Summary
このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。
Abstract
このプロトコルは、系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のインサイチュ分析で定量、単セルを実行するための方法を提供 マウスの着床前胚インチ胚コレクション、免疫蛍光、共焦点顕微鏡で画像化し、画像分割および分析のために必要な手順が記載されています。この方法は、複数の核マーカーの発現と空間胚内のすべてのセルの（XYZ）座標の定量を可能にします。それはMINS、特に着床前胚および胚性幹細胞（ESC）のコロニーの共焦点画像の解析のために開発された画像セグメンテーションのソフトウェアツールを利用しています。 MINSはX、YおよびZ次元を横切る教師なし核セグメンテーションを行い、最小限のユーザ入力で、すべてのチャンネルについて、三次元空間内のセルの位置情報、ならびに核蛍光レベルを生成します。このプロトコルは、画像の解析のために最適化されているが着床前段階のマウス胚の、容易に良好な信号対雑音比を示す任意の他のサンプルの分析に適合し、ここで、高核密度は、画像分割（ 例えば 、胚性幹細胞（ESCの発現解析に障害をもたらすことができます）コロニーを、培養物中の細胞を分化、他の種または段階の胚、 等 ）。
Introduction
マウスの着床前胚は、細胞の運命の仕様および哺乳動物におけるデノボ上皮の研究のための出現とin vivoでの多能性の維持だけでなく、モデルを研究するためのパラダイムです。そして2胚体外系統、栄養外胚葉（TE）と - ほとんどの体細胞組織と生殖細胞を生じさせる - 哺乳類の発生の着床前段階は胚盤胞、すなわち多能性胚盤葉上層を構成する3つの細胞系統の確立に専念しています原始内胚葉（PRE）（ 図1A）1,2。このプロトコルは、（1）収穫に手順を説明し、着床前段階のマウス胚を固定し、（2）目的のタンパク質を標識するために免疫蛍光を行う、（3）のzセクショニング機能を備えた共焦点顕微鏡を用いて全マウントイメージングを行い、（4）共焦点画像とその後の定量的画像分析の核セグメンテーションを行います。このパイプラインは、トンを可能にします彼は、 その場での細胞の亜集団を特徴づけるために、セルIDの割り当てのためのタンパク質レベルの測定に公正。データ解析（ 図1B）に胚コレクションから、（一般的に10マウス胚まで）単一のごみのために4日-このプロトコルはわずか3で行うことができます。いくつかの同腹仔の同時分析は、このように、プロトコルの全体の長さを延長する、画像化およびデータ分析の時間負担を増加させます。
着床前段階のマウス胚は、その小さなサイズとステレオタイプの形態3与えられた、実験的に扱いやすいシステムであり、単一セルの解像度を持つ細胞プロセスのトト撮影に適しています。胚の統計学的に関連する多数の公平な、システムレベルの分析を行うために、自動化され、定量分析パイプラインが望ましいです。しかし、胚盤胞の内部細胞塊（ICM）（高核密度に起因
ここで紹介する解析パイプラインは、MATLABベースの画像分割ツールモジュラー対話型原子力セグメンテーション（MINS）4を中心に展開。 MINS Pユーザは、グラフィカル・ユーザー・インターフェース（GUI）（ 表1）4 を使用して 、画像特性の最小数を確立した後、共焦点のZスタックの大きなバッチの教師なし核セグメンテーションをerforms。このパイプラインは、野生型、実験的に処理し、遺伝的に改変された胚とのESC 5-7の両方でタンパク質の発現および細胞局在化の高スループットデータの生成のために効率的であることが証明されました。現在のプロトコルでは、我々は、着床前段階の胚の画像のセグメンテーションにMINSのアプリケーションを記述します。 ESCの上MINS性能の例については4.7を参照してください。空間的な蛍光強度の測定は、セル識別情報の公正な決意胚（ 図中の遺伝子発現ドメイン及び細胞位置の三次元マップの生成を可能にする一方、自動化された核のセグメント化ステップが大きく、セル識別プロセスの時間の負担を軽減1C 5,6の胚にそれが適用になります。 MINSは（ソフトウェアは、MATLABのライセンスが必要）http://katlab-tools.orgで自由に利用可能です。
今日までに開発なしのアプローチは、マウスの着床前胚におけるタンパク質発現および細胞局在化に対するこのような綿密なデータの生成を可能にしません。すべての試みはこれまでに、これらのタイプのデータを定量化で9月19日 （いずれか完全に手動で、またはソフトウェアアシスト）胚における異なる集団のために細胞数のマニュアル決意および定量に制限されています。 （MINSソフトウェアを組み込んだ）このアプローチは、に合わせ、マウスの着床前胚およびESCの上でテストされています。それにもかかわらず、高核密度を有する他のシステムでは、その性能は、まだテストされていないが、同等であると予想されます。
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Protocol
倫理の声明：飼育、繁殖と犠牲を含むすべての動物の作業は、メモリアル・スローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）、プロトコル番号03-12-017によって承認されました。
1.胚のコレクション
注：すべての動物の作業は、制度や地方当局によって承認され、地元や制度の規則に適合されている必要があります。
- 目的の遺伝子型の肥沃なスタッド男性と処女雌マウスメイト。
注意：自然交配を設定する場合は、発情期のサイクルの発情期にメスを選択すると、希望日に交尾の機会を増加させます。過剰排卵を誘発する場合は、20に記載されているプロトコルを参照してください。 - 鈍いプローブを使用して、午前中に膣のプラグインの存在を確認してください。理想的には、交尾栓が一日を通して失われるように、正午（午後12時）の前にこれを行います。お取置きを考えてみましょう膣プラグ胚日（E）0.5の検出のn個。
