Summary
Bu protokol Fare preimplantasyon embriyolar soy özellikleri çalışma protein ekspresyonu in situ analiz kantitatif, tek hücreli gerçekleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. blastosist toplanması için gerekli işlemler, proteinlerin immunofluorescent algılama tüm montaj, bir konfokal mikroskop ve nükleer segmentasyon ve görüntü analizi örneklerin görüntüleme açıklanmıştır.
Abstract
Bu protokol, bir yöntem olup sayısal gerçekleştirmek için sunulur, yerinde tek hücre hattı özellikleri çalışma protein ekspresyonu analizi Fare preimplantasyon embriyolarında. Embriyo toplama, immünofloresans, bir konfokal mikroskop görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ve analiz için gerekli işlemler anlatılmaktadır. Bu yöntem, çoklu nükleer belirteçler ifade ve mekansal (XYZ) ve niceleme embriyo tüm hücrelerin koordinatları verir. Bu DAKİKA, özellikle preimplantasyon embriyo ve embriyonik kök hücre (ESC) kolonilerin konfokal görüntülerin analizi için geliştirilmiş bir görüntü bölütleme yazılım aracı yararlanır. MINS X, Y ve Z boyutları arasında denetimsiz nükleer segmentasyonu yürütmektedir ve az kullanıcı girişi ile tüm kanallar için üç boyutlu uzayda hücre konumuna ilişkin bilgiler, yanı sıra nükleer floresan seviyeleri üretir. Bu protokol, görüntü analizi için optimize edilmiş olsa dapreimplantasyon sahne fare embriyoları, kolayca iyi bir sinyal-gürültü oranı ve nerede yüksek nükleer yoğunluk (görüntü segmentasyonu bir engel teşkil örn., embriyonik kök hücre ifade analizini gösteren başka örneklerin analizi (ESC adapte edilebilir ) koloniler, kültür hücreleri, diğer türleri veya aşamaları, vb) arasında embriyolar ayırt.
Introduction
Fare preimplantasyon embriyo hücresi kaderi tarifnamede ve memelilerde de-novo epitelizasyonu çalışma için ortaya çıkışı ve in vivo pluripotensin idamesinde, hem de bir model çalışma için bir örnektir. ve iki extraembryonic soy, trofoektoderm (TE) ve - en somatik doku ve germ hücreleri yol açmaktadır - memeli gelişim preimplantasyon aşamaları blastosist, yani pluripotent epiblast oluşturan üç hücre soylarının kurulması için varız ilkel endoderm (PrE) (Şekil 1A) 1,2. Bu protokol, (2), ilgilenilen proteinleri etiket immünofloresan gerçekleştirmek (3) z-kesit yetenekleri ile bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme monte tam yürütmek (1) hasat ve düzeltmek preimplantasyon sahne fare embriyoları prosedürleri açıklamaktadır (4) konfokal görüntüleri ve sonraki kantitatif görüntü analizleri nükleer segmentasyon gerçekleştirin. Bu boru hattı t veriyorO yerinde hücrelerin subpopülasyonunun karakterize hücre kimliklerin atama için protein düzeylerinin ölçülmesi tarafsız. Veri analizi (Şekil 1B) embriyo toplama, (genellikle 10 fare embriyoları kadar) tek bir çöp için 4 gün - Bu protokol az 3 olarak yapılabilir. Birkaç litre eşzamanlı analizi böylelikle protokol genel uzunluğu boyunca uzanan, görüntüleme ve veri analizi zaman yükünü artıracaktır.
Preimplantasyon sahne fare embriyosu kendi küçük boyutlu ve basmakalıp morfoloji 3 verilen tek hücreli çözünürlüğe sahip hücresel süreçlerin toto görüntüleme için çok uygundur, bir deneysel uysal bir sistemdir. Embriyoların istatistiksel ilgili sayısının tarafsız, sistem düzeyinde analiz yürütmek için, otomatik, kantitatif analiz boru hattı arzu edilir. Ancak, iç hücre kütlesinden yüksek nükleer yoğunluk blastosist (ICM) nedeniyle (
Burada sunulan analiz boru hattı MATLAB tabanlı görüntü bölütleme aracı Modüler İnteraktif Nükleer segmentasyon (DAK) 4 etrafında döner. MINS pKullanıcı bir grafik kullanıcı arayüzü (GUI) (Tablo 1) 4 kullanılarak, görüntü özellikleri az sayıda kurmuştur sonra konfokal Z-yığınlarının büyük gruplar üzerinde denetimsiz nükleer segmentasyon erforms. Bu boru hattı, hem vahşi tip protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu yüksek kapasiteli veri üretimi için verimli olduğu kanıtlanmıştır, deneysel tedavi ve genetik embriyolar ve EKH 5-7 güncellenmiştir. Mevcut protokol, preimplantasyon aşamalı embriyo görüntüleri segmentasyonuna DAKİKA uygulanmasını açıklar. EKH üzerinde MINS performans örnekleri için 4,7 bakınız. Otomatik nükleer segmentasyon adım ölçüde, mekansal ve floresan yoğunluğu ölçümleri embriyoda hücre kimliklerin tarafsız bir kararlılık ve gen ifadesi etki ve hücre pozisyonunun üç boyutlu haritalarının oluşturulmasına izin oysa (Şekil hücre tanımlaması sürecinin zaman yükünü azaltır 1C 5,6 embriyoların büyük kohortlar aracılığıyla bireysel litre analizine de uygulanabilir hale getirir. DAK (yazılım MATLAB lisans gerektirir) http://katlab-tools.org de serbestçe kullanılabilir.
Bugüne kadar geliştirilen hiçbir yaklaşım fare preimplantasyon embriyolar protein ekspresyonu ve hücre lokalizasyonu gibi derinlemesine veri üretimi sağlar. Tüm girişimleri bugüne kadar bu tür verileri miktarının manuel belirlenmesi ve farklı popülasyonlar için hücre sayıları kantitatif embriyoda (ya tamamen elle veya yazılım destekli) 9-19 sınırlı olmuştur. (DAK yazılımını içeren) Bu yaklaşım için özel ve fare preimplantasyon embriyoları ve EKH üzerinde test edilmiştir; yine yüksek nükleer yoğunluklu diğer sistemlerde performansı, henüz denenmemiş olsa da, eşdeğer olması bekleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik deyimi: Tüm hayvan çalışmaları, hayvancılık, damızlık ve kurban olmak üzere Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), protokol # 03-12-017 tarafından onaylandı.
1. Embriyo Koleksiyon
Tüm hayvan çalışmaları, kurumsal ve yerel otoriteler tarafından onaylanmış olması gerekir ve yerel ve kurumsal kurallarına uygun Not:.
- İstenilen genotip verimli bir damızlık erkek ile bir bakire kadın fare Mate.
Not: estral döngünün östrus fazında kadın seçerek, doğal çiftleşmesi kurma istenen tarihte çiftleşme şansını artırır. Superovulasyon uyaran olursa, 20'de tarif edilen protokollere başvurun. - künt prob kullanılarak sabah vajinal fiş varlığını kontrol edin. copulation fişleri gün boyunca kayıp İdeal olarak, öğlen (12:00) önce bunu. noo düşününVajinal fişi embriyonik gün (E) 0,5 tespiti n.
