Summary
Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.
Abstract
Este protocolo apresenta um método quantitativo para executar, de uma única célula in situ análises de expressão de proteínas para o estudo especificação linhagem em embriões pré-implantação do mouse. Os procedimentos necessários para a coleta de embriões, imunofluorescência, a imagem latente em um microscópio confocal, e segmentação de imagens e análise são descritos. Este método permite a quantificação da expressão de vários marcadores nucleares e a espacial (XYZ) coordenadas de todas as células no embrião. Ela tira proveito de MINS, uma ferramenta de software segmentação de imagens desenvolvido especificamente para a análise de imagens confocal de embriões pré-implantação e colônias de células-tronco embrionárias (ESC). MINS realiza segmentação nuclear sem supervisão entre o X, Y e Z dimensões, que produz uma informação sobre a posição da célula no espaço tridimensional, bem como os níveis de fluorescência nuclear para todos os canais de entrada do utilizador com o mínimo. Embora este protocolo foi optimizado para a análise de imagensde pré-implantação de embriões fase de ratinho, que pode ser facilmente adaptado para a análise de quaisquer outras amostras que apresentam uma boa relação sinal-ruído e onde a densidade nuclear elevada coloca um obstáculo para a segmentação de imagens (por ex., análise de células estaminais embrionárias expressão (ESC ) colônias, células em cultura, embriões de outras espécies ou estágios, etc.) de diferenciação.
Introduction
O embrião de rato pré-implantação é um paradigma para estudar a formação e a manutenção da pluripotência in vivo, bem como um modelo para o estudo da especificação destino celular e epitelização de novo em mamíferos. Os estágios pré-implantação de desenvolvimento dos mamíferos são dedicados à criação das três linhagens de células que compõem o blastocisto, ou seja, o epiblasto pluripotentes - que dá origem à maioria dos tecidos somáticos e células germinativas - e duas linhagens extraembryonic, o trofectoderma (TE) ea endoderme primitiva (PRE) (Figura 1A) 1,2. Este protocolo descreve os procedimentos para (1) embriões colheita e corrigir estágio de pré-implantação do rato, (2) realizar imunofluorescência para identificar proteínas de interesse, (3) realizar todo-montagem de imagens usando um microscópio confocal com capacidades de seccionamento z e (4) realizar segmentação nuclear de imagens confocal e análises subsequentes imagem quantitativa. Este gasoduto permite tele imparciais medição dos níveis de proteína para a atribuição de identidades celulares para caracterizar subpopulações de células in situ. Este protocolo pode ser levada a cabo em tão pouco quanto 3-4 dias para um único ninhada (geralmente até 10 embriões de ratinho), a partir de colheita de embriões para a análise de dados (Figura 1B). A análise simultânea de várias ninhadas aumentaria a imagem e análise de dados a carga do tempo, aumentando assim o comprimento total do protocolo.
O embrião pré-implantação fase do rato é um sistema experimentalmente tratável que, dada a sua pequena dimensão e morfologia estereotipada 3, é bem adequado para em imagem toto de processos celulares com resolução de uma única célula. Para realizar uma análise dos sistemas de nível imparcial de um número estatisticamente relevante de embriões, um gasoduto de análise quantitativa automatizada é desejável. No entanto, devido à densidade elevada nuclear da massa celular interna (ICM) do blastocisto (
O gasoduto análise aqui apresentada gira em torno da ferramenta de segmentação de imagens baseado em MATLAB Modular interactivo Segmentação Nuclear (MIN) 4. MINS performs segmentação nuclear sem supervisão em grandes lotes de Z-pilhas confocal depois que o usuário tenha estabelecido um número mínimo de propriedades da imagem, usando uma interface gráfica de usuário (GUI) (Tabela 1) 4. Este oleoduto tem-se mostrado eficiente para a geração de dados de alto rendimento sobre a expressão da proteína e localização de células em ambos os tipo selvagem, tratados experimentalmente e os embriões e os CES 5-7 geneticamente modificado. No presente protocolo, descrevemos a aplicação de minutos para a segmentação de imagens de embrião pré-implantação de estágio. Para exemplos de desempenho minutos na CES consulte a 4,7. O passo de segmentação nuclear automatizado reduz significativamente a carga do tempo do processo de identificação de células, ao passo que as medições de intensidade espacial e de fluorescência permitem uma determinação imparcial de identidades de células e a geração de mapas tridimensionais dos domínios de expressão do gene e a posição da célula no embrião (figura 1C 5,6. MINS está livremente disponível em http://katlab-tools.org (o software requer uma licença MATLAB).
Nenhuma abordagem desenvolvida até à data permite a geração desses dados aprofundados sobre a expressão da proteína e localização de células em embriões de rato pré-implantação. Todas as tentativas até agora a quantificar estes tipos de dados foram restritos à determinação manual e quantificação do número de células para diferentes populações no embrião (seja inteiramente manualmente ou software assistida) 9-19. Esta abordagem (incorporando software minutos) foi adaptado e testado em embriões pré-implantação do mouse e CES; no entanto, o seu desempenho em outros sistemas com a densidade nuclear de alta, embora ainda não foi testada, é esperado para ser equivalente.
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Protocol
declaração de ética: Todo o trabalho animal, incluindo agricultura, criação de animais e sacrifício foi aprovado pelo Comitê Memorial Sloan Kettering Cancer do Centro Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC), protocolo nº 03-12-017.
Coleção 1. Embrião
Nota: Todos os trabalhos animais devem ter sido aprovados pelas autoridades institucionais e locais e em conformidade com as regras locais e institucionais.
- Companheiro um rato fêmea virgem com um macho parafuso prisioneiro fértil dos genótipos desejados.
Nota: Se a criação de acasalamentos naturais, a seleção de fêmeas na fase estro do ciclo estral aumenta as chances de cópula na data desejada. Se induzir superovulação, consulte os protocolos descritos no 20. - Verifique a presença de um rolhão vaginal na parte da manhã, utilizando uma sonda romba. Idealmente, faça isso antes do meio-dia (12:00), como plugs de cópula são perdidas ao longo do dia. considere nooN de detecção do dia embrionário rolhão vaginal (E) 0.5.