- 希望日と胚発生の際には、M2またはRTへのフラッシング保持培地（FHM）または、好ましくは、37ºCを温めます。注：いずれかのM2またはFHMは紅潮し、取り扱い胚のために使用することができます。使用しないときは、4ºCでこれらのメディアを格納します。各子宮のための媒体の〜2ミリリットルの使用を推定します。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で凍結し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）を解凍またはいくつかの新鮮な溶液を調製します。 4ウェルプレートのウェルあたり4％PFA溶液500μlを推定します。 4ウェルプレートの各ウェルに1ごみを修正しました。注：また、96ウェルプレートは、胚を固定し、格納するために使用することができます。 96ウェルプレートを使用している場合は、ウェルあたりPFA溶液100μlを使用します。
- 先端にキャピラリー端を描画するために開いている炎を用いてガラスパスツールピペットを引き出します。
- 地元や制度の規制によって要求される、またはとして頸椎脱臼またはCO 2吸入によって女性を生け贄に捧げます。それは多くの場合desirablですeは頸椎脱臼により動物の安楽死を確認しました。
- 毛髪脱落を最小限にし、内臓を露出するために第一の皮膚を通して、続い体壁（腹膜）を介して、腹部切開を行うために70％エタノールを用いて動物の腹スプレー。
注：次の手順は、E3.25及びE4.5（ 図1A）との間のいずれかの段階で妊娠中の女性のマウスの子宮から胚盤胞を収集するための手順を説明します。以前E3.25よりも着床前胚のコレクションでのプロトコルの場合、20を参照してください。 - 子宮を見つけ、動物から取り除きます。ピンセットで子宮頸部の端を持ち、子宮頸部を切断し、両方の子宮角を伸ばして静かに引き上げます。
- 子宮壁を貫通しないように注意しながら、子宮から脂肪をトリミングします。まだ動物の体に取り付けられている間、子宮の外に延伸することができるので、これは、除去時に容易に行うことができます。あるいは、それはRT PBSに、解剖顕微鏡下で、後で行うことができます。子宮の解剖に関するより詳細なプロトコルの場合、プロトコル5＆8 20を参照してください。
- 卵管の上にカットし、卵巣の下に、シャーレに子宮全体、場所を解放し、PBSでカバーしています。
注：このステップは、その後の胚盤胞の収穫を容易に子宮からの過剰な血液または他の破片の洗浄を可能にします。 - 子宮頸部の両側に、近位端部を切断することにより、両方の子宮角を分離し、子宮頸部を捨てます。 （ 図1A）、それらを結ぶ地峡の下に切断することにより、子宮から独立した各卵管。胚の収集と操作のための操作媒体（M2またはFHMのいずれか）の低下に両方の角を転送します。
- 解剖顕微鏡下では、子宮のうち0.5強制することにより、媒体へのフラッシュ胚盤胞 - 子宮頚部開口部から各子宮角を通してM2またはFHMの1ミリリットルを。 1を使用してください皮下針付きmlシリンジ。注：これは重要ではないが、針は、子宮を引き裂く回避するために、ファイリング石を使用して平滑化することができます。子宮洗浄のための詳細図は21で見つけることができます。
- 解剖顕微鏡を使用して、培地のドロップに散在される胚盤胞を、探します。洗浄後は、皿の底に沈むする胚盤胞のために2分 - 1まで許可。キャピラリーエンドで口制御、ガラスパスツールピペットを使用して、すべての胚盤胞を収集し、メディアの新鮮なドロップに移します。
- 新鮮なM2またはFHMの3滴 - 2を介してそれらを移動することにより、胚盤胞をすすぎます。一度に10個の胚盤胞 - 5のグループで胚を移動します。
注：いずれかの時点でより大きなグループを移動するには、プロセスをスピードアップしますが、それはまた、誤って多くの胚を失う可能性が増加します。胚操作および転送を練習し、口制御ピペットの使用で訓練されていない場合はBの前に考慮すべきです実験をeginning。 - 簡単に酸性タイロード液でそれらを洗浄することにより、未孵化胚盤胞から透明帯（ZP）（一般的に<E4.0）を削除します。すぐZPはもはや目に見えないように、操作メディアに戻す胚盤胞を転送します。細胞のみへの損傷を防ぐために、のように厳密には必要であれば、酸タイロード中に胚を保ちます。
- 裸に胚盤胞を扱うときは、ガラスやプラスチックの表面に非常に付着しやすいよう、注意してください。操作媒体は、付着を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）の4 mg / mlとを含むが、酸タイロードまたはPBSは、したがって、胚の損傷や紛失のリスクを軽減することが2つ以上のピックアップはありませんありません - 5剥皮胚盤胞をBSA-無料または無血清PBSまたは酸タイロードでそれらを操作する時。
注：また、被膜は、使用前に1％BSAを有するガラスピペットは、ガラス表面への胚の付着を低減します。
- 裸に胚盤胞を扱うときは、ガラスやプラスチックの表面に非常に付着しやすいよう、注意してください。操作媒体は、付着を防止するために、ウシ血清アルブミン（BSA）の4 mg / mlとを含むが、酸タイロードまたはPBSは、したがって、胚の損傷や紛失のリスクを軽減することが2つ以上のピックアップはありませんありません - 5剥皮胚盤胞をBSA-無料または無血清PBSまたは酸タイロードでそれらを操作する時。
- コート各ウェルの底部プラスチックに付着する胚を防ぐために1％寒天、0.9％のNaClの薄い層を有する4ウェル組織培養皿の。また、PBS（PBS-BSA）にBSAの4 mg / mlとを追加します。
- PBS中の4％PFAを500μlとよくRT PBS（またはPBS-BSA）を500μlでコーティングされた4ウェル組織培養皿の1つのウェルを記入し、別の。
- RT PBS中で胚盤胞を洗浄し、室温で10分間、PBS中の4％PFAで固定します。固定後、PBS（またはPBS-BSA）に転送します。
- 胚はすぐに処理されようとしていない場合は、（試料の乾燥につながる）の蒸発を防止し、4ºCでプレートを格納するためにミネラルオイルの層を有する胚を含有するPBSを覆います。
注：別の固定方法と時間は、実験に応じて使用することができ、目的のエピトープと抗体が使用されます。どちらの選択方法、染色結果のその後の比較を容易にするために、同等の実験を通して一貫しています。