- İstenilen gün ve embriyonik gelişim zamanına, M2 veya RT'ye yıkama tutan orta (FHM) veya tercihen 37 ºC ısıtın. Not: her iki M2 veya FHM yıkama ve taşıma embriyolar için kullanılabilir. Kullanılmadığı zaman, 4 ° C'de bu medyayı saklamayın. Her bir uterusa için ortamın yaklaşık 2 ml kullanımını tahmin.
- Çözülme dondurulmuş% 4 paraformaldehit (PFA), fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da taze solüsyon hazırlanır. 4-iyi levha başına% 4 PFA çözeltisi 500 ul tahmin. 4 oyuklu plakanın her bir ilgili bir çöp düzeltildi. Not: Alternatif olarak, 96 oyuklu bir plaka düzeltmek ve saklamak embriyolar için kullanılabilir. 96 oyuklu bir plaka kullanılması durumunda, 100 PFA çözeltisi ul oyuk başına kullanımı.
- ucundaki kılcal ucunu çizmek için açık alev kullanılarak cam Pasteur pipeti çekin.
- Yerel ve kurumsal düzenlemelerin gerektirdiği, ya da servikal dislokasyon veya CO 2 inhalasyon yoluyla kadın Kurban. Genellikle desirabl olduğue servikal dislokasyon ile hayvan ötenazi onaylayın.
- saç dökülmesi en aza indirmek ve iç organları ortaya çıkarmak için, ilk deri yoluyla ve daha sonra gövde duvarı (periton) üzerinden, karın bölgesi gerçekleştirmek için% 70 etanol ile hayvanın karın püskürtün.
Not: Aşağıdaki adımlar E3.25 ve E4.5 (Şekil 1A) arasında herhangi bir aşamada hamile bir kadın fare rahim blastokistlerle toplamak için prosedürü açıklar. Daha önce E3.25 daha preimplantasyon embriyoların toplanması ile ilgili protokoller için, 20 bakın. - rahim bulun ve hayvan kaldırmak. Forseps bir çift ile uterusun servikal ucunu tutarak, serviks kesti ve her ikisi de rahim boynuzları germek için yavaşça yukarı çekin.
- rahim duvarına delmek için özen rahim yağ Trim. hala hayvanın vücuduna bağlıyken rahim uzanmış olabilir gibi bu, kaldırma sırasında kolayca yapılabilir. Alternatif olarak, buRT PBS içinde, bir teşhir mikroskopu altında, daha sonra yapılabilir. Rahim diseksiyon konusunda daha ayrıntılı bir protokol için, bkz Protokolleri 5 ve 8 20
- yumurta kanalı üzerinde kes, yumurtalıkların altında, bir petri üzerindeki tüm rahim, yer bırakmak için ve PBS ile kaplayın.
Not: Bu adım aynı zamanda sonraki blastosist hasat kolaylaştırır rahim, aşırı kan veya diğer enkaz yıkama imkanı sunuyor. - serviksin her iki tarafta, proksimal sonuna kadar kesme ve serviks atmak tarafından ayrı hem de rahim boynuzları. Onları (Şekil 1A) bağlayan berzah altında keserek rahim her yumurtalık ayırın. Embriyo toplama ve manipülasyon için manipülasyon ortamı (M2 veya FHM ya) bir damla her iki boynuzları aktarın.
- Diseksiyon mikroskobu altında, rahim dışına ve 0.5 zorlayarak ortama gömme blastosist - servikal açıklık her uterin boynuz aracılığıyla M2 veya FHM 1 ml. Bir 1 kullanınBir hipodermal iğne ile ml'lik şırınga. Not: Bu kritik olmamasına rağmen iğne, uterus yırtılmasını önlemek için bir dosyalama taş kullanılarak körelmiş olabilir. Rahim yıkama için ayrıntılı bir şema 21 bulunabilir.
- orta damla dağılmış olacak blastokistlerle bulun, diseksiyon mikroskobu kullanarak. blastosist kızarma sonra çanak dibine çöker için 2 dk - 1'e kadar bekleyin. Bir kılcal ucu ile ağız kontrollü, cam Pasteur pipeti kullanarak, tüm blastokist toplamak ve medya taze damlasına kadar aktarın.
- Taze M2 veya FHM 3 damla - 2 ile taşıyarak blastokistlerle durulayın. Bir seferde 10 blastosist - 5 gruplar halinde embriyolar taşıyın.
Not: sürecini hızlandırır herhangi bir zamanda büyük gruplar Hareketli, ama aynı zamanda yanlışlıkla birçok embriyolar kaybetme şansını artıracaktır. Embriyo manipülasyon ve transferi pratik, ağız kontrollü pipetler kullanımında eğitimsiz eğer b önce dikkate alınması gerekenDenemeyi eginning. - kısaca asitli Tyrode çözüm onları yıkayarak çıkmamış blastokist Zona pellucida (ZP) (genellikle <E4.0) çıkarın. En kısa sürede ZP artık görünür olduğu gibi manipülasyon medya geri blastosist transfer. Sadece hücrelere zarar görmesini önlemek için, sürece kesinlikle gerekli olduğu için asit Tyrode en embriyolar tutun.
- Köreltilmiş blastosist işlerken onlar cam ve plastik yüzeylere çok kolay yapışır gibi özen gösterin. Manipülasyon orta eki önlemek için sığır serum albümin (BSA) 4 mg / ml içerir, ancak asit Tyrode ya da PBS do Dolayısıyla, hasar veya embriyoların kaybı riskini azaltmak için en fazla 2 pick up yok değil - 5 soyulmuş blastokistlerle Aynı anda BSA içermeyen veya serumsuz PBS veya asit Tyrode bunları işlenirken.
Not: Alternatif olarak, kaplama, kullanımdan önce,% 1 BSA ile bir cam pipet cam yüzeyine embriyo yapışmayı azaltmak için.
- Köreltilmiş blastosist işlerken onlar cam ve plastik yüzeylere çok kolay yapışır gibi özen gösterin. Manipülasyon orta eki önlemek için sığır serum albümin (BSA) 4 mg / ml içerir, ancak asit Tyrode ya da PBS do Dolayısıyla, hasar veya embriyoların kaybı riskini azaltmak için en fazla 2 pick up yok değil - 5 soyulmuş blastokistlerle Aynı anda BSA içermeyen veya serumsuz PBS veya asit Tyrode bunları işlenirken.
- Coat her bir alt% 1 agar ince bir tabaka ile, bir 4-yuvalı doku kültürü çanağı içinde,% 0.9 NaCI plastik yapışmasını embriyolar önlemek için. Alternatif olarak, 4 mg / PBS (PBS-BSA) BSA'nın ilave edin.
- RT, PBS (ya da PBS-BSA) 500 ul ile kaplanmış 4-yuvalı doku kültürü çanağı bir kuyu ve PBS içinde% 4 PFA bir kuyu 500 ul doldurun.
- RT PBS blastosistler durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA düzeltin. tespit sonrasında PBS (veya PBS-BSA) aktarın.
- Embriyolar hemen işleme olacak değilseniz, (örneğin kurumasına yol açar) buharlaşmasını önlemek ve 4 ºC de plaka saklamak için mineral yağ tabakası ile embriyoları içeren PBS kapsamaktadır.
