Summary
该协议提出对蛋白质表达的原位分析进行定量，单细胞研究在小鼠植入前胚胎沿袭规范的方法。必要的囊胚的汇编程序，整个安装蛋白的免疫检测，在一个共焦显微镜，和核分割和图像分析的样品的成像进行描述。
Abstract
这个协议提供了一个方法来进行定量，原位单细胞蛋白表达的分析，以研究谱系规范 在小鼠植入前胚胎。描述所需胚胎收集，免疫荧光，在共聚焦显微镜成像，和图像分割和分析的过程。此方法允许在胚胎的所有单元中的多个核标志物的表达和空间（XYZ）的定量的坐标。这需要MINS，专门为着床前胚胎和胚胎干细胞（ESC）的菌落的共焦图像的分析开发出一种图像分割的软件工具的优点。 MINS执行通过X，Y和Z维度的无监督核分割，并以最小的用户输入的所有信道产生在三维空间上单元位置信息，以及核荧光水平。虽然该协议已经为图像的分析而优化植入前阶段的小鼠胚胎的，它可以容易地适应于呈现良好信噪比并且其中高核密度带来了障碍的图像分割（例如，胚胎干细胞中的表达分析的任何其他样品的分析（ESC ）菌落，分化培养中的细胞，其它物种或阶段等 ）的胚胎。
Introduction
鼠标植入前胚胎是一个范例来研究细胞命运说明书和哺乳动物从头上皮的研究出现和体内的多能性的维持，以及一个模型。哺乳动物发育的胚胎植入前阶段致力于建立三种细胞谱系构成囊胚，即多能性外胚层 - 这引起了大多数体细胞组织和生殖细胞 - 和两个胚谱系，滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PRE）（图1A）1,2。这个协议描述的步骤（1）收获并修复植入前阶段的小鼠胚胎，（2）执行免疫荧光标记的感兴趣的蛋白质，（3）进行整个安装使用共聚焦显微镜用z-切片功能和成像（4）执行共聚焦图像和随后的定量图像分析的核分割。这条管道可以牛逼他无偏蛋白水平的测量小区标识的分配来表征原位细胞亚群。这种协议可以在少至3来进行-第4天为一个单一垫料（通常最多10个小鼠胚胎），从胚胎收集到数据分析（图1B）。几个窝的同时分析会增加成像和数据分析时间负担，从而延长了协议的总长度。
植入前阶段的小鼠胚胎是一个听话的实验系统，其中，由于其体积小，定型形态3， 在单细胞分辨率的细胞过程TOTO成像非常适合。开展胚胎的统计相关数字的公正，制度层面的分析，自动的，定量分析的管道是可取的。然而，由于内细胞团的囊胚（ICM）的高核密度（
这里提出的分析管道围绕基于MATLAB的图像分割工具，模块化交互式核分割（分）4。敏思performs无监督核分割上共焦的Z堆叠的大批量的用户已经建立图片属性的最少数量后，利用图形用户界面（GUI）（表1）4。这条管道已被证明有效的高通量数据对野生型蛋白表达和细胞定位的产生，处理实验和转基因胚胎和胚胎干细胞5-7。在本协议中，我们描述的MIN到植入前阶段的胚胎图像分割中的应用。有关胚胎干细胞的敏思性能的例子请参考4,7。自动核分割步骤显著降低了小区识别处理时的负担，而空间和荧光强度测量允许小区身份的无偏测定和基因表达结构域和细胞位置的三维地图的产生在胚胎（图1C 5,6胚胎的大同伙。敏思是免费提供的http://katlab-tools.org（软件需要MATLAB许可证）。
没有开发迄今方法允许对小鼠植入前胚胎蛋白质表达和细胞定位这样深入的数据的生成。所有的尝试到目前为止在量化这些类型的数据已被限制为手动判定和对于不同人群的细胞数的定量在胚胎（或者完全手动，或软件辅助）9-19。 （结合敏思软件）这种方法已经被量身定做和鼠标胚胎植入前胚胎干细胞和测试;不过其上具有高的核密度的其它系统的性能，虽然尚未检验，预计是等价的。