注： 一時停止ポイント：胚は、次のステップに進む前に、数週間まで、PBS中の4ºCで保存することができます。 PBSは、無菌であり、そして/または長期貯蔵を予想している場合（PBS-BSAを使用した場合は特に）細菌汚染を防止するために、ペニシリン+100μg/ mlのストレプトマイシン（ペニシリン - ストレプトマイシン）の100 U / mlのを追加することを確認します。
2.免疫蛍光
- 以前に試験し、ホールマウント免疫蛍光のために堅牢であることが証明されている任意のプロトコルを使用して免疫蛍光を実行します。注：私たちは、22 および 11に記載されているものをお勧めします。本記事では前者について説明します。どちらの選択方法、染色結果の比較を容易にするために、同等の実験を通して一貫しています。
- 免疫プロトコルの一連の工程を実行するために柔軟な、ビニル、透明な、U底の96-ウェルプレートを使用します。 50で各ウェルを埋める - 溶液100μlと1溶液から胚を移動L字型の口のピペットを使用して別の。このアプローチは、試薬の使用を最小限に抑え、追跡の手順だけでなく、いくつかの実験群の並列染色を容易に注意してください。
- オプション：コートプラスチックに胚の付着を防止するために、1％寒天、0.9％のNaClの薄層とウェルの底。免疫蛍光ソリューションにBSAを追加しないでください。
- PBX（PBS中0.1％トリトンX-100）を準備します。いくつかの免疫蛍光実験の性能を予測した場合、実験間の4ºCでPBXや店舗の50ミリリットルを準備します。
- 透過化溶液（0.5％トリトンX-100、PBS中の100mMグリシン）を準備します。各実験のために新鮮な透過処理溶液1ミリリットル（またはいずれか必要な量）を行います。
- 溶液（PBS中のペニシリン - ストレプトマイシン2％ウマ血清（HS）または20％ウシ胎児血清（FBS））を遮断準備。実験間の4ºCで10ミリリットルとストアを準備します。
- 差異は、いずれかの間で観察されていません血清型は、しかしながら、同等の実験のために使用されるブロッキング溶液の選択に一致すること。
- PBXにおけるRT（〜100μL）で5分間固定胚を洗浄します。
- 透過溶液（〜100μL）で室温で5分間胚を透過。
- PBXにおけるRT（〜100μL）で5分間胚を洗浄します。
- ブロッキング溶液の〜100μl中、室温で1時間に30分間ブロック胚。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
注：胚は30分ブロッキングステップに比べて顕著な改善または損なうことなく4ºCで最大O / Nの期間のためにブロックすることができます。 - 溶液（〜100μl）を遮断するに希釈した一次抗体/抗体中4ºCでの胚O / Nインキュベートします。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
- 事前に各一次抗体のための最適希釈を決定します。 Dを参照してください。抗体の数のテストされた希釈液のためのiscussionおよび材料セクション。
- O / Nインキュベーションした後、PBXで室温で5分間ずつ（〜100μl）をするための胚3回すすいでください。
- ブロッキング溶液の〜100μl中、室温で1時間に30分間ブロック胚。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
- ブロッキング溶液の〜100μl中4μgの/ mlに希釈した二次抗体/抗体中4ºCで1〜2時間のための胚をインキュベートします。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
- PBXで室温で5分間ずつの胚2回すすいでください。
- 好適なDNA染色に胚を移動します。ヘキスト33342を使用している場合は、PBS中5μg/ mlに希釈します。蒸発を防止または加湿チャンバーに保つためにミネラルオイルの層を有する溶液をカバーしています。
注： 一時停止ポイントを：胚はすぐに画像化されていない場合は、uのために保持することができ核染色溶液中で数週間P。この場合には、確実PBSは、無菌でありおよび/または細菌の増殖及び汚染を防止するために、ペニシリン - ストレプトマイシンまたはアジ化ナトリウムを加えます。
3.共焦点イメージング
注：個々の共焦点顕微鏡の構成が代わりにシステムとソフトウェアのために調整される特定の収集パラメータが必要になります。ただし、次のセクションでは、それが任意のインストールに適用可能であるべきである従うべき一般的なルールのセットを提供します。
- 微細口ピペットを用いて、PBSまたは35ミリメートルのガラスボトムディッシュのガラス面上に核染色溶液の微小液滴を作り、ミネラルオイルで覆います。別の方法として、胚の損傷を防ぐため、ガラス顕微鏡スライドでカバーするシリコーンセパレータで定期的にカバーガラスを使用しています。注：定期的にカバーガラスを使用した場合、胚はその後に再配置さまたは遺伝子型決定のために回復することはできませんので、我々は強くグラスボトムを使用することをお勧めします料理。
- 場所胚微小液滴であり、好ましくはガラス表面にICM-空洞軸に平行で、一貫した方法でアレンジ。顕微鏡ホルダーの皿を設定します。注：レーザー走査型共焦点顕微鏡で得られた画像は、蛍光強度のZ軸に関連する損失を被ります。そのため、配置の一貫性が異なる胚の同等の領域の間の強度を比較するために重要です。
- 遺伝子の発現を変化させることが治療の任意の並べ替えの対象とされていない野生型の胚を用いて、参照パラメータを設定します。
- MINS 具 4 を用いて正確な分割を容易にするデータを得るために高倍率の対物レンズ（ すなわち 、40Xまたはそれ以上）を使用して画像を取得します。
注：20Xの目的にデジタルズームを使用すると、MINSを使用してセグメント化するために十分な解像度の画像を得られません。それがあるべきように、1つはまた、目的の作動距離（WD）を注意する必要があります全体の胚盤胞にまたがるZスタック、このように長いWDの取得を可能にするのに十分な（〜130から150μm）の目的は、通常必要です。 図2に示されている画像- 4は、210ミクロンの作動距離と40X / NA 1.30油浸対物レンズを用いて得ました。 - フルオロフォアを漂白することなく、強い信号対雑音比を提供する最低のレーザ出力を使用してください。