Not: farklı tespit yöntemleri ve katı deneye bağlı olarak kullanılabilmektedir, ilgi konusu epitopları ve antikorlar kullanılır. eşdeğer deneyler boyama sonuçlarının sonraki karşılaştırmayı kolaylaştırmak için boyunca seçim Hangi yöntemi tutarlı olmak.
Not: Pausenoktası: Embriyolar bir sonraki aşamaya geçmeden önce, birkaç hafta kadar PBS içinde 4 ° C'de saklanabilir. PBS, steril olduğundan emin olun ve / veya 100 U / ml ekleyin penisilin + 100 ug / ml streptomisin (LTR yükseltici) durumunda (PBS-BSA kullanılarak özellikle) bakteriyel kontaminasyonu önlemek depolama uzun süreli görerek eğer.
2. İmmünofloresan
- önceden test edilmesi ve tüm montaj imüno sağlam olduğu kanıtlanmıştır herhangi bir protokol kullanılarak immünofloresans gerçekleştirin. Not: 22 ve 11'de tarif edilenler önerilir. Bu yazıda eski tarif edilecektir. eşdeğer deneyler boyama sonuçlarının karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için boyunca seçim Hangi yöntemi tutarlı olmak.
- immünofloresan protokol ardışık aşamaları gerçekleştirmek için, esnek, polivinilasetat, berrak, U tabanlı, 96 oyuklu plaka kullanınız. 50 ile her iyi doldurun - çözümün 100 ul ve bir çözüm embriyolar taşıyınBir L şeklindeki ağız pipet kullanarak başka. Bu yaklaşım reaktiflerin kullanımını en aza indirir ve izleme adımları yanı sıra çok sayıda deney grupları paralel boyama kolaylaştırır unutmayın.
- İsteğe Bağlı: Kat% 1 agar ince bir tabaka ile kuyu alt% 0.9 NaCI plastik embriyo yapışmasını önler. immünfloresans çözümleri BSA katmayın.
- PBX (PBS içinde% 0.1 Triton X-100) hazırlanması. Birkaç immünofloresan deneyleri performansını tahmin ederse, deneyler arasında 4 ºC de PBX ve mağaza 50 ml hazırlamak.
- permeabilizasyon çözeltisi (% 0.5 Triton X-100, PBS içinde 100 mM glisin) hazırlayın. 1 ml (ya da hangisi tutar gerekli) her bir deney için taze permeabilization solüsyonu olun.
- bloke etme çözeltisi (% 2 at serumu (HS) ve% 20 fetal bovin serumu, PBS içinde Pen-Strep (FBS)) hazırlayın. deneyler arasında 4 ° C'de 10 ml ve mağaza hazırlayın.
- Herhangi bir fark arasındaki gözlenmiştir yaSerum türü, ancak, eş deneyler için kullanılan çözelti bloke seçiminde tutarlı.
- PBX oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için sabit embriyolar yıkayın.
- permeabilizasyon çözeltisi içinde, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için embriyolar geçirgenliği.
- PBX oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (~ 100 | il) için embriyolar yıkayın.
- bloklama çözeltisi ~ 100 ul 30 dakika oda sıcaklığında HR 1 için blok embriyolar. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
Not: Embriyolar O kadar / fark iyileştirme veya zarar vermeden 4 ° C'de N dönemleri 30 dakika bloke adımlara kıyasla için bloke edilebilir. - primer antikor 4 ° C'de embriyolar O / N inkübe / antikorlar çözeltisi (~ 100 ul) engelleme seyreltilmiş. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
- daha önce her birincil antikor için optimum seyreltme oranını belirler. d BkzAntikorların, bir dizi test dilüsyonları için iscussion ve Malzeme bölümü.
- O / N inkübasyondan sonra, embriyolar PBX oda sıcaklığında her biri 5 dakika (~ 100 | il) için 3 kere yıkayın.
- bloklama çözeltisi ~ 100 ul 30 dakika oda sıcaklığında HR 1 için blok embriyolar. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
- bloklama çözeltisi ~ 100 ul 4 ug / ml'de seyreltilmiş ikincil antikor / antikorlar 4 ° C'de 1 saat ila 2 embriyolar inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
- Durulayın embriyolar PBX oda sıcaklığında her 5 dakika boyunca 2x.
- Tercih DNA leke embriyolar taşıyın. Hoechst 33342 kullanılıyorsa, PBS içinde 5 ug / ml'ye seyreltin. Buharlaşmayı önlemek ya da nemli bir oda içinde tutmak için mineral yağ tabakası ile çözelti örtün.
Not: noktasını Pause: embriyolar hemen görüntülü değilseniz, onlar u tutulabilirNükleer boyama çözeltisi içinde birkaç hafta s. Bu durumda, PBS, steril sağlamak ve / veya bakteri gelişimini ve kirlenmeyi önlemek için Pen-Strep ve sodyum azid ilave edin.
3. Konfokal Görüntüleme
Not: Bireysel konfokal mikroskop yapılandırmaları yerinde sistem ve yazılım için ayarlanabilir özel toplama parametreleri gerektirir. Ancak, aşağıdaki bölümde verilen herhangi bir kurulum için geçerli olmalıdır takip etmek, genel kurallar kümesi sağlar.
- ince bir ağız pipet kullanarak, PBS veya 35mm cam alt çanak cam yüzeyinde nükleer leke çözümün mikrodamla yapmak ve madeni yağ ile kaplayın. Bir alternatif olarak, embriyolar zarar görmesini önlemek ve bir cam mikroskop slayt ile karşılamak için silikon ayırıcı ile normal bir lamel kullanın. Not: Normal lamel kullanırken, embriyolar daha sonra yeniden konumlandırılmış veya genotipleme için geri alınamaz, bu nedenle şiddetle cam alt kullanımını tavsiyeyemekler.
- Yeri mikrodamla embriyolar ve tercihen cam yüzeyine ICM-kavite eksenine paralel, tutarlı bir şekilde düzenlemek. mikroskop tutucu çanak ayarlayın. Not: lazer tarama konfokal mikroskoplar elde Görüntüler floresan yoğunluğu bir Z ekseni ilişkili kaybı muzdarip. Bu nedenle düzenleme, tutarlılık farklı embriyo eş bölgeler arasındaki yoğunluklarının karşılaştırılması için önemlidir.
- gen ifadesini değiştirebilir tedavi herhangi bir tür tabi olmamıştır vahşi tip embriyolar kullanılarak referans parametrelerini ayarlayın.
- MINS aracını kullanarak 4 doğru segmentasyon kolaylaştıracak verileri elde etmek amacıyla yüksek büyütmeli objektif (yani, 40X veya üstü) kullanarak görüntüleri elde edin.
Not: Dk kullanarak segmentasyon için yeterli çözünürlüğe kadar görüntü vermeyecektir 20X objektif dijital zoom özelliğinin kullanılması. Olması gerektiği gibi bir de, amacın çalışma mesafesi (WD) dikkat etmelisiniztüm blastosist yayılan bir Z-yığını böylece uzun bir WD edinilmesine imkan sağlayacak şekilde yeterli (~ 130-150 mikron) amacı genellikle gereklidir. Şekil 2'de gösterilen görüntüler - 4 210 mikron çalışma mesafesi ile 40X / NA 1.30 immersiyon yağı hedefi kullanılarak elde edildi. - fluorophores ağartma olmadan güçlü bir sinyal-noyz oranı temin düşük lazer çıkışını kullanın.