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Protocol
伦理学声明：所有动物的工作，包括饲养，繁殖和牺牲被批准为纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC），协议＃03-12-017。
1.胚胎收集
注 ：所有动物的工作必须已通过机构和地方当局以及符合当地和制度规则。
- 交配处女雌性小鼠与所需基因型的肥沃螺栓男性。
注意 ：如果设置自然交配，在estral周期的发情期女性选择交配增加对所需日期的机会。如果诱导超数排卵，请参阅20中描述的协议。 - 检查阴道塞在早晨用钝探针的存在。理想情况下，这样做中午（下午12:00）之前，作为交配塞全天丢失。考虑野应检测阴道塞胚胎天（E）0.5的n个。
- 所需天和胚胎发育的时间，预热M2或冲洗保持介质（FHM）至RT，或优选37ºC。注意：无论M2或FHM可用于冲洗和处理的胚胎。在不使用时，这些存储介质在4ºC。估计每个子宫利用〜2毫升培养基。
- 解冻冷冻4％低聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS），或准备一些新鲜的溶液。估计500微升每孔4％PFA溶液4孔板。固定在4孔平板的每个孔一窝。注意：可替换地，一个96孔板可用于固定和存储胚胎。如果使用96孔板，使用PFA溶液每孔100μl。
- 使用明火绘制在尖端的毛细管端拉玻璃巴斯德吸管。
- ，或者按照当地和制度法规颈椎脱位或CO 2吸入牺牲女性。它往往desirable。通过颈椎脱位确认动物实施安乐死。
- 喷动物的腹部用70％乙醇，以尽量减少毛发脱落，并执行一个腹部切口，先通过皮肤，并随后通过体壁（腹膜）以暴露内脏。
注意 ：以下步骤描述该过程在E3.25和E4.5（图1A）之间的任何阶段收集从怀孕母鼠的子宫内囊胚。对于早于E3.25在植入前胚胎采集协议，参考20。 - 找到子宫，并从动物中删除。拿着一双镊子的子宫宫颈结束时，切断通过子宫颈拉起轻轻舒展两个子宫角。
- 从子宫修剪脂肪，注意不要刺破子宫壁。这可以很容易地在去除时间来完成，而仍然附着在动物的身体，由于子宫可以伸出。可替代地，它可在以后完成，解剖显微镜下，在室温PBS中。关于子宫解剖更详细的协议，见协议5 8 20
- 输卵管上方切开，卵巢下面，以释放在培养皿整个子宫，地点，并用PBS覆盖。
注意 ：这一步还允许多余的血液或其他碎片的子宫，这有利于后续的囊胚收获洗涤。 - 分开两个子宫角通过近端切割，在子宫颈的两侧并丢弃子宫颈。通过切割连接它们（图1A）的峡部下面分开子宫每个输卵管。既转移牛角操纵媒体（无论是M2或FHM）的胚胎收集和操作的下降。
- 在解剖镜下，冲洗出来的囊胚子宫和成迫使0.5介质 - 从子宫颈口1毫升M2或FHM通过每个子宫角。使用1ml注射器带针皮下。注意：针可使用申请石以避免撕裂子宫被减弱，虽然这不是关键的。子宫冲洗的详细图可以在 21个被发现。
- 使用解剖显微镜，找到胚泡，这将在散布介质的压降。允许高达1 - 2分钟，囊胚，以冲洗后，沉到培养皿的底部。使用口控制，巴斯德玻璃吸管毛细管结束后，收集所有的囊胚，并转移到媒体的一个新的下降。
- 3滴新鲜M2或FHM的 - 通过2移动它们冲洗囊胚。同时10囊胚 - 移动在5组胚胎。
注 ：在任何一个时间将加快这一进程，移动较大的群体，但它也将增加意外丢失大量胚胎的机会。如果在使用口控制移液器未经训练，练习操纵胚胎和转让前应B为考虑eginning实验。 - 在酸性台氏液冲洗简要他们卸下未孵化的囊胚透明带（ZP）（一般<E4.0）。一旦ZP不再可见，转移囊胚回操纵媒体。仅保持在酸台氏胚胎只要严格需要，为了防止对细胞的损害。