- No dia e hora do desenvolvimento embrionário desejado, aquecer M2 ou exploração de lavagem médio (FHM) para RT ou, de preferência, 37 ºC. Nota: Ou M2 ou FHM pode ser utilizado para lavagem e manipulação de embriões. Quando não estiver em uso, guarde estes meios a 4 ºC. Estimar a utilização de ~ 2 mL de meio para cada útero.
- Descongelar congelado paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) ou preparar alguns solução fresca. Estimar a 500 ul de solução a 4% de PFA por poço de uma placa de quatro poços. Fix uma maca em cada poço de uma placa de quatro poços. Nota: Em alternativa, uma placa de 96 poços pode ser usado para fixar e armazenar embriões. Se utilizar uma placa de 96 poços, 100 ul de usar solução PFA por poço.
- Puxe uma pipeta Pasteur de vidro usando uma chama aberta para desenhar um final capilar na ponta.
- Sacrifício do sexo feminino por deslocamento cervical ou inalação de CO 2, ou como exigido pelos regulamentos locais e institucionais. É muitas vezes desirable para confirmar a eutanásia do animal por deslocamento cervical.
- Spray de barriga do animal com etanol a 70% para minimizar a queda de cabelos e executar uma incisão abdominal, em primeiro lugar através da pele e, subsequentemente, através da parede do corpo (peritoneu) para expor as vísceras.
Nota: Os passos seguintes descrevem o procedimento para recolher blastocistos do útero de um rato fêmea grávida em qualquer fase entre E3.25 e E4.5 (Figura 1A). Para protocolos de recolha de embriões pré-implantação mais cedo do que E3.25, referem-se a 20. - Localize o útero e remover do animal. Segurando a extremidade cervical do útero, com um par de pinças, cortar através do colo do útero e puxar-se suavemente para esticar ambas as trompas uterinas.
- Apare gordura do útero, tendo o cuidado de não perfurar a parede uterina. Isto pode ser feito facilmente no momento da remoção, enquanto ainda ligado ao corpo do animal, como o útero pode ser esticada para fora. Alternativamente, elepode ser feito mais tarde, sob um microscópio de dissecção, em PBS temperatura ambiente. Para um protocolo mais detalhado na dissecção do útero, ver Protocolos 5 & 8 20
- Cortar acima das tubas uterinas, abaixo dos ovários, para liberar todo o útero, coloque em um prato de petri e cubra com PBS.
Nota: Esta etapa também permite a lavagem do excesso de sangue ou outros detritos do útero, o que facilita a colheita blastocisto subsequente. - cornos uterinos separadas tanto por corte através da extremidade proximal, em ambos os lados do colo do útero e descartar o colo do útero. Separa-se cada oviduto do útero por corte abaixo do istmo que eles (Figura 1A) se conecta. Transferir ambos os chifres a uma gota de meio de manipulação (ou M2 ou FHM) para a coleta e manipulação dos embriões.
- Sob um microscópio de dissecção, com descarga blastocistos para fora do útero e para o meio, forçando 0,5 - 1 ml de M2 ou FHM através de cada trompa uterina da abertura cervical. Use um 1ml seringa com uma agulha hipodérmica. Nota: A agulha pode ser atenuada usando uma pedra de arquivamento para evitar rasgar o útero, embora isto não seja crítico. Um diagrama detalhado para lavagem uterina pode ser encontrado em 21.
- Utilizando o microscópio de dissecação, localizar os blastocistos, que serão espalhados por toda a gota de meio. Permita-se para 1-2 min para blastocistos a afundar para o fundo do recipiente após a lavagem. Usando o, pipeta Pasteur de vidro controlado por via oral com um final capilar, recolher todos os blastocistos e transferir para uma queda fresca da mídia.
- Lavar blastocistos, movendo-os através de 2 - 3 gotas de M2 fresca ou FHM. Mover os embriões em grupos de 5 - 10 blastocistos de cada vez.
Observação: Mover grupos maiores a qualquer momento irá acelerar o processo, mas que também irá aumentar as chances de acidentalmente perder muitos embriões. Se não treinados no uso de pipetas controlada na boca, praticando manipulação de embriões e transferência devem ser considerados antes beginning o experimento. - Remover a zona pelúcida (ZP) a partir de blastocistos eclodidos (geralmente <E4.0), lavando-as brevemente em solução ácida de Tyrode. Assim que o ZP não é mais visível, transferir os blastocistos de volta à mídia de manipulação. Apenas manter os embriões em ácido Tyrode do durante o tempo que seja estritamente necessário, a fim de evitar danos para as células.
- Tenha cuidado ao manusear blastocistos desnudas, como eles aderem muito facilmente para superfícies de vidro e plástico. meio de manipulação contém 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) para impedir a fixação, mas o ácido Tyrode do ou PBS não, portanto, para reduzir o risco de danos ou perda dos embriões não pegar mais de 2 - 5 blastocistos desnudas num momento em que manipulá-los em BSA-livre ou sem soro PBS ou ácido Tyrode do.
Observação: Como alternativa, o revestimento pipeta de vidro com 1% de BSA antes da utilização para reduzir a aderência dos embriões à superfície do vidro.
- Tenha cuidado ao manusear blastocistos desnudas, como eles aderem muito facilmente para superfícies de vidro e plástico. meio de manipulação contém 4 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) para impedir a fixação, mas o ácido Tyrode do ou PBS não, portanto, para reduzir o risco de danos ou perda dos embriões não pegar mais de 2 - 5 blastocistos desnudas num momento em que manipulá-los em BSA-livre ou sem soro PBS ou ácido Tyrode do.
- Cubra o fundo de cada poçode um 4-bem placa de cultura de tecido com uma camada fina de agar 1%, NaCl a 0,9% para prevenir a embriões de aderir ao plástico. Alternativamente, adicionar 4 mg / ml de BSA para o PBS (PBS-BSA).
- Encher uma cavidade do 4-bem placa de cultura de tecido revestido com 500 ul de PBS temperatura ambiente (ou PBS-BSA) e outro poço com 500 mL de 4% de PFA em PBS.
- Enxaguar em blastocistos RT PBS e fixar em 4% de PFA em PBS durante 10 min à TA. Transferência para PBS (ou PBS-BSA) após a fixação.
- Se os embriões não vão ser processados imediatamente, cubra a PBS contendo os embriões com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação (levando a dessecação da amostra) e guarde a placa a 4 ºC.