- ゲインを調整し、サンプルをoverexposingことなく、最も広いダイナミックレンジを得るためにオフセット。大部分をカバーする、または全体にまたがるように画像を露光する、グレースケール範囲が画像間の強度の小さな差の検出を容易にします。
- Z軸解像度がMINSとの正確なセグメンテーションのために重要であるため、小さな（1ミクロン）Z-ステップを使用してください。
注意：XYの寸法は、核セグメンテーション処理、画像ファイルのみのサイズには影響しません。一般に、512×512ピクセルがcompromiなし出版品質の画像のために十分なXY分解能でありますハードドライブの空き容量を歌います。 - 重要なステップ：サンプルを比較することができるように、同じ実験のイメージングセッション内および全体で一貫性のある撮像パラメータを保管してください。
- MINS 具 4 を用いて正確な分割を容易にするデータを得るために高倍率の対物レンズ（ すなわち 、40Xまたはそれ以上）を使用して画像を取得します。
- 胚のバッチをイメージング：
- 単一セッション内での画像コヒーレントグループ（リットル、実験）可能な限り。
- 同じ実験の反復のためのイメージングセッション内および全体で一貫性のあるパラメータを保管してください。
- すべての細胞を捕捉する（全Z軸）を通して画像胚。
注記：所望であれば23に記載されるように、胚の遺伝子型決定は、画像形成後に行ってもよいです。ネステッドPCRのための必要性は、経験的に決定されなければならないと分析される遺伝子座と使用するプライマーに依存するであろう。
- 遡及的に画像に胚を一致させることができていることを確認してください。
4.画像解析やデータの前処理
- ダウンロードしてインストールMINS 4のhttpから：// katlab-tools.org（MATLABライセンスが必要）。
- 画像分割を実行します。
- ハードドライブからの共焦点画像やスタックをロードするためにMINSのグラフィック・ユーザ・インタフェース（GUI）をフォロー、核とセグメント画像を検出します。顕微鏡（.lsm、.lif、.oif、 など ）によって生成された生データの全体のZスタックをロードします。 http://katlab-tools.orgと4で検出された各ステップの詳細と手順については、 表2を参照してください 。完了すると、対応する「表示」ボタンをクリックして、各ステップの結果を表示します。ボタンの上の黄色いタグは、プロセスの動作を示し、緑色のタグは操作が完了を示しています。
注：MINSは現在、配列またはマルチポジションファイル.TIFF、.cziファイルをサポートしていません - 各Z-スタックは独立したファイルである必要があります。 - 満足のいくセグメンテーション後、それは他の胚または同腹のために直接使用することができるように作成されたパイプラインを保存します。
- ハードドライブからの共焦点画像やスタックをロードするためにMINSのグラフィック・ユーザ・インタフェース（GUI）をフォロー、核とセグメント画像を検出します。顕微鏡（.lsm、.lif、.oif、 など ）によって生成された生データの全体のZスタックをロードします。 http://katlab-tools.orgと4で検出された各ステップの詳細と手順については、 表2を参照してください 。完了すると、対応する「表示」ボタンをクリックして、各ステップの結果を表示します。ボタンの上の黄色いタグは、プロセスの動作を示し、緑色のタグは操作が完了を示しています。
- バッチ・モード・セグメンテーション：
注：Siのngleファイルを個別にセグメント化することができます。しかし、ゴミや実験内胚は、一般的に匹敵するステージのあることを考えると、MINSは監督なしでそれらのグループに単一のイメージ用に作成したセグメンテーションパイプラインを適用することができます。- バッチモードファイル名を指定して実行]メニューから、[ファイルを追加]を一度に処理されるすべてのファイルを読み込む]をクリックします。注：異なるソースからのファイルは分割キューに追加することができます。
- 「バッチモード実行を開始 'とファイルを処理するためのソフトウェアのための時間を許可する]をクリックします。注：セグメンテーションの出力は、元のファイルが置か同じディレクトリに保存されます。
- セグメンテーションの評価と手動補正
注意：非常に高い精度（> 85％）でMINSセグメント画像が、しかしながら、染色および画像化、ならびに胚のステージの品質は、MINSのパフォーマンスに影響を与えることができます。一般的に、胚内のより高い核密度は、より多くの可能性が高いセグメンテーションエラーがPLACがかかりますE（ 図2D、3）。したがって、セグメント化の精度は、各サンプルについて評価されるべきであり、必要に応じて手動で修正。エラーの2つのタイプが一般的に発生する：セグメンテーションオーバーやアンダーセグメンテーション。- オーバーセグメンテーションの解決：
- 偽陽性同定-アポトーシス小胞（ 図3Aの A、B、D、アスタリスク ）または無傷の核ではない他の要素が、MINSによってそのように同定されている可能性があります。
注意：一般的に、このような偽陽性は、実際の核よりも小さいサイズを持っていると、ほとんどの場合、容易に識別することと、スプレッドシートでソートすることができます。小さ いが、有効なセグメント化されたボリューム（ 図3Aの B、矢印 ）、その結果、核が部分的にしかセグメント化することができる多くの場合しかし、目視検査を強くお勧めします。 - *のstatistics.csvファイルから偽陽性のための対応するレコードを削除します。オリジナル*統計情報を保存しますこの.csv将来の参照用ファイルとそれのコピーのみを編集します。
- 核はオーバーセグメント化されていると2以上の核（ 図3A cを、矢印と矢印）として提示している場合は、どちらかそれらの強度レベルを平均化することによって、レコードをマージしたり、同様の場合、そのセルのレコードの1つを保持し、破棄残り。
- 偽陽性同定-アポトーシス小胞（ 図3Aの A、B、D、アスタリスク ）または無傷の核ではない他の要素が、MINSによってそのように同定されている可能性があります。
- アンダーセグメンテーションの解決：