- kazanç ayarlayın ve örnek boğulmadan geniş dinamik aralık elde etmek ofset. görüntüleri açığa en karşılamak ya da tüm gri skala aralık görüntüleri arasında yoğunluk küçük farklılıkların tespiti kolaylaştıracaktır span.
- Z ekseni çözünürlükte DAKİKA ile doğru segmentasyon için kritik olduğundan, küçük bir (1 mikron) Z-adım kullanın.
Not: XY boyutları nükleer segmentasyon işlemi, sadece görüntü dosya boyutunu etkilemez. Genellikle, 512 x 512 piksel compromi olmadan yayın kalitesinde görüntüler için yeterli bir XY çözünürlüksabit disk alanı şarkı. - Kritik adım: örnekleri karşılaştırmak mümkün olacak şekilde içinde ve aynı deney görüntüleme oturumları tutarlı parametreleri görüntüleme tutun.
- MINS aracını kullanarak 4 doğru segmentasyon kolaylaştıracak verileri elde etmek amacıyla yüksek büyütmeli objektif (yani, 40X veya üstü) kullanarak görüntüleri elde edin.
- Embriyoların toplu Görüntüleme:
- tek seansta görüntü tutarlı gruplar (ibrelerin, deneyler) mümkün olduğunca.
- Aynı deney çoğaltır için içinde ve görüntüleme oturumları tutarlı parametreleri tutun.
- (Tüm Z eksenine) boyunca görüntü embriyolar her hücreyi yakalamak için.
Not: İstenirse 23 de tarif edildiği gibi, embriyo genotipleme görüntüleme sonra yapılabilir. içiçe geçmiş PCR için ihtiyaç ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir ve analiz edilecek yeri ve kullanılan primerler bağlıdır.
- geriye dönük görüntüleri embriyolar maç muktedir emin olun.
4. Görüntü Analizi ve Veri Ön işleme
- Yükleme ve http dakika 4 yükleyin: // Katlab-tools.org (MATLAB lisans gereklidir).
- görüntü bölümleme gerçekleştirin:
- Konfokal resim yüklemek veya sabit diskten yığını, çekirdekler ve segmenti görüntüsünü tespit DAKİKA grafik kullanıcı arayüzü (GUI) izleyin. Mikroskobu (.lsm, .lif, .oif, vs.) tarafından üretilen ham verilerin tamamı Z-yığını yükleyin. Http://katlab-tools.org ve 4 üzerinde bulunan her adımda ilgili ayrıntılar ve talimatlar için Tablo 2'ye bakınız. Tamamlandığında, karşılık gelen 'Görünüm' butonuna tıklayarak her adımın sonucunu görmek. düğmesinin üzerinde sarı etiket yeşil etiket işlemi tamamlandıktan gösterir süreçte işlemi gösterir.
Not: MINS halen dizileri ya da multi-pozisyon dosyaları .tiff, .czi dosyalarını desteklemez - her Z-yığını bağımsız bir dosya olması gerekir. - tatmin edici bir segmentasyon sonra, diğer embriyolar veya litre için direkt olarak kullanılabilir, böylece oluşturulan boru hattı kaydedin.
- Konfokal resim yüklemek veya sabit diskten yığını, çekirdekler ve segmenti görüntüsünü tespit DAKİKA grafik kullanıcı arayüzü (GUI) izleyin. Mikroskobu (.lsm, .lif, .oif, vs.) tarafından üretilen ham verilerin tamamı Z-yığını yükleyin. Http://katlab-tools.org ve 4 üzerinde bulunan her adımda ilgili ayrıntılar ve talimatlar için Tablo 2'ye bakınız. Tamamlandığında, karşılık gelen 'Görünüm' butonuna tıklayarak her adımın sonucunu görmek. düğmesinin üzerinde sarı etiket yeşil etiket işlemi tamamlandıktan gösterir süreçte işlemi gösterir.
- Toplu Modu segmentasyon:
Not: Single dosyaları tek tek segmentlere edilebilir. Ancak, çöp veya deney içinde embriyolar genellikle karşılaştırılabilir aşamanın olduğu göz önüne alındığında, DAK gözetimi olmaksızın onlardan bir grup tek bir görüntü için oluşturulan segmentasyon boru hattı uygulayabilirsiniz.- Toplu Modu Çalıştır menüsünden, 'dosyaları ekleyin' ve tüm dosyalar tek seferde işlenecek yükleyin. Not: Farklı kaynaklardan gelen dosyalar segmentasyon kuyruğuna eklenebilir.
- 'Toplu-Mode Çalıştır başlatın' ve dosyaları işlemek için yazılım için zaman tanımak tıklayın. Not: Segmentasyon çıkışı orijinal dosyaların bulunduğu aynı dizine kaydedilir.
- Segmentasyon değerlendirme ve manuel düzeltme
Not: çok yüksek hassasiyet (>% 85) ile DAK bölümleri görüntüler, ancak, boyama ve görüntüleme kalitesi yanı sıra embriyo aşamasında, DAK performansını etkileyebilir. Genellikle, embriyonun içinde yüksek nükleer yoğunluk, daha büyük olasılıkla segmentasyon hataları Plac alacakE (Şekil 2B, 3). Böylece, segmentasyon doğruluğu her bir örnek için değerlendirilmeli ve gerekirse elle düzeltilmiş. hatalar iki tür tipik oluşur: segmentasyon-over ve altında segmentasyon.- aşırı segmentasyon çözümleniyor:
- Yanlış pozitif tespit - sağlam çekirdekler olmayan apoptotik veziküller (Şekil 3A, B, D, yıldız) ya da diğer elemanları, fakat dakika ile örneğin, tanımlanmış olabilir.
Not: Genellikle bu tür yanlış pozitif reel çekirdekleri daha küçük boyuta sahip ve vakaların çoğunda, kolayca tespit edilebilir ve e-tabloda sıralanmış olabilir. Küçük, ama geçerli parçalı hacim (Şekil 3A b ok başı) sonuçlanan çekirdekler sadece kısmen parçalanmış olabilir çoğu zaman Ancak, görsel muayene şiddetle tavsiye edilir. - * Statistics.csv dosyasından yanlış pozitif için ilgili kayıtları silin. Orijinal * istatistiklerini koru.csv ileride ve düzenlemek bunun sadece bir kopyası dosyası.
- Parçalara aşırı ve 2 veya daha fazla çekirdeklerin (Şekil 3A c, ok ve ok uçları) olarak sunulan, ya onların yoğunluk seviyesini ortalamasını alarak kayıtları birleştirmek veya benzer ise, o hücre için kayıtların bir tutmak ve atın bir çekirdek olmuşsa Gerisi.
- Yanlış pozitif tespit - sağlam çekirdekler olmayan apoptotik veziküller (Şekil 3A, B, D, yıldız) ya da diğer elemanları, fakat dakika ile örneğin, tanımlanmış olabilir.