Nota: Diferentes métodos de fixação e os tempos podem ser usados, dependendo da experiência, os epitopos de interesse e os anticorpos a ser utilizados. Qualquer que seja o método de escolha, ser consistentes ao longo de experiências equivalentes para facilitar a posterior comparação dos resultados de coloração.
Nota: Pausaponto: os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C em PBS durante até várias semanas antes de prosseguir para o próximo passo. Certifique-se de PBS é estéril e / ou adicionar 100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de estreptomicina (Pen-Strep) para evitar a contaminação bacteriana (especialmente quando utilizando PBS-BSA) que antecipando armazenamento prolongado.
2. imunofluorescência
- Execute imunofluorescência usando qualquer protocolo que tenha sido previamente testado e provou ser robusto para todo-mount imunofluorescência. Nota: Recomendamos aqueles descritos em 22 e 11. No presente artigo, o primeiro vai ser descrito. Qualquer que seja o método de escolha, ser consistentes ao longo de experiências equivalentes para facilitar a comparação dos resultados de coloração.
- Usar um flexível, polivinilo, claro, com fundo em U de placas de 96 poços para levar a cabo os passos sequenciais do protocolo de imunofluorescência. Encher cada poço com 50 - 100 ul de solução e se mover de uma solução de embriõespara outro usando uma pipeta de boca em forma de L. Nota Esta abordagem minimiza o uso de reagentes e facilita as etapas de acompanhamento, bem como a coloração paralelo de vários grupos experimentais.
- Opcional: revestir o fundo dos poços com uma camada fina de agar 1%, NaCl a 0,9%, para impedir a adesão de embriões para o plástico. Não adicione BSA a soluções de imunofluorescência.
- Prepare a PBX (0,1% de Triton X-100 em PBS). Se antecipando a realização de diversas experiências de imunofluorescência, preparar 50 ml de PBX e armazenar a 4 ºC entre os experimentos.
- Preparar a solução de permeabilização (0,5% de Triton X-100, glicina 100 mM em PBS). Faça 1 ml (ou qualquer valor necessário) de solução de permeabilização fresco para cada experimento.
- Preparar solução de bloqueio (soro de cavalo a 2% (HS) ou 20% de soro fetal de bovino (FBS) com Pen-Strep em PBS). Preparar 10 ml e armazenar a 4 ºC entre os experimentos.
- Não foram observadas diferenças entre ambos osTipo de soro, no entanto, ser consistentes na escolha da solução utilizada para as experiências de bloqueio equivalentes.
- Lavar embriões fixados durante 5 min à temperatura ambiente em PBX (~ 100 mL).
- Permeabilizar embriões durante 5 min à temperatura ambiente em solução de permeabilização (~ 100 mL).
- Lavar embriões durante 5 min à temperatura ambiente em PBX (~ 100 mL).
- Bloco para embriões de 30 min a 1 h à temperatura ambiente em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
Nota: Os embriões podem ser bloqueadas para até O / N períodos a 4 ºC sem melhora notável ou prejuízo quando comparado com medidas de bloqueio 30 min. - Incubar os embriões O / N a 4 ºC em anticorpo primário / anticorpos diluídos em solução (~ 100 mL) de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
- Determinar a diluição óptima para cada anticorpo primário de antemão. veja dISCUSS secção Materiais e para diluições testadas de uma série de anticorpos.
- Depois de O / N incubação, lave embriões 3x por 5 minutos cada à temperatura ambiente no PBX (~ 100 mL).
- Bloco para embriões de 30 min a 1 h à temperatura ambiente em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
- Incubar os embriões durante 1 a 2 horas a 4 ° C em anticorpo secundário / anticorpos diluídos a 4 ug / mL em ~ 100 ul de solução de bloqueio. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
- Lavar embriões 2x por 5 minutos cada à temperatura ambiente no PBX.
- Mover embriões para corar o ADN preferido. Se usando Hoechst 33342, diluído para 5 ug / ml em PBS. Cobrir a solução com uma camada de óleo mineral para evitar a evaporação ou manter numa câmara humidificada.
Nota: Pausa ponto: Se os embriões não estão sendo fotografada imediatamente, eles podem ser mantidos por up para várias semanas em solução de coloração nuclear. Neste caso, garantir PBS é estéril e / ou adicionar Pen-Strep ou azida de sódio para prevenir o crescimento bacteriano e contaminação.
3. Imagem Confocal
Nota: As configurações de microscópio confocal individuais vai exigir parâmetros de aquisição específicas para ser ajustado para o sistema e software no lugar. No entanto, a secção seguinte fornece um conjunto de regras gerais a seguir que deve ser aplicável a qualquer instalação.
- Usando uma pipeta de boca fina, faça microgotas de PBS ou solução nuclear mancha na superfície do vidro de um prato com fundo de vidro 35 mm e cobrir com óleo mineral. Como alternativa, use uma lamela regular com separadores de silicone para evitar danificar os embriões e cobrir com uma lâmina de vidro. Nota: Ao utilizar uma lamela regular, os embriões não podem ser posteriormente reposicionada ou recuperados para genotipagem, portanto, recomendamos o uso de vidro de fundopratos.
- embriões lugar no microgotas e organizar de forma coerente, de preferência com o eixo ICM-cavidade paralelo à superfície do vidro. Configurar o prato no suporte de microscópio. Nota: Imagens obtidas em varredura a laser microscopia confocal sofrem de uma perda eixo Z-associado da intensidade de fluorescência. Portanto, a consistência no sistema é importante para a comparação de intensidades entre regiões equivalentes em diferentes embriões.
- Configurar os parâmetros de referência utilizando embriões tipo selvagem que não tenham sido sujeitos a qualquer tipo de tratamento que pode alterar a expressão genética.
- Adquirir imagens utilizando uma objectiva grande aumento (ou seja, 40X ou superior), a fim de obter dados que irão facilitar a segmentação precisa usar a ferramenta MINS 4.