- MINSは、2つ以上の核の境界を検出することができなかったし、その結果、単一の核（ 図3A dを、矢印および図3B）としてそれらをセグメント化したイベントを特定します。注：測定レベルがマージ誤っされた細胞の平均値となり、別系統にする属してもよいので、これは、タンパク質レベルを定量するために、正確な細胞計数のために問題となるが、より重要なことに。
- MINSが完全に核を検出するために、失敗したイベントを特定します。
- これらのインスタンス（4.4.2.1と4.4.2.2）において、f平均グレーレベルを測定しますまたはそのようなImageJのような代替ツールを使用して、不足または非セグメント化されたセル（複数可）の各チャネル、（http://imagej.nih.gov/ij/）に、正しいレベルで誤ったレコードを交換してください。今後の参考のために、オリジナル* statistics.csvファイルを保存し、それのコピーのみを編集します。 ImageJのを使用してこれを行うには、次の手順を実行します。
- 仮想スタック（「ファイル」>「インポート」>「TIFF仮想スタック... '）としてMINSによって生成され、対応する* overlaid.tiffファイルをImageJのに関連するマルチチャネルスタックを開き、インポートします。
- アンダーまたは非セグメント化された核の中間部分を探します。
- フリーハンド選択ツールを使用すると、DNA染色チャネル上のアンダーまたは非セグメント化された核の周囲を概説します。
- 押しのCrl + M（Macintoshの場合はCmd + M）または分析メニューに移動し、「測定」を選択します。このアクションは、概説領域の平均グレー値を記録し、新しいウィンドウに表示されます。 「分析」に移動します>9;灰色の値が「選択されている意味...測定値を設定します」と確認してください」。測定しようとする他の任意のパラメータを選択します。
- ステップ4.4.2.3.3において概説したものと同じ領域を使用して、関心対象の蛍光チャネルごとに測定を繰り返します。結果は測定結果[結果]ウィンドウの前の1に追加されます。
- * statistics.csvファイル内の誤ったレコードを置き換えるために得られた測定値を使用します。核がセグメント化されていない場合は、新しい行を挿入し、それを新しいCell IDを割り当て、各チャネルの対応する列の下のImageJで得られた値をご紹介します。このセルは、空間座標（X、YとZ値）を持っていません。核がundersegmentedされていた場合、その行を複製し、それぞれの新しいセルに異なるセルIDを割り当て、対応する列の下のImageJで得られた値をご紹介します。この場合には、両方のセルは、空間座標を共有します。
注：空間分布を分析する場合、我々はrを彼らが重複するようecommendは、これらの細胞のXYZ座標を除きます。新しいレコードを作成するときにこの目的のために、オリジナルのもの（例えば、非整数）と容易に区別されていることを、それらへのセルIDを割り当てます。
- 分裂細胞スコア。注：MINSは、有糸分裂だけでなく、間期核を検出し、それらを区別することはできません。
- 有糸分裂核は分析において別々に考慮されるべきである場合は、手動でこれらのスコアと、データファイルにこの情報を追加します。 、有糸分裂細胞を記録* statistics.csvデータファイルに新しい変数（列）を追加し、有糸分裂する異なる値と間期核を割り当てます。
- オーバーセグメンテーションの解決：
- データ前処理。
注：スプレッドシートはオーバーのために修正されており、アンダーセグメンテーション彼らは分析する準備ができたら。分析プロセス及びデータ表示は、特定の実験に依存することになります。ただし、以下のいくつかの一般的なデータ変換があります私たちは、分析前に行うことをお勧めします：- データのばらつきを低減するために、それらの対数や平方根に蛍光強度の値を変換します。生データはプロットの軸付近に集中する傾向がある（ 図4B、C参照）、これはまた、可視化を支援します。
- 蛍光のZ-関連の減衰を修正してください：
注：レーザー走査共焦点顕微鏡画像での蛍光強度は、スライスが（ 図4E、F）に配置される軸Z上の深いを減少させます。- 試料中に検出されたエピトープのユビキタスかつ均一発現ハウスキーピング核マーカーである場合には、ハウスキーピングマーカーの対応する値によって、各セルにその値を除算することによって他のエピトープの蛍光強度を正規化します。
- このような基準マーカの不在下で、以下のように蛍光のZ-関連する損失を補償します。
- 各マーカーの値をプロット（Yプロットのすべてのコントロール、野生型胚（ 図4F）のために一緒に値- Z位置の上のグラフ）（グラフのX軸）の軸がZを超える強度の減少を可視化します。
- 各マーカーの前のステップ（Z超える強度値）（ 図4F）で得られたプロットに線形モデル（回帰曲線）を取り付け。
- 以下の式を用いて各マーカーのすべての値を修正してください：
ログ（元の値）+ Z *モデル（ 図4D、G）の傾き。
注：（R、MATLAB など ）を使用し、解析ソフトウェアによって異なります。この補正を実行するための具体的な手順を。 Rを使用している場合は、データに線形モデルにフィットするように、次の式を実行します。
> LM（ログ（チャネル）〜Z、データ=データフレーム）
、 チャネルは補正すべき蛍光チャネルであり、Zは、Z座標され、 データフレームを所望の胚（複数可）のすべての値（*スタットを含む表でありますMINSまたはその改変によって生成されたistics.csvファイル）。
注：上記の式の出力は次の形式を持っています。
（インターセプト）Z
4.76373 -0.01947
ここで、値Zは、絶対値（例えば、 図4Gを参照）4.5.2.2.3に示した式で元の値を変更するために使用されるべきであるデータセットの回帰直線の傾きです。
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Representative Results
すべての細胞およびそれらの相対的な位置を分析することができるように、データの解釈とプレゼンテーションを容易にするために、ケアは、収集および操作中の胚を傷つけないように注意すべきである。図2A - 。Dは、拡張キャビティと異なる段階で無傷の胚盤胞の例を示しています。発生する損傷べき結果を分析し、解釈する際に、余分な注意が必要です。