- 剥蚀搬运囊胚时要小心，因为他们坚持很容易在玻璃和塑料表面。操纵平台包含4毫克/ ml牛血清白蛋白（BSA），以防止附着的，但酸的台罗德氏或PBS不这样做，因此，为了减少损坏或胚胎的损失的风险不拿起超过2 - 5剥蚀胚泡同时在BSA的或无血清PBS或酸性台氏操纵他们的时候。
注意：可替换地，涂层，在使用前1％BSA的玻璃吸管，以减少玻璃表面的胚胎的粘附。
- 剥蚀搬运囊胚时要小心，因为他们坚持很容易在玻璃和塑料表面。操纵平台包含4毫克/ ml牛血清白蛋白（BSA），以防止附着的，但酸的台罗德氏或PBS不这样做，因此，为了减少损坏或胚胎的损失的风险不拿起超过2 - 5剥蚀胚泡同时在BSA的或无血清PBS或酸性台氏操纵他们的时候。
- 涂层的每个孔的底部用1％琼脂的薄层的4孔组织培养皿的，0.9％的NaCl，以防止胚附着在塑料。备选地，加入4毫克/毫升BSA的PBS（PBS-BSA）的。
- 填用500μl室温的PBS（或PBS-BSA）的包衣4孔组织培养皿中的一个孔，另一个在PBS井用500微升4％PFA的。
- 漂洗在室温的PBS胚泡并在4％PFA固定在PBS中在RT下10分钟。固定后转移到PBS（或PBS-BSA）。
- 如果胚不会被立即处理，覆盖含有矿物油的一层的胚胎以防止蒸发（导致样品的干燥）和板储存于4ºC的PBS中。
注意：不同的固定方法和时间可以根据不同的实验中使用，所使用的感兴趣的表位和抗体。选择两者的方法中，是一致的整个等效实验以促进染色结果的后续比较。
注：暂停点：胚胎可以继续下一步骤之前保存在4ºC在PBS长达数周。确保PBS是无菌的和/或添加100U /毫升青霉素+ 100微克/毫升链霉素（青霉素 - 链霉素）以防止细菌污染（使用PBS-BSA特别是当）如预期长时间贮存。
2.免疫
- 使用以前已测试并证明是整个安装免疫稳健任何协议进行免疫。注意：我们建议那些22和11所示 。在本文章前者进行说明。选择哪种方法，一致相当于整个实验便于染色结果的比较。
- 使用灵活，聚乙烯，清晰，U型底96孔板，进行免疫荧光协议的顺序步骤。 50每孔内 - 100微升的解决方案，并通过一个解决方案移动胚到另一个使用一个L形的嘴吸管。注意此方法最大限度地减少了使用的试剂的并且便于追踪步骤以及几个实验组的平行染色。
- 可选：涂料孔的底部用1％琼脂的薄层，0.9％的NaCl，以防止胚胎塑料的粘合性。不添加BSA免疫荧光解决方案。
- 制备的PBX（0.1％的Triton X-100的PBS）。如果预测的几个实验免疫性能，在实验之间4ºC准备50毫升PBX和商店。
- 制备透溶液（0.5％的Triton X-100，100mM的甘氨酸的PBS）。制成1毫升（或取必要量）的每个实验新鲜通透溶液。
- 制备封闭液（2％马血清（HS）或20％胎牛血清（FBS）与青霉素 - 链霉素的PBS）。在实验之间4ºC准备10毫升并存储。
- 没有差异已经观察之间既血清型，但是，在阻断用于等效实验溶液的选择一致。
- 冲洗胚胎固定在RT在PBX 5分钟（约100微升）。
- 通透胚胎在RT中透化溶液5分钟（约100微升）。
- 冲洗胚胎在RT在PBX 5分钟（约100微升）。
- 块的胚胎进行30分钟至1小时在RT在〜100μl的阻断溶液。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