Nota: Usando o zoom digital em um objetivo 20X não produzirá imagens de resolução adequada para a segmentação usando mins. Deve-se notar também a distância de trabalho (WD) do objectivo, como deve sersuficiente para permitir a aquisição de um Z-pilha que se estende por todo um blastocisto, então uma longa WD (~ 130-150 uM) objectivo é normalmente necessário. As imagens mostradas nas Figuras 2 - 4 foram adquiridos utilizando um 40X / NA objectiva de imersão em óleo de 1,30 com uma distância de trabalho de 210? M. - Usar a menor saída do laser que proporciona uma relação forte sinal-ruído, sem branqueamento os fluoróforos.
- Ajustar o ganho e deslocamento para obter a mais ampla gama dinâmica sem a superexposição da amostra. Expondo as imagens para cobrir a maior parte, ou todos os espectros escala, cinzento irá facilitar a detecção de pequenas diferenças de intensidade entre imagens.
- Usar um pequeno (1 uM) Z-passo, desde resolução do eixo z é crítica para a segmentação preciso com mins.
Nota: dimensões XY não afetam o processo de segmentação nuclear, apenas o tamanho do arquivo de imagem. Geralmente, 512 x 512 pixels é uma resolução XY suficiente para imagens de qualidade para publicação sem compromicantar espaço no disco rígido. - Passo crítico: Manter imagiologia parâmetros consistentes dentro e entre as sessões de imagem da mesma experiência de modo a ser capaz de comparar amostras.
- Adquirir imagens utilizando uma objectiva grande aumento (ou seja, 40X ou superior), a fim de obter dados que irão facilitar a segmentação precisa usar a ferramenta MINS 4.
- A imagem latente lotes de embriões:
- grupos de imagem coerente (ninhadas, experiências) em uma única sessão sempre que possível.
- Mantenha parâmetros consistentes dentro e entre as sessões de imagem de repetições do mesmo experimento.
- embriões de imagem em toda (toda eixo Z) para capturar todas as células.
Nota: Se desejado, embrião genotipagem pode ser feito depois de formação de imagens conforme descrito em 23. A necessidade de PCR interna tem de ser determinada empiricamente e dependerá do local a ser analisada e os iniciadores utilizados.
- Certifique-se de ser capaz de igualar os embriões às imagens retrospectivamente.
4. Análise de Imagem e Pré-processamento de dados
- Baixe e instale MINS 4 a partir de http: // Katlab-tools.org (licença MATLAB necessário).
- Execute segmentação de imagens:
- Siga a interface gráfica de usuário (GUI) de minutos para carregar uma imagem confocal ou pilha a partir do disco rígido, detectar os núcleos e segmento da imagem. Carregar o inteiro Z-pilha de dados brutos gerados pelo microscópio (.lsm, .lif, .oif, etc). Ver Tabela 2 para obter detalhes sobre cada etapa e instruções encontradas em http://katlab-tools.org e 4. Depois de concluído, exibir o resultado de cada etapa clicando no botão correspondente 'View'. A etiqueta amarela acima do botão indica operação em processo, uma etiqueta verde indica operação foi concluída.
Nota: MINS atualmente não suporta arquivos .czi, .tiff sequências ou ficheiros multi-posição - cada Z-stack precisa ser um arquivo independente. - Depois de segmentação satisfatória, salvar o gasoduto criado para que ele possa ser usado directamente para outros embriões ou ninhadas.
- Siga a interface gráfica de usuário (GUI) de minutos para carregar uma imagem confocal ou pilha a partir do disco rígido, detectar os núcleos e segmento da imagem. Carregar o inteiro Z-pilha de dados brutos gerados pelo microscópio (.lsm, .lif, .oif, etc). Ver Tabela 2 para obter detalhes sobre cada etapa e instruções encontradas em http://katlab-tools.org e 4. Depois de concluído, exibir o resultado de cada etapa clicando no botão correspondente 'View'. A etiqueta amarela acima do botão indica operação em processo, uma etiqueta verde indica operação foi concluída.
- segmentação lote-Mode:
Nota: Siarquivos ngle pode ser segmentado individualmente. No entanto, dado que os embriões dentro de uma ninhada ou experiência são geralmente de estágio comparável, MINS pode aplicar o gasoduto segmentação criada para uma única imagem a um grupo de-los sem supervisão.- A partir do menu Batch-Mode Run, clique em "Adicionar arquivos" e carregar todos os arquivos a serem processados ao mesmo tempo. Nota: ficheiros de diferentes fontes podem ser adicionadas à fila de segmentação.
- Clique em "Iniciar Batch-Mode Run 'e dar tempo para o software para processar os arquivos. Nota: A saída Segmentação será salvo no mesmo diretório onde os arquivos originais onde se localiza.
- avaliação de segmentação e correção manual
Nota: MINS segmentos de imagens com uma precisão muito elevada (> 85%), no entanto, a qualidade da coloração e de imagem, assim como a fase de embrião, podem afectar o desempenho mins. Geralmente, quanto maior a densidade nuclear dentro do embrião, os erros de segmentação mais provavelmente vai levar PlacE (Figuras 2D, 3). Assim, a segmentação precisão deve ser avaliada para cada amostra e corrigidos manualmente, se necessário. Dois tipos de erros ocorrem normalmente: o excesso de segmentação e sub-segmentação.- Resolver sobre-segmentação:
- Identificar falsos positivos - vesículas apoptóticas (Figura 3A a, b, d, asteriscos) ou outros elementos que não são núcleos intactos, mas que podem ter sido identificado como tal por mins.
Nota: Em geral, tais falsos positivos têm um tamanho menor do que núcleos reais e pode, na maioria dos casos, ser facilmente identificados e classificados na folha de cálculo. No entanto, o exame visual é fortemente recomendado, como muitas vezes núcleos podem ser apenas parcialmente segmentada, resultando em uma, mas o volume segmentado válida menor (Figura 3A b, ponta de seta). - Excluir os registros correspondentes para falsos positivos a partir do arquivo * statistics.csv. Preservar as estatísticas originais *.csv arquivo para referência futura e editar apenas uma cópia do mesmo.
- Se um núcleo tem sido mais segmentado e apresentado como 2 ou mais núcleos (Figura 3A c, seta e setas), ou mesclar os registros pela média de seu nível de intensidade ou, se semelhante, mantenha um dos registros para essa célula e descartar o descansar.
- Identificar falsos positivos - vesículas apoptóticas (Figura 3A a, b, d, asteriscos) ou outros elementos que não são núcleos intactos, mas que podem ter sido identificado como tal por mins.