- altında segmentasyon çözümleniyor:
- DAK, iki ya da daha fazla çekirdek arasındaki sınırı tespit etmek için başarısız oldu ve bunun sonucu olarak, tek bir çekirdeği olarak bölümlenmiş olan Etkinlikleri (Şekil 3A d ok ve 3B). Not: ölçülmüş seviyeleri birleştirilmiş hatalı olan hücrelerin ortalaması olacaktır ve farklı soyları hangi ait edilebilir Bu, protein düzeylerinin ölçülmesi için, doğru bir hücre sayımı için bir problem teşkil etmektedir, ancak daha da önemlisi.
- MINS tamamen çekirdeği tespit etmek için başarısız oldu olayları belirlemek.
- Bu gibi durumlarda (4.4.2.1 ve 4.4.2.2) olarak, f ortalama gri düzeylerini ölçmekveya her bir ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) gibi alternatif bir alet az ya da un segmentli hücre (ler) de bir kanal, ve doğru seviyeleri ile hatalı kayıt değiştirin. İleride başvurmak için orijinal * statistics.csv dosyayı korumak ve bunun sadece bir kopyasını düzenleyin. ImageJ kullanarak Bunu yapmak için şu adımları izleyin:
- Sanal yığının ( 'Dosya'> 'Al'> 'TIFF sanal yığını ...') olarak DAKİKA tarafından oluşturulan karşılık gelen * overlaid.tiff dosyası ImageJ alakalı çok kanallı yığını açın ve ithal.
- az ya da un-dilimli çekirdeğin medial bölümünü bulun.
- serbest seçim aracını kullanarak DNA leke kanalında az ya da un-dilimli çekirdeğin çevresini özetlemektedir.
- Basın Crl + M (Macintosh Cmd + M) veya Analiz menüsüne gidin ve 'Tedbir' seçeneğini seçin. Bu eylem belirtilen alan için ortalama gri değerini kaydeder ve yeni bir pencerede gösterecektir. > 'Analiz' git9; Set ölçümleri ... 've emin olun' seçildiğinde 'gri Ortalama değer. başka parametreleri seçin ölçülecek.
- Aşama 4.4.2.3.3 yer verilen alan kullanarak, ilgi floresans kanalların her biri için ölçümü tekrarlayın. Sonuçlar ölçümleri 'Sonuçlar' penceresinde bir önceki eklenecektir.
- * Statistics.csv dosyasında hatalı kayıtları değiştirmek için elde edilen ölçümler kullanın. çekirdek segmentlere olmasaydı, yeni bir satır eklemek ona yeni bir hücre kimliği atar ve her kanal için gelen sütununda ImageJ elde edilen değerleri tanıtmak. Bu hücre uzamsal koordinatlarını (X, Y ve Z değerleri) olmaz. çekirdek undersegmented olsaydı, onun satır yinelenen her yeni hücreye farklı hücre kimlikleri atamak ve ilgili sütununda ImageJ elde edilen değerleri tanıtmak. Bu durumda, her iki hücreler uzamsal koordinatlarını paylaşacak.
Not: mekansal dağılımı analiz edilmesi ise, biz rüst üste olacak şekilde ecommend XYZ hariç bu hücrelerin koordine eder. yeni kayıtlar oluştururken Bu amaçla, kolayca (örneğin, tamsayı olmayan sayılar için) orijinal olanlardan ayırt edilir onlara Hücre kimlikleri atayın.
- bölünen hücreler puan. Not: MINS mitotik yanı sıra, fazlar arası çekirdekler algılar, ancak aralarında ayrım yapamaz.
- mitotik çekirdekler analizinde ayrı ayrı dikkate alınması gereken ise, el ile bu skoru ve veri dosyasına bu bilgiyi ekleyin. mitotik hücreler kaydetmek için, * statistics.csv veri dosyasına yeni bir değişken (sütun) ekleyin ve mitotik ve çekirdekleri interfaz farklı değerler atayın.
- aşırı segmentasyon çözümleniyor:
- Veri ön-işleme.
Not: e-tablolar, aşırı için düzeltildi ve altında bölümleme onlar analiz edilecek hazır olduğunuzda. analiz süreci ve veri sunumu belirli bir denemenin bağlıdır. Ancak, aşağıdaki bazı genel veri dönüşümleri vardırBiz analizinden önce yürüten öneririz:- Verilerin dağılım azaltmak için logaritma veya karekök içine floresan yoğunluğu değerleri Transform. Ham veri arsa eksenlerine yakın konsantre eğilimindedir (Şekil 4B, C bakınız) Bu aynı zamanda, görselleştirme yardımcı olur.
- floresan Z-ilişkili zayıflama düzeltin:
Not: Bir dilim (Şekil 4E, F) bulunduğu eksen lazer tarama konfokal mikroskopi görüntüleri Flüoresan yoğunluğu Z derin azalır.- örneklerde saptanan epitoplardan biri bir yerde ve homojen olarak ifade oda temizliği Nükleer marker olması durumunda, oda temizliği markör mukabil değer tarafından, her hücrede değerlerine bölünmesi ile diğer epitoplar floresan yoğunlukları normalize.
- Bu referans bir markör yokluğunda, şu şekilde floresan Z-bağlantılı kayıp telafi:
- (Y her bir markörün değerleri Konuarsa tüm kontrol, vahşi tip embriyolar (Şekil 4F) için bir araya değerleri - Z pozisyonu üzerindeki grafiğin) (grafiğin X ekseni) ekseni Z üzerinde şiddetindeki azalma görselleştirmek için.
- Her belirteç (Şekil 4F) için (yoğunluk Z üzerinde değerler) önceki aşamada elde edilen arsa için lineer model (regresyon eğrisi) takın.
- Aşağıdaki formülü kullanarak her bir marker için tüm değerleri düzeltin:
log (orijinal değeri) + Z * modelinde (Şekil 4D, G) eğimi.
Not: (R, MATLAB, vb) kullanılan analiz yazılımı bağlıdır bu düzeltme gerçekleştirmek için belirli adımlar. R kullanıyorsanız, veri bir lineer model sığdırmak için aşağıdaki formülü çalıştırın:
> Lm (log (kanal) ~ Z, data = dataframe)
nerede, kanal düzeltilmesi floresan kanal Z Z koordinat, ve dataframe istenen embriyo (lar) (* Stat tüm değerlerini içeren tabloDakika ya da bunun bir modifikasyonu ile oluşturulan istics.csv dosyası).
Not: Yukarıdaki formül çıktı aşağıdaki biçime sahip olacaktır:
(Önleme) Z
4,76373 -,01947
nerede, değeri Z mutlak değeri (bir örnek için Şekil 4G bakınız) 4.5.2.2.3 verilen formülle orijinal değerini değiştirmek için kullanılması gerektiğini veri kümesi için regresyon hattının eğimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Veri yorumlama ve sunum kolaylaştırmak için, bakım tüm hücreler ve onların göreli konumu analiz edilebilir, böylece toplama ve manipülasyon sırasında embriyoların zarar vermemek için alınmalıdır Şekil 2A -. D genişletilmiş bir boşluğun farklı aşamalarda sağlam blastosist örneklerini göstermektedir. meydana zarar halinde, ekstra bakım analiz ve sonuçları yorumlanırken alınmalıdır.
