करें। |
| वर्गीकृत नाभिक | मिनट स्थिति के आधार पर preimplantation भ्रूण में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) कोशिकाओं से ट्रोफेक्टोडर्म (ते) भेद कर सकते हैं। यह भी मैन्युअल रूप से किया या प्रतिदीप्ति स्तर के आधार पर अगर एक ते मार्कर प्रयोग किया जाता है हो सकता है। |
| निर्यात के लिए परिणाम | फ़ाइलें उत्पन्न करने के लिए चयन करें: |
| - विभाजन के लिए इस्तेमाल किया चैनल पर मढ़ा (झगड़ा अनुक्रम फ़ाइल), | |
| - विभाजन केवल (झगड़ा अनुक्रम फ़ाइल), | |
| - सभी कोशिकाओं का पता चला, xyz निर्देशांक और प्रत्येक कोशिका (.csv फ़ाइल) के लिए सभी चैनलों के लिए प्रतिदीप्ति स्तर (औसत और योग) के लिए आईडी के साथ स्प्रेडशीट। | |
| सभी फाइलों को डिफ़ॉल्ट रूप से निर्यात किया। फ़ाइलें s में बच रहे हैंAME निर्देशिका जहां छवियों स्थित हैं। |
तालिका 2 मिनट विभाजन पाइपलाइन
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल preimplantation चरण माउस भ्रूण पर पूरे माउंट immunofluorescence का एक मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन है। एक मजबूत इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 22 उच्च संकल्प द्वारा पीछा किया जाता है, पूरे माउंट confocal इमेजिंग और छवि विभाजन करके सॉफ्टवेयर 4 के एक टुकड़े का उपयोग कर सिलवाया। जबकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का चुनाव महत्वपूर्ण नहीं है, हम यहाँ प्रस्तुत 22, तेजी से विश्वसनीय हो और एंटीबॉडी हम परीक्षण किया है के कई के लिए मजबूत संकेत प्रदान करने के लिए एक पाते हैं। अन्य प्रोटोकॉल का पालन किया जा सकता है, बशर्ते उनके आवेदन बराबर प्रयोगों भर के अनुरूप है। जबकि कई कारकों प्रयोगों के बीच प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के परिणाम, और प्रत्यक्ष तुलना को प्रभावित जरूरी संभव नहीं है, हमने पाया कि repetitions भर में स्थिरता के लिए प्रयास कर रहा है और पर्याप्त तकनीकी प्रतिकृति प्रदर्शन बहुत परिवर्तनशीलता को कम कर देता है। इसलिए, एक बार अनुकूलित किया है, निर्धारण और immunolabelinजी अभिकर्मकों और प्रोटोकॉल, साथ ही इमेजिंग की स्थिति बराबर प्रयोगों के बीच स्थिर रखा जाना चाहिए।
मुख्य समस्या है कि दो समूहों में इस प्रोटोकॉल गिरावट के आवेदन के दौरान उत्पन्न हो सकती है: कई त्रुटियों (यानी, खत्म और अंडर विभाजन) के साथ 1) खराब गुणवत्ता धुंधला, मंद संकेत के साथ, और 2) सबऑप्टिमल विभाजन,। कम गुणवत्ता immunofluorescence नमूने के अनुचित निर्धारण के कारण या एंटीबॉडी पूरे माउंट immunofluorescence के लिए उपयुक्त नहीं किया जा रहा करने के लिए आम तौर पर है। सुनिश्चित करें पीएफए ताजा है (या तो हौसले से तैयार या एक सप्ताह पहले की तुलना में अब कोई -20 डिग्री सेल्सियस से आरटी के लिए thawed)। preimplantation भ्रूण के छोटे आकार को देखते हुए, पीएफए में 10 मिनट के निर्धारण पर्याप्त होना चाहिए। हालांकि, हम अब निर्धारण बार (सामग्री देखें) के साथ एक मजबूत संकेत उपज के लिए कुछ एंटीबॉडी पाया है। एक एंटीबॉडी कि पहले परीक्षण किया गया है कमजोर संकेत प्रदान करता है, विभिन्न निर्धारण प्रोटोकॉल प्रयास करें। नहीं सभी एंटीबॉडी पर मजबूती के साथ प्रदर्शन पूरे माउंट आई एम एमunofluorescence और प्राथमिक एंटीबॉडी के चुनाव को प्रयोग के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। नई