- Resolver sub-segmentação:
- Identificar eventos onde MINS falhou para detectar a fronteira entre dois ou mais núcleos segmentados e consequentemente os como um único núcleo (Figura 3A d, seta e 3B). Nota: Isto coloca um problema para uma contagem de células precisas, mas o mais importante, para quantificar os níveis de proteína, tal como os níveis medidos será a média das células que foram erroneamente fundidos, e que podem pertencer a diferentes linhagens.
- Identificar eventos onde MINS não conseguiu detectar um núcleo completamente.
- Nestes casos (4.4.2.1 e 4.4.2.2), medir os níveis de cinza média de fou cada canal na célula (s) sub ou un-segmentado usando uma ferramenta alternativa, tais como ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), e substituir o registo errado com os níveis corretos. Preservar o arquivo statistics.csv * original para referência futura e editar apenas uma cópia do mesmo. Para fazer isso usando ImageJ, siga estes passos:
- Abra a pilha multi-canal relevante em ImageJ e importar o arquivo overlaid.tiff * correspondente gerada por minutos como uma pilha virtual ( 'Arquivo'> 'Importar'> 'TIFF pilha virtual ...').
- Encontrar uma seção medial do núcleo sub ou un-segmentado.
- Utilizando a ferramenta de seleção à mão livre delinear o perímetro do núcleo sub ou un-segmentado no canal da mancha DNA.
- Imprensa Crl + M (Cmd + M em um Macintosh) ou vá para o menu Análise e selecione 'Medida'. Esta acção irá gravar o valor de cinza médio para a área delineada e vai exibi-lo em uma nova janela. Ir para "Analisar">9; medições Set ... 'e certifique-se "significa valor de cinza' é selecionado. Escolha quaisquer outros parâmetros a serem medidos.
- Usando a mesma área delineada no passo 4.4.2.3.3, repetir a medição para cada um dos canais de fluorescência de interesse. Os resultados serão anexados ao anterior na janela As medições 'Resultados'.
- Use as medidas obtidas para substituir os registros errados no arquivo * statistics.csv. Se o núcleo não tinha sido segmentado, inserir uma nova linha, atribuir um novo ID celular e introduzir os valores obtidos no ImageJ na coluna correspondente para cada canal. Esta célula não terá coordenadas espaciais (e Z valores X, Y). Se o núcleo tinha sido undersegmented, duplicar a sua linha, atribuir diferentes a identificação de células a cada nova célula e introduzir os valores obtidos no ImageJ na coluna correspondente. Neste caso, ambas as células irão partilhar coordenadas espaciais.
Nota: Se a distribuição espacial é para ser analisado, recommend excluindo a coordenadas XYZ destas células, à medida que se sobrepõem. Para este fim, ao criar novos registros, atribua a identificação de células para eles que são facilmente distinguidos dos originais (para números de exemplo, não inteiro).
- Pontuação células em divisão. Nota: MINS detecta mitótico, bem como núcleos interfase, mas não pode distinguir entre os dois.
- Se núcleos mitóticas devem ser considerados separadamente na análise, marcar manualmente estes e adicione essas informações para o arquivo de dados. Para gravar células mitóticas, adicionar uma nova variável (coluna) para o arquivo de dados statistics.csv * e atribuir valores diferentes para mitose e interfase núcleos.
- Resolver sobre-segmentação:
- Dados pré-processamento.
Nota: Uma vez que as planilhas foram corrigidos para a sobre e sub-segmentação eles estão prontos para serem analisados. O processo de análise e de apresentação de dados vai depender da experiência específica. No entanto, abaixo estão algumas transformações de dados geraisrecomendamos a realização antes da análise:- Transformar os valores de intensidade de fluorescência para o seu logaritmo ou raiz quadrada para reduzir a dispersão dos dados. Isto também ajuda a visualização, como os dados brutos tendem a concentrar próximo dos eixos da trama (ver Figura 4B, C).
- Corrigir a atenuação associada-Z de fluorescência:
Nota: A intensidade da fluorescência na varredura a laser imagens de microscopia confocal diminui a mais profunda sobre o eixo Z uma fatia está localizado (Figura 4E, F).- Se um dos epitopos detectados nas amostras é um marcador nuclear de arrumação ubíqua e homogeneamente expressa, normalizar as intensidades de fluorescência dos outros epitopos dividindo-se os valores em cada célula pelo valor correspondente do marcador de arrumação.
- Na ausência de um tal marcador de referência, compensar a perda associada-Z de fluorescência da seguinte forma:
- Traçar os valores de cada marcador (Yeixo do gráfico) sobre a posição Z (eixo X do gráfico) para visualizar a diminuição da intensidade ao longo Z - trama juntos os valores para todos controlo, embriões de tipo selvagem (Figura 4F).
- Ajustar um modelo linear (curva de regressão) para o lote obtido na etapa anterior (intensidade os valores superiores a Z) para cada um dos marcadores (Figura 4F).
- Corrigir todos os valores para cada marcador usando a seguinte fórmula:
log (valor original) + Z * declive do modelo (Figura 4D, L).
Nota: Os passos específicos para efectuar esta correcção vai depender do software de análise usado (R, Matlab, etc.). Se estiver usando R, execute o seguinte fórmula para ajustar um modelo linear aos dados:
> Lm (log (canal) ~ Z, data = trama de dados)
em que, o canal é o canal de fluorescência a ser corrigido, Z é o eixo Z e de trama de dados é a tabela que contém todos os valores para o embrião desejado (s) (a * Statistics.csv arquivo gerado pelo minutos ou uma modificação do mesmo).
Nota: A saída da fórmula acima irá ter o seguinte formato:
(Intercept) Z
4,76373 -0,01947
em que, o valor de Z é o declive da linha de regressão para o conjunto de dados que, o que deve ser valor absoluto utilizado para modificar o valor original com a fórmula dada no 4.5.2.2.3 (ver Figura 4G para um exemplo).
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Representative Results
Para facilitar a interpretação e apresentação de dados, deve ser tomado cuidado para não danificar os embriões durante a coleta e manipulação, de modo que todas as células e sua posição relativa pode ser analisada Figura 2A -. D mostra exemplos de blastocistos intactos em diferentes fases com uma cavidade expandida. Deve danificar ocorrer, cuidados extras devem ser tomados ao analisar e interpretar resultados.