注：胚胎可以被封锁长达O / 4ºC没有明显的改善或损害N个周期相比，30分钟封锁措施的时候。 - 孵育胚胎O / N在第一抗体4ºC/稀释在封闭溶液（〜100微升）的抗体。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
- 确定每个事先初级抗体最佳稀释。见教对于一些抗体的测试稀释物藏密坛城艺术和材料部分。
- O / N孵育后，冲洗3倍的胚胎中每个PBX 5分钟在室温（约100微升）。
- 块的胚胎进行30分钟至1小时在RT在〜100μl的阻断溶液。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
- 孵化的胚胎进行1至2小时在二级抗体/抗体4ºC在〜100μl的阻断溶液4微克/毫升稀释。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
- 冲洗胚胎PBX 2倍，每次5分钟在室温。
- 将胚胎首选DNA染色。如果使用赫斯特33342，稀释到PBS 5微克/毫升。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
注：暂停点：如果胚胎没有被立即成像，它们可以保持在Vp来在核染色液几个星期。在这种情况下，确保PBS是无菌的和/或添加青霉素 - 链霉素或叠氮化钠，以防止细菌的生长和污染。
3.共焦成像
注意：单个共焦显微镜的配置将需要特定的采集参数进行调整以代替系统和软件。但是，下面的部分提供了一组一般的规律可循，应该是适用于任何给定的安装。
- 用细口移液管，使PBS或一个35mm的玻璃底皿的玻璃表面上核染色液的微滴并用矿物油覆盖。作为替代，使用常规的盖玻片用硅分离，以避免损坏胚胎和用显微镜载玻片覆盖。注意：当使用常规盖玻片，胚胎不能被随后重新定位或回收用于基因分型，因此我们强烈建议使用玻璃底的菜肴。
- 地方的胚胎在微滴和安排以一致的方式，最好是用平行于该玻璃表面的ICM腔轴。建立在显微镜持有人的菜。注意：激光扫描共聚焦显微镜获得的图像从荧光强度的Z轴相关的损耗受到影响。因此，在该排列的一致性是在不同的胚胎比较等效区域之间的强度非常重要。
- 设置使用野生型胚胎没有受到任何形式的治疗，可能会改变基因表达的参考参数。
- 为了获得将促进使用MINS 工具 4精确分割数据获取使用高放大倍数的物镜（即40X或更高）的图像。
注意：20倍的目标使用数码变焦将不会产生使用敏思进行分割足够的分辨率的图像。人们还应该注意客观的工作距离（WD），因为它应该是足以让收购Z堆栈跨越整个囊胚，从而长WD的（〜130 - 150微米）的目标通常是必要的。 在图2中所示的图像 - 4用一个40X / NA 1.30油浸物镜为210微米的工作距离获得。 - 使用最低激光输出，提供了一个强有力的信噪比无白化荧光团。
- 调节增益和偏移，以获得最宽的动态范围，而不过度曝光的样品。揭露图像覆盖大部分，或者跨越整个，灰阶范围将有利于在图像之间亮度的微小差异的检测。
- 使用小的（1微米）的Z-步骤中，由于Z轴分辨率是用于与MINS精确分割关键的。
注意：XY尺寸不影响核分割过程中，只有图像文件的大小。一般情况下，512 x 512像素是足够的XY分辨率出版质量的图像，而无需compromi唱的硬盘空间。 - 关键的步骤：保持成像内和在相同实验的成像会议一致参数，以便可以比较样品。
- 为了获得将促进使用MINS 工具 4精确分割数据获取使用高放大倍数的物镜（即40X或更高）的图像。
- 胚胎成像批次：
- 在一个会话图像连贯组（窝，实验）只要有可能。
- 为保持相同的实验重复的内部和整个成像会议一致参数。
- 图像的胚胎在整个（全Z轴）捕捉到每一个细胞。