एंटीबॉडी भ्रूण पर परीक्षण किया जाना चाहिए और इष्टतम एकाग्रता अनुभव से निर्धारित। सामग्री चार्ट में हम एक नंबर एंटीबॉडी हम परीक्षण किया है और नियमित रूप से उपयोग करने की जानकारी प्रदान की है। जब नई एंटीबॉडी पर विचार प्रकाशित साहित्य के लिए या निर्माता की जानकारी के लिए देखें। ध्यान दें कि सभी में पश्चिमी धब्बा काम के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी पूरे माउंट immunofluorescence, और immunofluorescence के लिए आवश्यक परिमाण उच्च सांद्रता के ऊपर से एक आदेश हो सकता है। वाणिज्यिक माध्यमिक एंटीबॉडी आम तौर पर बॉक्स से बाहर अच्छी तरह से काम करते हैं, हालांकि, बराबर प्रयोगों भर में प्राथमिक-माध्यमिक एंटीबॉडी संयोजनों का उपयोग करें कि तुलना में होने जा रहे हैं में लगातार हो।
छवि विभाजन की गुणवत्ता दोनों परमाणु धुंधला की गुणवत्ता पर और भ्रूण के आईसीएम में परमाणु घनत्व पर निर्भर करता है। हमेशा उज्ज्वल के लिए प्रयास करते हैं,तेज नाभिक और एक उच्च संकल्प उद्देश्य (40X या अधिक) का उपयोग करें। यदि परमाणु दाग संकेत कम है, एक ताजा विभाज्य या एक नया बैच का उपयोग करें। परमाणु दाग के रूप में लंबे मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाता है, अधिग्रहण पैरामीटर आदेश तेज, उज्ज्वल नाभिक को रिकॉर्ड करने में प्रत्येक भ्रूण के लिए समायोजित किया जा सकता है। इसी तरह, अगर एक चैनल परमाणु धुंधला अलावा अन्य विभाजन के लिए प्रयोग किया जाता है, उस विशेष चैनल का संकेत करने वाली शोर अनुपात विभाजन की गुणवत्ता का निर्धारण करेगा। देर से मंच ब्लास्टोसिस्ट (E4.0 के बाद) एक बहुत ही उच्च घनत्व परमाणु आईसीएम के भीतर प्रस्तुत करते हैं। इसलिए, यह इन चरणों में है कि उच्च गुणवत्ता धुंधला सबसे महत्वपूर्ण है पर है। फिर भी, विभाजन त्रुटियों इन चरणों में सबसे अधिक बार जगह ले जाएगा। अनुमान के अनुसार परमाणु व्यास और मिनट पाइपलाइन पर छवि शोर स्तर परिचय, 'दृश्य' बटन का उपयोग हर कदम के परिणाम का पता लगाने और जब तक एक संतोषजनक परिणाम प्राप्त की है मापदंडों को समायोजित। पैरामीटर है कि सबसे अच्छा विभाजन उत्पादन का प्रयोग करेंऔर डाटा प्रोसेसिंग के दौरान मैन्युअल रूप से सही त्रुटियों। ध्यान दें कि देर चरण भ्रूण (~ E4.5) एक उच्च सेल गिनती और मैन्युअल डेटा सुधार में काफ़ी समय हो जाएगा।
इस प्रोटोकॉल की सीमाओं छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया confocal खुर्दबीन प्रणाली द्वारा निर्धारित कर रहे हैं। के रूप में चर्चा की, एक काम दूरी पूरे भ्रूण के जेड अक्ष इमेजिंग की अनुमति देता है के साथ एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग करें (- व्यास में 160 माइक्रोन preimplantation माउस भ्रूण 150 तक पहुंच सकता है)। इसी तरह, epitopes कि पता लगाया जा सकता चैनलों की संख्या माइक्रोस्कोप एक बार में प्राप्त कर सकते हैं की संख्या से निर्धारित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, डीएनए के अलावा तीन अलग अलग epitopes (कुल 4 चैनल) प्रत्येक नमूना पर एक साथ लेबल किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक साधन प्रतिदीप्ति चैनल के लिए calibrated है, gating अनुकूलित है और लेजर उत्पादन-सा है।