A qualidade e a fiabilidade dos dados gerados usando este protocolo é dependente da qualidade da fixação e da relação sinal-ruído dos anticorpos utilizados para detectar as proteínas de interesse. Sempre usar fixador fresco e testar novos anticorpos, com os controlos positivos e negativos adequados, antes de iniciar um conjunto de experiências. A Figura 2A mostra exemplos de bons anticorpos para um número de proteínas nucleares. A Figura 2B mostra uma example de um bom anticorpo para uma proteína citoplasmática (DAB2). A Figura 2C mostra um exemplo de uma má coloração, com baixa razão sinal-ruído, em que a amostra foi fixado para apenas 10 min. Neste caso, o anticorpo utilizado para GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) requer O / N fixação para proporcionar um sinal forte (ver 24 para os casos de embriões fixos O / N e coradas com este anticorpo). Aumentar o nível de sinal no pós-processamento revela uma imagem muito barulhento. Em contrapartida, o anti-GATA4 usado para Figura 2A (sc-9053) fornece alta relação sinal-ruído após a fixação de apenas 10 min. Detalhes sobre estes e outros anticorpos robustos são fornecidos na seção Materiais.
Os fatores limitantes para uma segmentação bons MINS são a) a ampliação da objetiva utilizada para geração de imagens, b) a resolução Z e c) a qualidade da coloração nuclear. Figura 2D mostra exemplos de embriões fotografada com um oil imersão objetiva de 40X com NA de 1,30 e uma 0,21 milímetros WD. painéis Média mostrar ampliações do ICMS, onde núcleos individuais e da fronteira entre eles podem ser distinguidos. Se não estiver usando a coloração do DNA (ie., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) valores de fluorescência para a quantificação, os parâmetros de aquisição pode ser ajustado individualmente para obter o melhor sinal. Painéis inferiores mostram como a mais avançada do embrião, quanto maior a densidade nuclear e, portanto, quanto maior a possibilidade de erros de segmentação (ponta de seta e de seta). A Figura 3 mostra exemplos de erros que MINS pode cometer, como a detecção de células apoptóticas, como células vivas ( asteriscos em painéis na Figura 3AA, Ab, Ad), o excesso de segmentação (seta e pontas de seta em Figura 3AC) ou sub-segmentação (seta na Figura 3AD). Figura 3B mostra uma sequência de Z-fatias de um evento sub-segmentação, onde duas células foram identificadas como um. Note-se como MINS segmentação converte o eixo Z em conta para o segmento que compreende um volume de todas as fatias de uma dada célula, onde está presente.
Finalmente, as especificidades da análise de dados dependerá da questão em estudo, portanto, as orientações para o processo de análise não pode ser dada aqui. No entanto, encontrámos certas transformações de dados inicial para ser útil Figura 4B -.. D mostra gráficos dos valores de fluorescência para o NANOG marcadores e GATA6 na ICM do embrião mostrado na Figura 4A Figura 4B mostra os valores de fluorescência bruto obtido a partir MINS (após correcção manual de sub- e sobre-segmentação). a figura 4C mostra os mesmos dados após uma transformação logarítmica, o que separa os valores do terreno eixos (uma transformação em raiz quadrada é também possível e produz um lote semelhante). a Figura 4D mostra os mesmos dados automaticamente após Correcting os valores para a atenuação associada-Z na fluorescência, tal como explicado no passo 4.5.2.2 do protocolo. Exemplos deste decaimento da fluorescência associada-Z são dadas na imagem na Figura 4E e as parcelas em 4F. A Figura 4G mostra o efeito da transformação de dados explicado em 4.5.2.2. Cores que representam, quer epiblasto (vermelho, NANOG +, GATA6-) ou pré (azul, NANOG-, GATA6 +) identidade foram adicionados à trama como uma função da NANOG e valores GATA6. Neste exemplo em particular, as células em que a razão de log [GATA6] / log [NANOG]> 1,25 foram considerados pre, células em que a razão de log [GATA6] / log [NANOG] <1 foram considerados PAV, e as células com um intermediário rácio foram consideradas não confirmada (nenhum neste caso). Todas as transformações de dados e gráficos de ter sido feito em rstudio, no entanto, a escolha de software não é crítica e irá depender do utilizador final.
Figura 1. Embrião Location, Timeline e Análise de Pipeline. (A) Esquema de um (de dois) horn rato uterina e os estágios de desenvolvimento pré-implantação, alinhado com a região do corno onde eles devem ser encontrados. (B) cronograma Experimental com o tempo para cada etapa. Passos do protocolo e pontos de pausa (azul) são indicados. (C) Resumo de aquisição de imagem e gasoduto análise utilizando mins. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplos de imunofluorescência e Densidade Nuclear. (A) Exemplos de bons resultados de imunofluorescência com anticorpos testados para tr nuclearfatores anscription. Anti-CDX2 foi detectado com um AlexaFluor anticorpo secundário anti-ratinho de 488 burro, anti-GATA6 com um burro anti-cabra AlexaFluor 568, anti-NANOG com um burro anti-coelho AlexaFluor 647, anti-GATA4 (Santa Cruz, SC-9053 ) com um AlexaFluor 488 burro anti-coelho e anti-OCT4 com um AlexaFluor 647 burro anti-rato. Todos os anticorpos primários são listados na Tabela Materiais. Coloração nuclear citoplasmática GATA4 é não específico, e também aparece em GATA4 embriões nulos (não mostrado). (B) Exemplo de boa imunofluorescência para uma proteína citoplasmática, DAB2. Foi detectada utilizando um AlexaFluor 488 de burro anti-rato. (C) Exemplo de má imunofluorescência, com uma baixa razão sinal-ruído para um factor nuclear. GATA4 foi detectado com um anticorpo anti-GATA4 levantada em cabra (Santa Cruz, SC-1237, e que SC-9053 (anticorpo de coelho anti-GATA4) foi usada em (A)) e um AlexaFluor 568 de burro anti-cabra. (