注意：如果需要，胚胎基因分型可以在成像之后如在23中所述进行。需要对巢式PCR，必须凭经验确定，并且将取决于待分析的基因座，并使用的引物。
- 确保能够追溯匹配胚胎图像。
4.图像分析和数据预处理
- 下载并从http安装敏思4：//卡特拉b-tools.org（需要MATLAB许可证）。
- 执行图像分割：
- 遵循MINS的图形用户界面（GUI）来加载一个共焦图象或从硬盘驱动器堆栈，检测细胞核和分割图像。装载由显微镜（.lsm，.lif，.oif 等 ）生成的原始数据的整个Z堆叠。 见表 2上http://katlab-tools.org和4发现每一步的细节和说明。一旦完成，通过点击相应的“查看”按钮，查看每个步骤的结果。按钮上方的黄色标签表示在操作过程中，一个绿色的标签指示操作完成。
注：敏思目前不支持.czi文件，.TIFF序列或多个位置的文件 - 每个Z堆叠需要有一个独立的文件。 - 令人满意的分割后，保存创建的，因此它可以直接用于其它胚或窝管道。
- 遵循MINS的图形用户界面（GUI）来加载一个共焦图象或从硬盘驱动器堆栈，检测细胞核和分割图像。装载由显微镜（.lsm，.lif，.oif 等 ）生成的原始数据的整个Z堆叠。 见表 2上http://katlab-tools.org和4发现每一步的细节和说明。一旦完成，通过点击相应的“查看”按钮，查看每个步骤的结果。按钮上方的黄色标签表示在操作过程中，一个绿色的标签指示操作完成。
- 批处理模式分割：
注：思ngle文件可以单独地被分段。然而，由于垫料或实验中的胚胎一般人可比的阶段是，敏思可以申请一个图像创建分割管道一组人没有监督。- 从批处理模式下运行菜单上，单击“添加文件”，并载入所有文件，以在一次处理。注意：从不同的源文件可以被添加到分割的队列。
- 点击“开始批处理模式下运行”，并留出时间让软件处理的文件。注：分割输出将被保存在原始文件中，位于相同的目录。
- 分割评估和手动校正
注意：MINS段以非常高的精确度（> 85％）的图像，然而，染色和成像的质量，以及胚胎的阶段，可能会影响MINS性能。一般地，胚胎内越高核密度，就越有可能分割误差将采取PLACE（ 图2D，3）。因此，分割精度应该对每个样品进行评估，并根据需要手动校正。两种类型的错误通常会发生：过分割和欠分割。- 解决过分割：
- 识别误报-凋亡小泡（图3A 一个，B，D，星号 ），或其它元素是不完整的细胞核，但是它可能已经由MINS认定。
注：通常，这样的误报比真正的细胞核大小小，并且能在大多数情况下，很容易识别和分类在电子表格上。然而，强烈建议目视检查，因为时常晶核可以仅部分地分段的，导致更小的，但有效的分段体积（图3A B，箭头）。 - 删除从* statistics.csv文件误报相应的记录。保留原*统计.csv文件后，以供将来参考和编辑仅是它的复制品。
- 如果一个原子核被过度分割和表现为2个或更多核（ 图3A C，箭头，箭头），要么通过平均它们的强度级别或合并的记录，如果类似，保持的记录一个用于细胞和丢弃休息。
- 识别误报-凋亡小泡（图3A 一个，B，D，星号 ），或其它元素是不完整的细胞核，但是它可能已经由MINS认定。
- 在分割解析：
- 查明敏思无法检测到两个或更多核之间的边界，因此它们分割为单核事件（ 图3A D，箭头和3B）。注意：此产生了一个问题进行准确细胞计数，但更重要的是，用于定量蛋白质水平，作为测量的水平将是已经错误地合并了细胞的平均值，并且其可以属于不同的谱系。
- 查明敏思未能完全检测核事件。