このプロトコルを使用して生成されたデータの品質と信頼性は、固定の品質に、目的のタンパク質を検出するために使用される抗体の信号対雑音比に依存します。常に新鮮な固定液を使用して、一連の実験を開始する前に、適切な陽性および陰性対照で、新しい抗体をテストする。 図2Aは、核タンパク質の数のための良好な抗体の例を示している。 図2Bは examplを示しています細胞質タンパク質（DAB2）のための良好な抗体の電子。 図2Cは、試料がわずか10分間固定した低信号対雑音比、で、悪い染色の例を示しています。この場合、GATA4（サンタクルス、SC-1237）のために使用される抗体は、（O / Nと、この抗体で染色し、固定胚のインスタンスのための24を参照）強い信号を提供するために、O / Nの固定が必要です。後処理中に信号レベルを増加させることは、非常にノイズの多い画像を明らかにする。これとは対照的に、図2A（SC-9053）のために使用される抗GATA4は、わずか10分固定後、高い信号対雑音比を提供します。これらおよび他の強固な抗体についての詳細は、材料部に設けられています。
良好MINSセグメンテーションのための制限要因は、イメージングのために使用される対物レンズの倍率は、b）のZ分解能およびc）核染色の質は。 図2Dは 、OIで撮像胚の例を示すA）は1.30のNAと0.21ミリメートルWDとリットル浸対物レンズ40倍。中央のパネルは、個々の核とそれらの間の境界は区別することができるのICMの倍率を示しています。 DNA染色（TO-PRO3 すなわち 、ヘキスト、DAPI、YO-YO1 など ）定量化のための蛍光値を使用しない場合は、取得パラメータを個別に最良の信号を得るように調整することができます。下のパネルは、より多くの、より高い核密度、したがって、セグメンテーションエラー（矢じりや矢印）の高いチャンスを胚を進め方法を示します。 図3は 、このような生細胞（としてアポトーシス核を検出するようMINSがコミットすることができますエラーの例を示しています図部3Aa、AB、AD）内のパネルで、 図3AC中（矢印と矢印）セグメンテーションオーバーまたはアンダーセグメンテーション（ 図3ADの矢印 ）アスタリスク。 図3Bは 、アンダーセグメンテーションイベントのZスライスのシーケンスを示しています2つのセルがあると同定されている場合。 MINSセグメンテーションはセグメントに考慮に入れ、所定の細胞が存在するすべてのスライスを備えてボリュームをZ軸をとる方法に注意してください。
最後に、データ分析の詳細は検討中で質問に依存し、したがって、分析プロセスのためのガイドラインは、ここで指定することはできません。しかし、我々は有用であることがある初期データ変換を発見した図4B - 。Dは 、図4（a）に示した胚のICMでマーカーNANOGとGATA6のための蛍光値のプロットを示す図4Bは MINSから得られた生の蛍光値を示しています。 。 図4Cは、プロットから値を区切る対数変換、後に同じデータが軸（平方根変換も可能であり、同様のプロットを生成する）を示している。 図4Dショー （アンダーとオーバーセグメンテーションの手動補正後）自動的にCの後に同じデータプロトコルのステップ4.5.2.2で説明したように、蛍光のZ-関連減衰の値をorrecting。このZ-関連蛍光減衰の例は、 図4Eと4Fでプロットに画像に与えられている。 図4Gは、データ変換の効果は4.5.2.2で説明を示しています。エピブラスト（赤、NANOG +、GATA6-）又は前（青、NANOG-、GATA6 +）アイデンティティのいずれかを表す色は、NANOGとGATA6値の関数としてプロットに追加されました。この特定の例では、細胞はどこログの比率[GATA6] /ログイン[NANOG]> 1.25を考慮したPRE、中間体とログの比率[GATA6] /ログイン[NANOG] <1は、EPIを考慮された細胞、および細胞比率は、コミットされていない（この場合はなし）とみなされませんでした。すべてのデータ変換プロットをRstudioで行われているが、ソフトウェアの選択は重要ではなく、エンドユーザに依存するであろう。
図1.胚場所、タイムラインと分析パイプライン。彼らが発見されるべきであるホーンの領域と整合したマウスの子宮角と着床前の発達の段階（2の）1の（A）の回路図、。 （B）各ステップのタイミングでの実験のタイムライン。プロトコルおよび休止点（青）のステップが示されています。 （C）画像の取得とMINSを用いた解析パイプラインの概要。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
免疫蛍光および核密度の図2の例。（A）核trのための試験した抗体との良好な免疫蛍光結果の例anscription因子。アンチCDX2は、抗GATA4（サンタクルス、SC-9053、のAlexaFluor 647ロバ抗ウサギ抗NANOG、のAlexaFluor 568ロバ抗ヤギ抗GATA6、のAlexaFluor 488ロバ抗マウス二次抗体で検出しました）のAlexaFluor 488ロバ抗ウサギおよび抗OCT4とのAlexaFluor 647ロバ抗マウスで。すべての一次抗体は、 材料表に記載されています。細胞質GATA4核染色は、非特異的であり、GATA4ヌル胚（図示せず）にも表示されます。 （B）細胞質タンパク質、DAB2のための良い免疫蛍光の例。それのAlexaFluor 488ロバ抗マウスを使用して検出されています。 （C）核因子のための低信号対雑音比の悪い免疫蛍光の例。 （; SC-9053（ウサギ抗GATA4）は（A）で使用されたのに対し、サンタクルス、SC-1237）とのAlexaFluor 568ロバ抗ヤギGATA4は、ヤギで提起された抗GATA4で検出されました。 （