Bu protokol kullanılarak oluşturulan verilerin kalitesi ve güvenilirliği tespit kalitesi ve ilgi konusu proteinleri tespit etmek için kullanılan antikorların sinyal-gürültü oranına bağlıdır. Her zaman taze fiksatif kullanımı ve deneyler bir dizi başlamadan önce, uygun pozitif ve negatif kontroller ile, yeni antikorlar test edin. Şekil 2A, nükleer proteinler, bir dizi amaç için iyi antikor örneklerini göstermektedir. Şekil 2B, bir exampl göstermektedirbir sitoplazmik protein (DAB2) için iyi antikor örn. Şekil 2C, örnek, yalnızca 10 dakika boyunca sabit düşük sinyal-gürültü oranına sahip bir kötü bir boyama, bir örneğini göstermektedir. Bu durumda, GATA4 için kullanılan antikor (Santa Cruz SC-1237) güçlü bir sinyal (bu antikor ile O / N, sabit ve lekeli embriyo örnekleri için bakınız 24) temin etmek üzere O / N tespit gerektirir. post-processing sırasında sinyal seviyesinin artırılması çok gürültülü bir görüntü ortaya koymaktadır. Buna karşılık Şekil 2A (SC-9053) için kullanılan anti-GATA4, sadece 10 dakika tespit sonrasında yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar. Bunlar için detaylar ve diğer sağlam antikorlar Malzemeler bölümde verilmiştir.
İyi bir MINS segmentasyon için sınırlayıcı faktörler görüntüleme için kullanılan objektif büyütme, b) Z-çözünürlük ve c) nükleer boyanma kalitesi. Şekil 2B bir oi ile görüntülenmiş embriyoların örneklerini gösterir: a) vardır1.30 Bir NA ve 0.21 mm WD l daldırma 40X objektif. Orta panel, bireysel çekirdekler ve bunların arasındaki sınır ayırt edilebilir ICMS büyütmelerde göstermektedir. DNA boyama kullanmayan (yani., Hoechst, DAPI, vb YO-YO1,-PRO3 TO) ölçümü için floresans değerleri elde etme parametreleri tek tek iyi bir sinyal elde etmek üzere ayarlanabilir. Alt paneller daha embriyo, yüksek nükleer yoğunluğu ve böylece daha yüksek segmentasyon hataları (ok ucu ve ok) şansı ne kadar gelişmiş göstermektedir. 3, canlı hücreleri gibi apoptotik çekirdekler tespit olarak DAK taahhüt hataların, örnekler (göstermektedir ) Şekil 3AA, Ab, Reklam) panellerin yıldız işaretleri, aşırı bölümleme (ok ve Şekil 3AC) veya altında bölümleme ok ucu (Şekil 3AD ok. Şekil 3B bir alt-segmentasyon olayı Z-dilimleri bir dizi gösterir, iki hücre olarak tanımlanmıştır burada. MINS segmentasyon segmentine hesaba belirli bir hücre mevcut tüm dilimleri içeren bir hacim Z-eksenini nasıl gerçekleştiğini unutmayın.
Son olarak, veri analizi özelliklerini çalışma altında söz bağlıdır, bu nedenle, analiz süreci için kılavuzlar burada verilen edilemez. Ancak, bulduk, belirli ilk veri dönüşümleri yararlı olduğu Şekil 4B -. D., Şekil 4A'da gösterilen embriyo ICM marker NANOG ve GATA6 için floresans değerlerinin grafiğini göstermektedir, Şekil 4B dakika ile elde edilen ham floresans değerlerini gösterir . Şekil 4C arsa değerleri ayıran bir logaritmik dönüşüm, sonra aynı veri eksenleri (karekök dönüşümü de mümkündür ve benzer arsa verir) görülmektedir. Şekil 4D gösterileri (altta ve aşırı bölümleme manuel düzeltme yapıldıktan sonra) otomatik c sonra aynı veriprotokol aşama 4.5.2.2 açıklandığı gibi, floresans Z ile ilişkili zayıflama değerleri orrecting. Bu Z bağlantılı floresans çürüme örnekleri Şekil 4E'de görüntü ve 4F, arsa olarak verilmiştir. Şekil 4G veri dönüştürme etkisi 4.5.2.2 açıklandığı gösterir. epiblast (kırmızı, Nanog +, GATA6-) veya Pre (mavi, NANOG-, GATA6 +) kimlik ya temsil Renkler NANOG ve GATA6 değerlerinin bir fonksiyonu olarak arsa eklenmiştir. Bu özel örnekte, hücreler burada günlük oranı [GATA6] / log [Nanog]> 1.25 olarak kabul edilmiştir Pre bir ara maddesi ile günlük oranı [GATA6] / log [Nanog] <1 EPI kabul edildi hücreler ve hücre oranı kaydedilmemiş (bu durumda yok) olarak kabul edildi. Tüm veriler dönüşümleri ve araziler Rstudio yapılmıştır, ancak, yazılım seçimi kritik öneme sahip değildir ve son kullanıcı bağlıdır.
Şekil 1. Embriyo Yer, Zaman Çizelgesi ve (iki) birinin Analiz Boru Hattı. (A) şematik fare uterin boynuz ve preimplantasyon gelişim aşamaları, onlar bulunması gerektiğini boynuz bölge ile uyumlu. (B) her adım için zamanlama ile deneysel zaman çizelgesi. protokol ve duraklama noktaları (mavi) Adımlar gösterilir. (C) görüntü elde etme ve dakika kullanarak analiz boru hattının Özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Immünfloresans ve Nükleer Yoğunluk Şekil 2. Örnekleri. (A) Nükleer tr test antikorlar ile iyi immünfloresan sonuçlarının örneklerianscription faktörleri. Anti-CDX2 bir AlexaFluor 568 eşek anti-keçi, bir AlexaFluor 488 eşek anti-fare ikincil antikoru, anti-GATA6 ile saptandı bir AlexaFluor 647 eşek anti-tavşan anti-Nanog anti-GATA4 (Santa Cruz SC-9053 ) bir AlexaFluor 647 eşek anti-fare ile AlexaFluor 488 eşek anti-tavşan ve anti-Oct4 ile. Tüm primer antikorlar malzemeler tabloda listelenmiştir. Sitoplazmik GATA4, nükleer boyama spesifik olmayan ve Gata4 boş embriyolar da görülür (gösterilmemiştir). Bir sitoplazmik protein, DAB2 için iyi immünofloresan (B) '. Bir AlexaFluor 488 eşek anti-fare ile tespit edildi. Nükleer faktör için düşük bir sinyal-gürültü oranına sahip kötü immünofloresan (C) Örnek. Ve AlexaFluor 568 eşek anti-keçi, GATA4 keçi yükseltilmiş bir anti-GATA4 (SC-9053 (tavşan anti-GATA4) kullanıldı ise (A) Santa Cruz, SC-1237) ile tespit edilmiştir. (