- 在这些情况下（4.4.2.1和4.4.2.2），测量平均灰度级˚F或在不足或未分段单元（S），每个信道使用一个替代的工具，如ImageJ的（http://imagej.nih.gov/ij/），并用正确的电平替换错误记录。保留以备将来参考原来的* statistics.csv文件，仅编辑它的一个副本。要做到这一点使用ImageJ，请按照下列步骤操作：
- 打开ImageJ的相关的多通道堆栈并导入由敏思生成一个虚拟栈（“文件”>“导入”>“TIFF虚拟堆叠...'）对应的* overlaid.tiff文件。
- 查找不足或未分段核的中间部分。
- 使用写意选择工具勾勒出的DNA染色通道不足或未分段核的外围。
- 按CRL + M（Cmd的+ M在Macintosh），或去分析菜单，选择“措施”。这一行动将记录列出的区域平均灰度值并显示它在一个新的窗口。转到“分析”>9;设置测量......“，并确保”平均灰度值'被选中。选择任何其它的参数进行测量。
- 使用在步骤4.4.2.3.3中概述的相同的区域中，重复测量的每个感兴趣的荧光通道。结果将被追加到测量“结果”窗口中的前一个。
- 使用获得的测量在* statistics.csv文件替换错误的记录。如果核没有被分割，插入新行，指定一个新的小区ID，并介绍每个通道对应列下的ImageJ获得的值。这个单元将不具有空间坐标（X，Y和Z值）。如果核已经undersegmented，复制它的行，分配不同的小区ID的每一个新的细胞，并推出相应的列下的ImageJ获得的值。在这种情况下，两个单元将共享空间坐标。
注意：如果空间分布是待分析，我们recommend不含XYZ坐标这些细胞，因为它们将重叠。为此，创建新的记录时，分配小区ID对他们易于从原有的区分（例如，非整数）。
- 分数分裂的细胞。注意：MINS检测有丝分裂以及间期核，但他们不能区分。
- 如果有丝分裂核是要在分析分开考虑，手动得分这些和这个信息添加到数据文件中。要记录的有丝分裂细胞中，新的变量（列）添加到* statistics.csv数据文件，并分配不同的值有丝分裂和间期核。
- 解决过分割：
- 数据预加工。
注意：一旦电子表格已经纠正过冲和下分割他们准备进行分析。分析过程和数据显示将取决于具体的实验。不过，下面是一些一般的数据转换我们建议在分析之前执行：- 变换的荧光强度值到其对数或平方根来减少数据的散布。这也有助于可视化，作为原料的数据倾向于集中情节的轴附近（参见图4B，C）。
- 校正荧光的Z相关联的衰减：
注意：激光扫描共聚焦显微镜图像的荧光强度降低在Z更深轴切片的位置（ 图4E，F）。- 如果在样品中检测到的表位中的一个是普遍存在的，均匀表达管家核标记物，通过用持家标记的相应值除以它们的值在每个单元归一化的其他表位的荧光强度。
- 在不存在这样的参考标记，补偿以下列方式荧光的Z-相关损失：
- 绘制每个标记的值（Y图中）在Z位置（图的X轴）的轴在可视化中的Z强度的下降-积在一起的所有控制，野生型胚胎（图4F）的值。
- 适合的线性模型（回归曲线），以在先前步骤中获得的（强度超过Z值）为每个标记（ 图4F）的曲线图。
- 校正使用下列公式每个标记的所有值：
日志（原值）+ Z *模型（图4D，G）的 斜率。
注意：特定步骤来执行这种校正将取决于所用（R，MATLAB， 等）的分析软件。如果使用的R，运行下面的公式，以适应一个线性模型的数据：
> LM（日志（通道）〜Z，数据=数据帧）
式中， 信道是要校正的荧光通道中 ，Z为Z坐标和数据帧是包含用于所需胚胎（多个）（在*统计所有值表istics.csv由MINS或它的变形生成的文件）。
注意：上述式的输出将具有以下格式：
（拦截）z
4.76373 -0.01947