MINSエラー図3.例。MINSセグメンテーションエラーの例を示す1胚から個々のZ-セクションの（A）のシーケンス。それにもかかわらず、核として同定されたアポトーシス細胞は、BとDのパネルにアスタリスク（*）が付いています。パネルbは、ID＃39（矢じり）で、非常に小さいとはいえ、対応する核を識別しないため、未修正のままにすることができます。パネルcでは、ID番号66（矢印）は、二つの異なるn個にまたがります今度は別々に同定されているuclei、（矢じり、IDが＃65＃54と＃53）。パネルdで、2細胞（ID番号63）は単一のものとして同定されている（細い境界線をマーキング矢印を参照）、このレコードは、したがって、細胞計数のために複製する必要があります。 （B）MINSは、Z軸に沿った細胞を検出します。画像は、誤って単一のもの（＃123）として採点された2つのセルのZスライスのシーケンスを示しています。核を区切る青い部分がZに沿って連続しているかに注意してください。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
セグメンテーションとデータ変換の図4の例。（A）NANOGとGATA6について染色胚盤胞のICM細胞の画像と同じの核セグメンテーションのスナップショット核染色チャネル上MINS（ヘキスト33342）を使用して胚。 MINSによって測定ICM細胞（BD）NANOGおよびGATA6蛍光値を対数変換（C）を行った後、Z軸に沿って蛍光減衰の値を補正し、自動的に修正に基づいて、セルIDを割り当てた後、生データ（B）としてプロット値（D）。 （E - G）Z軸に沿って蛍光減衰のためのデータ補正の例。ヘキストおよび抗CDX2 +のAlexaFluor 488（AF488）で標識した胚盤胞の（E）画像、Z軸に沿った蛍光の減少を示します。 （F）は （E）に示すものを含む胚のプールのヘキストとAF488ためのZ軸に沿って蛍光値をプロットした散布します。灰色の線は、値の各セットのための回帰曲線を表します。 （G）Fと同じデータセルごとに蛍光減衰を補償した後、以下の要因を使用して：Zは*線形モデルの傾きを調整する（プロトコールのステップ4.5.2.2を参照してください）。パネルE - Gはもともと各ドットは1セルを表すノード （http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/）で著者によって出版されました。スケール=20μmの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| ユーザー入力 |
| 輝度しきい値*は（暗い画像中の核の検出を容易にします） |
| 相対X / Y-Z分解能 |
| セグメントへのチャンネル |
| 原子力直径 |
| 画像ノイズレベル |
| MINS出力 |
| NUCLとセグメンテーションZスタックEIのID |
| 核体積 |
| XYZは、各核座標 |
| 各蛍光チャネルと核の平均蛍光値の総和 |
| メリット |
| スタック全体に核の正確なセグメンテーション（> 85％） - 隣接のzセクションの核のすべての発生を認識し |
| 単一細胞の解像度 |
| 胚のバッチの教師なしセグメンテーション |
| セグメンテーションのパイプラインが保存され、再使用または各特定胚のために調整することができるいずれか |
表1 MINSの特長
| イメージのロード | プロンプトで、用Z相対解像度を導入イメージ。 （すべてμm単位）X（またはY）解像度/ Z分解能：デフォルトのリーダーを使用するか、次の式を適用するファイルのメタデータから取得することができます。 |
| セグメント化するチャネルのために - シーケンス番号（5 1）を入力します。セグメンテーションのためのDNA染色のチャネルを使用して、画像内のすべてのセルを検出するが、他のチャネルも、別々にセグメント化することができます。 | |
| （デフォルトでは1）でセグメンテーションを開始するフレームを入力します。唯一の複数のタイムフレームを持つファイルに適用されます。 | |
| （オプション）イメージを高めます | 画像の白と黒の点は、検出を容易に調整することができます。一般的に白色点を低下させ、再スケーリング0に - 255（8ビット画像の場合）または0から4096（12ビット画像の場合）画像を明るくし、暗い核の検出を容易にします。 |
| 核を検出 | 推定核の直径を選択します（胚盤胞において一般に30〜40ピクセル）。 |
| ノイズの多い画像のノイズレベルを調整することができます。そうでなければ、デフォルト値が適用されます。 | |
| セグメント核 | デフォルトパラメータを使用します。 |
| 分類核 | MINSは、位置に基づいて、着床前胚における内部細胞塊（ICM）細胞から栄養外胚葉（TE）を区別することができます。これはまた、手動で行うか、TEマーカーが使用される場合、蛍光レベルに基づくことができます。 |
| 結果のエクスポート | 生成するファイルを選択します。 |
| - セグメント化は、使用されるチャネル（.TIFF配列ファイル）上にオーバーレイ | |
| - セグメンテーションのみ（.TIFFシーケンスファイル）、 | |
| - すべての検出された細胞、XYZ座標と各セル形式（.csvファイル）のためのすべてのチャネルの蛍光レベル（平均および合計）のIDとのスプレッドシート。 | |
| すべてのファイルは、デフォルトでエクスポート。ファイルをsに保存されます画像が配置されているAMEディレクトリ。 |
表2 MINSセグメンテーションのパイプライン
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Discussion
現在のプロトコルは、着床前段階のマウス胚の全マウント免疫蛍光の定量的な分析を実行する方法について説明します。堅牢な免疫蛍光プロトコル22は、高解像度、ホールマウント共焦点イメージングによっておよびソフトウェア4の仕立て片を用いて画像分割が続いています。免疫蛍光プロトコルの選択は重要ではないが、我々は、高速で信頼性が高いことが、我々がテストした抗体の多くは強いシグナルを提供するために、ここに22を提示されている1つを見つけます。他のプロトコルが続くことがあり、そのアプリケーションは同等の実験で一貫して提供します。多くの要因は、個々の実験の結果に影響を与える、と実験の間の直接の比較は必ずしも可能ではありませんが、我々は繰り返し間の整合性のために努力し、十分な技術的反復を実行すると、大幅に変動を減少させることを発見しました。そのため、一度最適化された、固定およびimmunolabelinG試薬およびプロトコル、ならびに撮像条件は、同等の実験の間に一定に保たれるべきです。