MINS segmentasyon hataları örneklerini gösteren bir embriyo bireysel Z-bölümlerin Şekil MINS Hataları 3. Örnekleri. (A) Sıra. Bununla birlikte çekirdek olarak tanımlanan Apoptotik hücreler, B ve D panelleri bir yıldız (*) işareti ile belirtilmiştir. Panel b, ID içerisinde 39. (ok başı), çok küçük de olsa, ilgili çekirdeği tespit etmez ve dolayısıyla düzeltilmemiş bırakılabilir. Panel c, ID içerisinde 66. (ok) iki farklı n açıklıklısırayla ayrı ayrı tespit edilmiştir uclei, (ok başları, kimlikleri # 65 # 54 ve # 53). Panel d, iki hücre (ID # 63) (ok ince sınır işaretleme bölümüne bakınız) tek biri olarak tespit edilmiştir ve bu rekor, bu nedenle hücre sayımı amacıyla çoğaltılmış olmalıdır. (B) DAK Z ekseni boyunca hücrelerin tespit eder. görüntüleri yanlışlıkla tek bir (# 123) olarak attı edilmiş iki hücre Z-dilimleri bir dizi göstermektedir. Çekirdekleri sınırlayan mavi alan Z. boyunca sürekli nasıl Not bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Segmentasyon ve Veri Dönüşümler Şekil 4. örneği. ICM NANOG için lekeli bir blastosist hücreleri ve GATA6 ve aynı nükleer segmentasyon anlık (A) Görüntülernükleer boyanma kanalda dk (Hoechst 33342) kullanılarak embriyo. Dakika ile ölçülen ICM hücrelerinde (BD) Nanog ve GATA6 flüoresans değerleri logaritmik dönüşümü (C) uygulandıktan sonra, düzeltilmiş göre hücre kimliklerini Z ekseni boyunca floresans çürüme değerlerini düzeltmek otomatik olarak ayarlandıktan sonra, ham veriler (B) olarak çizilen değerleri (D). (E - G) Z ekseni boyunca floresan çürüme veri düzeltme örnekleri. (E) Z ekseni boyunca floresans azalma gösteren Hoechst ve anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488) ile etiketlenmiş bir blastosist, görüntüleri. (F) (E) 'de gösterilen da dahil olmak üzere embriyo bir havuz için Hoechst AF488 Z ekseni boyunca floresans değerlerinin dağılım grafikleri. Gri çizgi değerleri her set için regresyon eğrisini temsil eder. (G) F ile aynı veriler, her bir hücre için floresans çürüme dengeleme sonrasındaAşağıdaki faktörü kullanılarak: Z * doğrusal model eğimini koordinatı (protokolünde adım 4.5.2.2 bakınız). Paneller E - G aslen Düğüm yazarlar tarafından yayımlanmıştır (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Her nokta bir hücre temsil eder. Ölçek = 20 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| kullanıcı Girişi |
| Parlaklık eşik * (loş görüntülerde nükleer algılama kolaylaştırır) |
| Bağıl X / YZ çözünürlüğü |
| segmente Kanal |
| nükleer çap |
| Görüntü gürültü seviyesi |
| MINS Çıktı |
| Nucl ile segmentasyon Z-yığınıei kimlikleri |
| nükleer hacmi |
| XYZ her çekirdeğin koordinatları |
| Her florasan kanalına ve nükleus için ortalama ve floresan değerlerinin toplamı |
| Avantajları |
| yığının boyunca çekirdeklerin doğru segmentasyon (>% 85) - bitişik z bölümlerde bir çekirdeğin tüm tekrarlarını tanır |
| Tek hücre çözünürlüğü |
| Embriyoların partilerin denetimsiz segmentasyon |
| Segmentasyon boru hatları kaydedilebilir ya ve her bir embriyo için yeniden kullanılabilir veya düzeltilmiş |
Tablo 1. DAKİKA Özellikler
| yük Görüntü | Sorulduğunda, Z nispi çözünürlüğü tanıtmakgörüntü. Bunun formülü ise şu varsayılan okuyucusu kullanarak veya uygulanması dosya meta veri elde edilebilir: (bütün um) X (veya Y) çözünürlük / Z çözünürlüğü. |
| Kanal bölütlenecek için - sıra numarası (5 1) girin. görüntüdeki tüm hücreleri tespit edecek segmentasyon için DNA leke kanalını kullanarak, ancak, diğer kanallar da ayrı ayrı segmentlere olabilir. | |
| (Varsayılan olarak 1) de segmentasyon başlamak için çerçeveyi girin. Sadece çoklu zaman dilimlerinde dosyalar için de geçerlidir. | |
| Image Enhance (isteğe bağlı) | görüntünün beyaz ve siyah nokta saptanmasını kolaylaştırmak için ayarlanabilir. 255 (8 bit görüntüler için) veya 0 - - Genellikle 0 beyaz nokta ve yeniden ölçeklendirme düşürücü 4096 (12-bit görüntüler için) görüntü parlak yapmak ve loş çekirdeklerin saptanmasını kolaylaştıracaktır. |
| Çekirdeği Algılama | Tahmini nükleer çapını seçin (blastosist genellikle 30 ila 40 px). |
| Gürültülü görüntülerde gürültü seviyesi ayarlanabilir. Aksi halde, varsayılan değer uygulanacaktır. | |
| Segment Çekirdekler | Varsayılan parametreleri kullanın. |
| sınıflandırır Çekirdekler | MINS konumuna göre preimplantasyon embriyolar iç hücre kütlesi (ICM) hücrelerden trofoektoderm (TE) ayırt edebilirsiniz. Bu aynı zamanda, el ile yapılan ya da TE markör kullanıldığında flüoresans düzeylerinin dayalı olabilir. |
| ihracat Sonuçları | elde edilecek dosyaları seçin: |
| - Segmentasyon, (.tiff dizi dosyası) kullanılan bir kanal üzerinden üst üste | |
| - Segmentasyon sadece (.tiff dizisi dosyası), | |
| - Algılanan tüm hücreler, XYZ koordinatları ve her bir hücrenin (.csv dosyası) için tüm kanallar için floresan seviyeleri (ortalama ve toplamı) için kimlikleri ile tablo. | |
| Tüm dosyaları varsayılan olarak ihraç etti. Dosyalar s kaydedilirgörüntüleri yer almaktadır ame dizin. |
Tablo 2. DAKİKA Segmentasyon Boru Hattı
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol preimplantasyon sahne fare embriyoları üzerinde tüm montaj Immünofloresan bir nicel analizini gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanır. Sağlam immünofloresan protokolü 22 yüksek çözünürlüklü takip eder, yazılımın 4 uyarlanmış bir parçası kullanarak konfokal görüntüleme ve görüntü segmentasyonu ile tüm montaj. Immünofloresan protokolünün seçimi kritik olmasa da, biz, hızlı, güvenilir olmak ve biz test ettik antikorların çoğu için güçlü bir sinyal sağlamak için burada 22 sunulan bulmak. takip edilebilir Diğer protokoller, başvuru eşdeğer deneyler tutarlı olması koşuluyla. birçok faktör mutlaka mümkün değildir deneyler arasında her deney sonucunu ve doğrudan karşılaştırma etkilerken, biz tekrar genelinde tutarlılık için çaba ve yeterli teknik çoğaltır performans büyük ölçüde değişkenlik azalttığını bulmuşlardır. Bu nedenle, bir kez optimize, sabitleme ve immunolabeling reaktifler ve protokoller, hem de görüntüleme koşulları eşdeğer deneyler arasında sabit tutulmalıdır.