式中，值Z是回归线对于该数据集，其绝对值应该用于修改与在4.5.2.2.3给出的公式的原始值（见图4G的例子）的斜率。
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Representative Results
为了便于数据解释和介绍，应注意不要收集和操作过程中损坏的胚胎，使所有的细胞和它们的相对位置可分析图2A - D示出了在具有扩展腔的不同阶段的完整胚泡的例子。如果出现损坏，格外小心，应注意分析和解释结果时。
使用该协议生成的数据的质量和可靠性依赖于固定的质量和用于检测所关注的蛋白质的抗体的信噪比。总是用新鲜固定液和测试新的抗体，以适当的阳性和阴性对照，在开始一组实验之前， 图2A示出良好的抗体的例子为一些核蛋白质。 图2B示出为例为细胞质蛋白（DAB2）良好的抗体即图2C示出一个坏染色，具有低信噪比，其中所述样品固定为仅10分钟的一个例子。在这种情况下，用于GATA4的抗体（Santa Cruz，SC-1237）需要O / N固定提供了有力的信号（见24固定O / N和沾有这种抗体胚胎的情况下）。后处理过程中增加的信号电平揭示了一个非常嘈杂的形象。相比之下用于图2A（SC-9053）抗GATA4仅提供10分钟的固定后高信噪比。在材料部分提供了这些细节和其他强大的抗体。
一个良好的MINS分割的限制因素是：a）用于成像的物镜的倍率，B）的Z分辨率和c）的核染色的质量。 图2D示出了具有OI成像胚胎的例子升浸泡40倍物镜与1.30 NA和0.21毫米WD。中间面板显示其中单个核和它们之间的边界可以被区分的ICM的倍率。如果不使用DNA染色（即，赫斯特，DAPI，TO-PRO3，YO-YO1 等 ）用于定量荧光值，采集参数可以单独调整，以获得最佳的信号。底部图显示如何更先进的胚胎，较高的核密度，因此较高的分割误差（箭头和箭头）的可能性。 图3显示的错误，MINS可以提交，如检测凋亡细胞核作为活细胞的例子（星号在板图3AA，抗体，广告 ），过分割（箭头和图3AC）或欠分割箭头（图3AD箭头 ）。 图3B示出了根据分割事件中的Z-片的序列，在两个细胞已被确定为一个。注意MINS分割如何进行Z轴顾及到段包含所有切片其中给定细胞存在的体积。
最后，数据分析的细节将取决于问题进行研究，因此，对于分析过程准则不能在这里给出。然而，我们已经发现某些初始数据转换是有用的图4B。 - D显示 了图4A中所示的标记NANOG和GATA6在胚胎的ICM的荧光值的曲线图。图4B示出了从MINS获得的原始荧光值图4C示出了一个对数变换，它从小区分隔值之后的同一数据轴（平方根变换也是可能的，并产生了类似的曲线图）。 图4D示出了（的不足和过度分割手动校正后）自动℃后相同的数据orrecting的值在荧光的Z相关联的衰减，如在该协议的步骤4.5.2.2说明。这个Z-相关的荧光衰减的例子在图4E的图像和4F地块中给出。 图4G显示了数据转换的效果4.5.2.2解释。代表任一外胚层（红，NANOG + GATA6-）或前（蓝色，NANOG-，GATA6 +）同一性的颜色已被添加到情节作为NANOG和GATA6值的函数。在这个特殊的例子中，电池，其中日志[GATA6]的比率/日志[NANOG]> 1.25被认为是预，其中日志[GATA6]的比率/日志[NANOG] <1被认为是EPI细胞，并与一中间的细胞率被认为是未提交（在此情况下，无）。所有数据转换和重复已经于Rstudio已经完成，但是，软件的选择不是关键的，并且将取决于最终用户。