多くのエラー（ すなわち 、オーバーとアンダーセグメンテーション）で、薄暗い信号と1）質の悪い染色、および2）次善のセグメンテーション：二つのグループにこのプロトコルの秋の適用中に発生する可能性のある主要な問題。低品質の免疫蛍光は、一般的に、サンプルの不適切な固定または抗体は全体マウント免疫蛍光に適したものではないためです。 PFAが新鮮であることを確認します（どちらかの新たに調製しませんか週間前よりも、もはや-20ºCからRTに解凍）。着床前胚の小さなサイズを考えると、PFAで10分間の固定が十分でなければなりません。しかし、より長い固定時間（材料を参照）より強い信号を得るために特定の抗体を発見しました。以前に試験された抗体は、微弱な信号を提供する場合、異なる固定プロトコルを試してみてください。すべての抗体は、全マウントIMMに堅牢に実行していませんunofluorescenceと一次抗体の選択は、実験の結果のために重要です。新しい抗体は、胚および経験的に決定された最適濃度にテストする必要があります。材料のチャートでは、我々は我々がテストされ、日常的に使用している数の抗体の詳細を提供します。新しい抗体を検討する際に発行された文献やメーカーの情報を参照してください。すべてではないマウント全体の免疫蛍光法でウェスタンブロット作業に適した抗体、および免疫蛍光のために必要な濃度が高い一桁までであり得ることに注意してください。商業用二次抗体は、一般的に、しかし、箱から出してうまく機能比較しようとしている同等の実験を通して、一次、二次抗体の組み合わせの使用で一貫しています。
画像分割の品質は、核染色の品質の両方にと胚のICMで核密度に依存します。常に明るいために努力、シャープ核と高解像度の対物レンズ（40Xまたはそれ以上）を使用します。核染色信号が低い場合には、新鮮なアリコートまたは新しいバッチを使用します。限り核染色を定量するために使用されないよう、取得パラメータは、鋭い、明るい核を記録するために、各胚のために調整することができます。核染色以外のチャンネルを分割するために使用される場合、同様に、その特定のチャネルの信号対雑音比は、セグメンテーションの品質を決定します。後期胚盤胞（E4.0以降）ICM内で非常に高い核密度を提示します。したがって、高品質の染色が最も重要であり、これらの段階です。それにもかかわらず、セグメンテーションエラーはこれらの段階で最も頻繁に行われます。推定核の直径とMINSパイプライン上の画像ノイズレベルを導入し、「表示」ボタンを使用して、各ステップの結果を探求し、満足のいく結果が得られるまでパラメータを調整。最高のセグメンテーションを生成するパラメータを使用しますそして、手動でのデータ処理中にエラーを修正します。その後期胚（〜E4.5）時間がかかります高い細胞数と手動によるデータ補正を持っていることに注意してください。
このプロトコルの制限は、画像取得のために使用される共焦点顕微鏡システムによって決定されます。論じたように、全胚のZ軸方向の撮像を可能にする作動距離と、高倍対物レンズを使用する（ - 直径160μmの着床前マウス胚は150に達することができます）。同様に、検出され得るエピトープの数は、顕微鏡を一度に取得することができるチャネルの数によって決定されるであろう。このプロトコルを使用して、DNA以外に三つの異なるエピトープ（合計4チャネル）を各試料に同時に標識することができます。機器は、各蛍光チャネルに対して較正されていることを確認し、ゲーティングが最適化され、レーザ出力が一貫していることをされています。
ここに記載した方法に沿って、セルの位置の分析を可能にしますXYZは、マウス胚盤胞内のすべての単一のセルだけでなく、 その場でのタンパク質発現レベルの定量化を軸。我々の経験では、他の利用可能なソフトウェアを使用する代替方法は、このプロトコルで適用されるパイプラインは（他のツールとの直接比較のために4を参照）することができ、解像度のレベルを提供することはできません。胚盤胞のICMで見つかった高い核密度が必要な手動補正の程度は、それらの使用は非実用的にするので、多くのミスを生成するために、他のツールを引き起こします。代わりに、手動細胞計数および蛍光測定は、以前に細胞や胚10,11,18,19,24の定義された領域のサブセットのために使用されています。すべてのXYZ軸上のすべての蛍光チャネルとセル位置のただし、手動計数および測定、各胚に存在する細胞の数十は、それが私たちのプロトコルが考案されたハイスループット分析を可能にしないように、時間がかかるであろうために。また、マニュアルA蛍光レベルのssessmentは、ここで説明したものは、セル識別の後続の決意についての蛍光強度の客観的測定を可能にするパイプラインながらなど、バイアスする傾向があります。セルIDを割り当てるために、研究者は設定特定の実験のために、すべてのサンプル全体に適用される標準的な基準を確立すべきです。生物学的および技術的な - - さまざまな要因を考慮する免疫標識の結果に影響を与えることができ、この基準は、可能な限り適切な対照実験と以前に発表されたデータを使用して決定されるべきです。我々は、アルゴリズムに関係なく、実験のセルIDを自動的に決意のために設計することができる近未来を想像。しかし、このようなツールは、より広範なアプリケーション、最も可能性の高い機械学習アルゴリズムと相まって、現在の方法の改善からのみ来ます。
最後に、このパイプラインのシンプルさとステレオタイプのモルフォリンを与えられましたマウスの着床前胚の術は、このプロトコルは、このようにヌル表現型5,6またはその他の実験操作7のハイスループット分析を可能にする、胚の大量の分析のために容易に拡張可能です。すなわち、高い核密度-最後に、現在のプロトコルは、着床前マウス胚とESCコロニーの分析用に設計され、最適化されているが、我々はそれが同様の特性を持つ他のシステムに適用することができない理由アプリオリを参照してくださいません。私たちは、実験や他のシナリオにこのプロトコルを適応させ、今後の改善のためのフィードバックを提供するために、他の人を励まします。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
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