Birçok hatalar (yani, aşırı ve altında bölümleme) ile, loş sinyali ile 1) kalitesiz boyama, ve 2) bırakıyorsa segmentasyon: iki gruba bu protokol sonbaharda uygulanması sırasında ortaya çıkabilecek başlıca sorunları. Düşük kaliteli immünofloresan bağlı örnekleri yanlış tespit ya da antikorlar, tam-montaj immünofloresans için müsait olmayan amacıyla yapılır. PFA taze olduğundan emin olun (ya taze hazırlanmış veya bir hafta önce daha uzun -20 ºC den RT çözülmüş). preimplantasyon embriyo küçük boyutu göz önüne alındığında, PFA 10 dakika fikse yeterli olacaktır. Ancak, daha uzun tespit süreleri (Malzeme) ile daha güçlü bir sinyal vermek üzere bazı antikorlar bulduk. Daha önce test edilmiş bir antikor zayıf sinyal sağlıyorsa, farklı tespit protokolleri deneyin. Tüm antikorlar üzerinde sağlam performans tüm montaj immunofluorescence ve birincil antikor seçimi deney sonucu için kritik öneme sahiptir. Yeni antikorlar, embriyolar test edilmelidir ve optimal konsantrasyon ampirik olarak belirlenir. Malzemeler grafikte biz test edilmiş ve rutin kullanımı olan bir sayı antikor ayrıntıları. Yeni antikorlar söz konusu olduğunda yayınlanan literatüre veya üreticinin bilgilerine başvurun. Western blot çalışma için uygun tüm antikorlar, immünofloresan tüm montaj Not ve immünofloresans için gerekli konsantrasyonu yüksek büyüklükte kadar bir sipariş olabilir. Ticari ikincil antikorlar genellikle, ancak, kutunun dışında iyi iş karşılaştırıldığında olacak eşdeğer deneyler boyunca birincil-ikincil antikor kombinasyonlarının kullanımında tutarlı olmak.
Görüntü segmentasyonu kalitesi nükleer boyanma kalitesi hem de ve embriyonun ICM nükleer yoğunluğuna bağlıdır. Her zaman parlak için çalışıyoruz,Keskin çekirdekler ve yüksek çözünürlüklü objektif (40X veya daha fazla) kullanın. Nükleer leke sinyali düşük ise, taze bir kısım ya da yeni bir toplu kullanın. Nükleer leke olarak uzun ölçümü için kullanılan değil gibi, satın alma parametreleri keskin, parlak çekirdekleri kaydetmek için her embriyo için ayarlanabilir. nükleer boyama farklı bir kanal bölümleme kullanılmaktadır Aynı şekilde, bu özel kanalın sinyal-gürültü oranı bölümleme kalitesini belirleyecektir. Geç evre blastosist (E4.0 itibaren) ICM içinde çok yüksek bir nükleer yoğunluğu sunuyoruz. Bu nedenle, bu yüksek kaliteli boyama en kritik olduğu, bu aşamada yer almaktadır. Bununla birlikte, segmentasyon hataları bu aşamada en sık gerçekleşecek. Tahmini nükleer çap ve DAK boru hattı üzerinde görüntü gürültü düzeyini tanıtmak, 'Görünüm' düğmesini kullanarak her adımın sonucunu keşfetmek ve tatmin edici bir sonuç elde edilene kadar parametrelerini ayarlamak. En iyi segmentasyon üreten parametrelerini kullanınVeri işleme sırasında elle doğru hatalar. Geç evre embriyolar (~ E4.5) zaman alıcı olacak bir yüksek hücre sayımı ve manuel veri düzeltme var unutmayın.
Bu protokolün sınırlamalar görüntü elde etmek için kullanılan konfokal mikroskop sistemi tarafından belirlenir. tartışıldığı gibi, tüm embriyonun Z ekseni görüntüleme sağlayan bir çalışma mesafesi olan, yüksek büyütmeli objektif kullanın (- çapı 160 mikron preimplantasyon fare embriyoları 150 kadar ulaşabilir). Benzer bir şekilde, tespit edilebilir epitoplarının sayısı mikroskop seferde edinebilirler kanal sayısı tarafından belirlenir. Bu protokol kullanılarak, DNA yanı sıra, üç farklı epitoplar (toplam 4 kanal) her bir numune üzerinde eşanlı olarak etiketlenebilir. enstrüman her floresan kanal için kalibre olduğundan emin olun, yolluk optimize edilmiş ve lazer çıkış tutarlı yani.
Burada tarif edilen yöntemler, birlikte hücre pozisyonunun analiz sağlarXYZ fare blastosistlerinin her bir hücre için, proteinin in situ sentezleme seviyelerinin ölçümü hem de eksen. Bizim tecrübelerimize göre, herhangi bir diğer müsait yazılım kullanarak alternatif yöntemler bu protokolü uygulanan boru hattı (diğer araçlarla doğrudan karşılaştırma için 4 bakınız) çözünürlük düzeyini sağlamak mümkün değil. blastosist ICM bulunan yüksek nükleer yoğunluk gereken elle düzeltme ölçüde bunların kullanımı pratik yapar çok hata oluşturmak için diğer araçları neden olur. Alternatif olarak, elle hücre sayımı ve floresans ölçümleri, daha önce hücrelerin alt-veya embriyo 10,11,18,19,24 belirlenen bölgeler için kullanılmıştır. Ancak, her embriyo mevcut hücrelerin onlarca tüm XYZ eksenleri boyunca tüm floresan kanalları ve hücre konumu, elle sayım ve ölçüm böylece zaman bizim protokol icat edildiği için yüksek verimlilik analizi için izin vermeyeceğini alıcı olacaktır . Ayrıca, manuel birflüoresans düzeylerinin ssessment burada tarif edilen bir hücre kimliği daha sonra belirlenmesi için floresan yoğunlukları objektif bir ölçümü sağlayan bir boru hattı da örneğin, çapraz eğilimlidir. hücre kimliklerini atamak için, standart bir kriter kurmalıdır araştırmacı kurmak, belirli bir deneysel için tüm örnekleri arasında uygulanacak. biyolojik ve teknik - - Farklı faktörlerin göz önüne alındığında immunolabeling sonucunu etkileyebilir, bu kriter mümkün olduğunca uygun kontrol deneyleri ve daha önce yayınlanmış verileri kullanılarak tespit edilmelidir. Biz bir algoritma ne olursa olsun deney hücre kimliğinin otomatik belirlenmesi için tasarlanmış olabilir yakın geleceği öngörülüyor. Ancak, bu tür bir alet daha geniş bir uygulama ve büyük olasılıkla makine öğrenme algoritmaları ile birlikte mevcut yöntem, iyileştirilmesi sadece gelecektir.
Son olarak, bu boru hattının basitlik ve basmakalıp Morphol verilenFare preimplantasyon embriyoların ogy, bu protokol bu şekilde yüksek verimli boş fenotip 5,6 ya da başka bir deney manipülasyon 7 analizleri sağlayan, embriyolar çok sayıda analizi için kolayca ölçeklendirilebilir. Yani yüksek nükleer yoğunluk - Geçerli protokol tasarlanmış ve preimplantasyon fare embriyoları ve ESC kolonilerinin analizi için optimize edilmiştir ederken benzer özelliklere sahip diğer sistemlere uygulanabilir olamazdı neden Nihayet, biz, a priori hiçbir neden görmüyorum. Biz deneme ve diğer senaryolar için bu protokolü adapte ve gelecekteki gelişimi için geribildirim sağlamak için başkalarını teşvik ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