Figura 3. Exemplos de erros mins. (A) Sequência do Z-seções individuais a partir de um embrião mostrando exemplos de erros de segmentação mins. As células apoptóticas, no entanto, que são identificados como núcleos são marcados com um asterisco (*) nos painéis A, B e D. No painel b, ID # 39 (seta), embora muito pequeno, se identifica o núcleo correspondente e pode, assim, ser deixada sem correção. No painel c, ID # 66 (seta) se estende por dois n diferenteuclei, que por sua vez foram identificadas em separado (pontas de seta, IDs # 65 # 54 e # 53). No painel d, duas células (ID N ° 63) foram identificados como um único (ver seta marca a fronteira fina) e, portanto, esta ficha deve ser duplicado para fins de contagem de células. (B) MINS detecta as células ao longo do eixo-Z. As imagens mostram uma sequência de Z-fatias de duas células que foram erroneamente pontuados como um único ona (# 123). Note como a área azul delimitando os núcleos é contínua ao longo de Z. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Exemplo de segmentação de dados e transformações. Imagens (A) de células ICM de um blastocisto e coradas para NANOG GATA6 e instantâneo da segmentação nuclear da mesmaembrião usando minutos no canal de coloração nuclear (Hoechst 33342). (BD) valores NANOG e fluorescência GATA6 em células da ICM medidos por MINS representados como dados em bruto (B), após a realização da transformação logarítmica (C) e depois de corrigir valores para o decaimento da fluorescência ao longo do eixo Z e atribuir automaticamente as identidades de células com base no corrigido valores (D). (E - G) Exemplos de correção de dados para decaimento da fluorescência ao longo do eixo z. (E) Imagens de um blastocisto marcadas com Hoechst e anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), mostrando diminuição de fluorescência ao longo do eixo Z. (F) diagramas de dispersão dos valores de fluorescência ao longo do eixo Z para a Hoechst e AF488 para uma piscina de embriões, incluindo o mostrado em (E). A linha cinzenta representa a curva de regressão para cada conjunto de valores. (G) mesmos dados que na F após a compensação decaimento da fluorescência para cada célulausando o seguinte fator: coordenada Z * declive do modelo linear (veja o passo 4.5.2.2 no protocolo). Painéis E - G foram originalmente publicados pelos autores do Node (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Cada ponto representa uma célula. Escala = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Entrada de usuário |
| Brilho limite * (facilita a detecção nuclear em imagens difusas) |
| X Relativa resolução / YZ |
| Canal para o segmento |
| diâmetro nuclear |
| nível de ruído de imagem |
| saída MINUTOS |
| Segmentação Z-stack com nuclei IDs |
| o volume nuclear |
| coordenadas XYZ para cada núcleo |
| Média e somatório de valores de fluorescência para cada canal de fluorescência e núcleo |
| vantagens |
| segmentação precisa (> 85%) de núcleos ao longo da pilha - reconhece todas as ocorrências de um núcleo em z-secções adjacentes |
| resolução única célula |
| segmentação não supervisionada de lotes de embriões |
| pipelines de segmentação podem ser salvos e re-utilizados ou ajustados para cada embrião especificamente |
Tabela 1. Características MINS
| load Image | No prompt, introduzir a resolução relativa Z para oimagem. Ele pode ser obtido a partir do ficheiro de metadados usando o leitor padrão ou aplicando a seguinte fórmula: X (ou Y) resolução resolução / Z (todos em uM). |
| Digite o número sequencial (1-5) para o canal a ser segmentado. Usando o canal de mancha de ADN para a segmentação detectará todas as células na imagem, no entanto, outros canais podem ser segmentada também separadamente. | |
| Digite o quadro para começar a segmentação em (1 por padrão). Só se aplica a arquivos com vários prazos. | |
| Melhorar a imagem (opcional) | O ponto de imagem branco e preto pode ser ajustado para facilitar a detecção. Geralmente baixando o ponto branco e re-escalonamento de 0 - 255 (para imagens de 8 bits) ou 0-4096 (para imagens de 12 bits) fará com que a imagem mais clara e facilitar a detecção de núcleos dim. |
| detectar Núcleos | Escolha o diâmetro nuclear estimado (geralmente entre 30 e 40 px em blastocistos). |
| Para imagens com ruído o nível de ruído pode ser ajustado. Caso contrário, o valor padrão será aplicada. | |
| segmento Núcleos | Use parâmetros padrão. |
| Classifique Núcleos | MINS pode distinguir trofectoderma (TE) a partir de células de massa celular interna (ICM) em embriões pré-implantação com base na posição. Isto também pode ser feito manualmente ou com base em níveis de fluorescência se um marcador TE é usado. |
| Os resultados de exportação | Selecione os arquivos a serem gerados: |
| - Segmentação coberto sobre o canal utilizado (.tiff ficheiro de sequência), | |
| - Segmentação única (arquivo de seqüência .tiff), | |
| - Planilha com IDs para todas as células detectadas, coordenadas XYZ e os níveis de fluorescência (média e soma) para todos os canais para cada célula (.csv). | |
| Todos os arquivos exportados por padrão. Os arquivos são salvos no sdirectório ame onde as imagens estão localizados. |
Tabela Segmentação Pipeline 2. MINUTOS
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Discussion
O presente protocolo descreve um método para realizar uma análise quantitativa de toda mount-imunofluorescência na pré-implantação embriões estágio do mouse. Um protocolo de imunofluorescência robusta 22 é seguido de alta resolução, todo-mount imagem confocal e por segmentação de imagens usando um pedaço sob medida de software 4. Embora a escolha do protocolo de imunofluorescência não é crítica, nós encontramos o apresentado aqui 22 para ser rápido, fiável e para fornecer sinal robusto para muitos dos anticorpos nós testamos. Outros protocolos podem ser seguidas, desde que o seu pedido é consistente em experiências equivalentes. Embora muitos fatores afetam o resultado de cada experiência individual e comparação direta entre as experiências não é necessariamente possível, descobrimos que esforçando-se para a consistência entre repetições e realizar repetições técnicos suficientes reduz bastante variabilidade. Portanto, uma vez otimizado, fixação e immunolabelinreagentes e protocolos de g, bem como condições de imagem deve ser mantida constante entre experiências equivalentes.