यहाँ वर्णित विधियों के साथ सेल की स्थिति के विश्लेषण की अनुमतिXYZ माउस blastocysts में हर एक सेल के लिए बगल में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की मात्रा का ठहराव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुल्हाड़ियों। हमारे अनुभव में, किसी भी अन्य उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वैकल्पिक तरीकों संकल्प के स्तर पर है कि पाइप लाइन इस प्रोटोकॉल में लागू (अन्य उपकरणों के साथ एक प्रत्यक्ष तुलना के लिए 4 देखें) कर सकते हैं प्रदान नहीं कर सकते। उच्च घनत्व परमाणु ब्लास्टोसिस्ट की आईसीएम में पाया गया कि मैनुअल आवश्यक सुधार की हद तक उनके उपयोग अव्यावहारिक बना देता है तो कई गलतियाँ उत्पन्न करने के लिए अन्य उपकरणों का कारण बनता है। वैकल्पिक रूप से, मैनुअल सेल गिनती और प्रतिदीप्ति माप पहले से कोशिकाओं के सबसेट या भ्रूण की 10,11,18,19,24 परिभाषित क्षेत्रों के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, मैनुअल गिनती और सभी प्रतिदीप्ति चैनलों और सेल की स्थिति, सभी XYZ कुल्हाड़ियों भर में, प्रत्येक भ्रूण में मौजूद कोशिकाओं के दसियों के लिए की माप इतना समय लगता है कि यह उच्च throughput विश्लेषण जिसके लिए हमारे प्रोटोकॉल तैयार किया गया था के लिए अनुमति नहीं होता होगा । इसके अलावा, एक मैनुअलप्रतिदीप्ति स्तरों के ssessment पूर्वाग्रह से ग्रस्त है, यहाँ वर्णित एक सेल पहचान के बाद के निर्धारण के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक उद्देश्य माप की अनुमति देता है, जबकि एक पाइप लाइन के रूप में इस तरह के। क्रम में सेल पहचान आवंटित करने के लिए, अन्वेषक एक मानक कसौटी स्थापित करना चाहिए एक विशेष प्रयोगात्मक की स्थापना के लिए सभी नमूनों भर में लागू किया जाएगा। जैविक और तकनीकी - - विभिन्न कारकों को देखते हुए कि immunolabeling के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, इस कसौटी उचित नियंत्रण प्रयोगों और पहले प्रकाशित डेटा का उपयोग कर जहां भी संभव निर्धारित किया जाना चाहिए। हम एक निकट भविष्य जहां एक एल्गोरिथ्म प्रयोग की परवाह किए बिना सेल पहचान का स्वत: निर्धारण के लिए तैयार किया जा सकता कल्पना। हालांकि, इस तरह के एक उपकरण केवल अधिक व्यापक आवेदन और वर्तमान पद्धति, सबसे अधिक संभावना मशीन सीखने एल्गोरिदम के साथ युग्मित के सुधार से आ जाएगा।
अंत में, इस पाइपलाइन की सादगी और टकसाली morphol दियामाउस preimplantation भ्रूण के सादृश्य, इस प्रोटोकॉल इस प्रकार उच्च throughput अशक्त phenotypes 5,6 या किसी अन्य प्रयोगात्मक हेरफेर 7 के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है भ्रूण की बड़ी संख्या के विश्लेषण के लिए आसानी से स्केलेबल है। अंत में, जबकि मौजूदा प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया है और preimplantation माउस भ्रूण और ईएससी कालोनियों के विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया है, हम कोई कारण नहीं एक प्राथमिकताओं देखने के लिए क्यों यह इसी तरह की विशेषताओं के साथ अन्य प्रणालियों के लिए लागू नहीं किया जा सकता है - अर्थात् उच्च परमाणु घनत्व। हम दूसरों के प्रयोग और अन्य परिदृश्यों के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है और अपने भविष्य के सुधार के लिए राय देने के लिए प्रोत्साहित करते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
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