Os principais problemas que possam surgir durante a aplicação deste protocolo queda em dois grupos: 1) coloração de má qualidade, com o sinal fraca, e 2) de segmentação abaixo do ideal, com muitos erros (ou seja, sobre e sub-segmentação). imunofluorescência baixa qualidade é geralmente devido à fixação inadequada das amostras ou para os anticorpos não ser adequado para toda montagem de imunofluorescência. Assegurar PFA é fresca (quer preparada de fresco ou descongelado até à temperatura ambiente de -20 ° C não superior a uma semana antes). Dado o pequeno tamanho de embriões pré-implantação, 10-min em PFA a fixação deve ser suficiente. No entanto, descobrimos certos anticorpos para se obter um sinal mais forte com períodos de fixação mais longos (ver Materiais). Se um anticorpo que foi testado anteriormente fornece sinal fraco, tente diferentes protocolos de fixação. Nem todos os anticorpos desempenho robusto em conjunto de montagem immunofluorescence e a escolha do anticorpo primário é crítico para os resultados da experiência. Novos anticorpos deve ser testado em embriões e a concentração óptima determinada empiricamente. No gráfico Materiais nós fornecemos detalhes de um anticorpos número Nós testamos e usam rotineiramente. Consulte a literatura publicada ou para informações do fabricante ao considerar novos anticorpos. Note-se que nem todos os anticorpos adequados para o trabalho de Western blot em imunofluorescência conjunto de montagem, e as concentrações necessárias para imunofluorescência podem ser até uma ordem de grandeza mais elevada. anticorpos secundários comerciais geralmente funcionam bem para fora da caixa, no entanto, ser consistentes no uso de combinações de anticorpo primário-secundário ao longo equivalentes experiências que vão ser comparados.
A qualidade de segmentação da imagem depende tanto da qualidade da coloração nuclear e da densidade nuclear na ICM do embrião. Sempre se esforçar para brilhante,núcleos afiados e usar um objetivo de alta resolução (40X ou mais). Se o sinal de corante nuclear é baixo, usar uma nova porção ou um novo lote. Desde que o corante nuclear não é utilizado para quantificação, os parâmetros de aquisição pode ser ajustado para cada embrião, a fim de registar, núcleos brilhantes afiadas. Da mesma forma, se um canal diferente da coloração nuclear é usado para a segmentação, a relação sinal-ruído de canal particular que vai determinar a qualidade da segmentação. blastocistos fase tardia (E4.0 em diante) apresentar uma densidade nuclear muito alta dentro do ICM. Portanto, é nestas fases que a coloração de alta qualidade é mais crítico. No entanto, os erros de segmentação terá lugar na maioria das vezes nestes estágios. Introduzir o diâmetro nuclear estimado eo nível de ruído de imagem no gasoduto MINS, explore o resultado de cada etapa usando o botão "Ver" e ajustar os parâmetros até que seja obtido um resultado satisfatório. Use os parâmetros que produzem o melhor segmentaçãoe erros de corrigir manualmente durante o processamento de dados. Note-se que embriões em estágio final (~ E4.5) têm uma contagem de células de alta e correção de dados manual será demorado.
As limitações deste protocolo são determinadas pelo sistema de microscópio confocal usado para aquisição de imagem. Como discutido, usar um objectivo de grande ampliação, com uma distância de trabalho que permite a imagiologia do eixo Z de todo o embrião (embriões de ratos pré-implantação pode atingir até 150-160 um de diâmetro). Da mesma forma, o número de epitopos que podem ser detectadas será determinada pelo número de canais do microscópio pode adquirir de uma só vez. Usando este protocolo, três epítopos diferentes, além do ADN (4 canais no total) podem ser rotulados simultaneamente em cada amostra. Assegurar o instrumento é calibrado para cada canal de fluorescência, a supressão é optimizada e que a saída de laser é consistente.
Os métodos aqui descritos permitem a análise da posição da célula ao longo doEixos XYZ, bem como a quantificação dos níveis de expressão de proteínas in situ, para cada célula em blastocistos de ratinho. Em nossa experiência, métodos alternativos que utilizem qualquer outro software disponível não pode fornecer o nível de resolução que o gasoduto aplicada neste protocolo pode (veja 4 para uma comparação direta com outras ferramentas). A densidade nuclear alta encontrada no ICM do blastocisto faz com que outras ferramentas para gerar tantos erros que a extensão da correção manual exigidas torna o seu uso impraticável. Alternativamente, contagem de células e de fluorescência medidas manuais foram anteriormente utilizados para subconjuntos de células ou de regiões definidas da embrião 10,11,18,19,24. No entanto, a contagem manual e medição de todos os canais de fluorescência e a posição da célula, em todos os eixos XYZ, para as dezenas de células presentes em cada embrião seria tão demorado que não iria permitir a análise de alto rendimento para a qual o nosso protocolo foi concebido . Além disso, um manualvaliação de níveis de fluorescência é propenso a polarização, enquanto uma tubagem tal como o aqui descrito permite uma medição objectiva de intensidades de fluorescência para a determinação subsequente da identidade da célula. Para atribuir identidades celulares, o pesquisador deve estabelecer um critério padrão a ser aplicado em todas as amostras para um experimental particular, configurar. Tendo em conta os diferentes fatores - biológicos e técnicos - que podem afetar o resultado da imunomarcação, este critério deve ser determinada através de experimentos de controlo adequados e dados anteriormente publicados, sempre que possível. Nós prevemos um futuro próximo, onde um algoritmo pode ser projetado para a determinação automática de identidade da célula independentemente do experimento. No entanto, uma tal ferramenta só virá de aplicação mais frequente e a melhoria do método actual, provavelmente em conjunto com algoritmos de aprendizagem automática.
Finalmente, dada a simplicidade deste gasoduto ea morfol estereotipadagia de embriões pré-implantação do rato, este protocolo é facilmente escalável para a análise de grandes números de embriões, permitindo assim que análises de elevado rendimento de fenótipos nulos, 5,6 ou qualquer outra manipulação experimental 7. Finalmente, embora o protocolo atual foi projetado e otimizado para a análise de embriões de ratos pré-implantação e colônias do CES, não vemos razão a priori por que ele não poderia ser aplicada a outros sistemas com características semelhantes - densidade nuclear ou seja elevado. Nós incentivar outras pessoas a experimentar e adaptar este protocolo para outros cenários e fornecer feedback para o seu aperfeiçoamento futuro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
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