图1.胚胎位置，时间轴和分析管道。（A）一图（二）小鼠子宫角和早期胚胎发育的阶段，他们应该找到喇叭的区域对齐。 （B）的每个步骤的定时的试验的时间表。的协议和暂停点（蓝色）的步骤表示。 （C）图像采集和使用敏思分析管道的总结。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.免疫荧光和核密度 （A） 的例子。与核TR测试抗体的免疫良好效果的例子anscription因素。用AlexaFluor 488驴抗小鼠次级抗体，抗GATA6与AlexaFluor 568驴抗山羊检测抗CDX2，抗NANOG与AlexaFluor 647驴抗兔，抗GATA4（圣克鲁斯，SC-9053 ）与AlexaFluor 488驴抗兔和抗Oct4与AlexaFluor 647驴抗小鼠。所有初级抗体都列在材料表 。胞质GATA4的核染色是非特异性的，并且也出现在GATA4空胚胎（未示出）。为胞浆蛋白，DAB2良好的免疫荧光（B）为例。它已被用AlexaFluor 488驴抗小鼠检测。坏免疫的（C）的实施例，具有低信噪比的核因子。 GATA4已检测与山羊提出了一个抗GATA4（圣克鲁斯，SC-1237;而SC-9053（兔抗GATA4）在用（A））和AlexaFluor 568驴抗山羊。 （
图3.敏思错误的示例。（一）个人Z-部分从一个胚胎顺序显示敏思分割错误的例子。它们仍然确定为核细胞凋亡被标记在图a，b和d以星号（*）。在图b，编号＃39（箭头），尽管很小，并确定相应的核，因此可以向左校正。在C组，ID＃66（箭）跨越两个不同氮uclei，这些反过来又被单独列出（箭头，编号＃65＃54和＃53）。在面板D，两个小区（编号＃63）已经被确定为一个单独的之一（见箭头标记薄边界），因此此记录应被复制用于细胞计数的目的。 （B）的MINS检测沿着Z轴的细胞。图像显示已错误地评价为一个单一（＃123）的两个单元中的Z-片的序列。注意蓝色区域划定核是如何沿着Z.连续请点击此处查看该图的放大版本。
图4.分割和数据转换的例子。（A）染色NANOG和胚泡的ICM细胞GATA6和相同的核分割的快照图像利用胚胎在核染色通道敏思（赫斯特33342）。在由MINS测定的ICM细胞（BD）NANOG和GATA6荧光值描绘为原始数据（B）中，在执行对数转换（C）的后沿Z轴的荧光衰变校正值和自动分配根据校正小区身份后值（D）。 （E - G）沿Z轴的荧光衰减数据修正的例子。 （E）的标记用Hoechst和抗CDX2 + AlexaFluor 488（AF488）胚泡，示出了沿Z轴荧光减少图像（F）沿赫斯特和AF488 Z轴为胚胎包括在（E）中所示的一个的池荧光值的散点图。灰线表示各组的值的回归曲线。 （G）相同的数据，在F中补偿荧光衰减为每个单元后，使用以下因素：Z坐标*线性模型的斜率（见步骤4.5.2.2在协议）。 图 E -克的最初由节点中的作者发表（http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/）每个点代表一个细胞。规模=20μm的。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 用户输入 |
| 亮度阈值*（方便在昏暗的图像核探测） |
| 相对X / YZ分辨率 |
| 渠道细分 |
| 核径 |
| 图像噪声水平 |
| 敏思输出 |
| 细分Z-堆栈nuclEI标识 |
| 核量 |
| XYZ坐标每个细胞核 |
| 平均和荧光值的总和，每个荧光通道和细胞核 |
| 优点 |
| 整个堆核精确分割（> 85％） - 认识到相邻的Z-部分细胞核的所有出现 |
| 单细胞分辨率 |
| 胚胎批次的无监督分割 |
| 分割管道可以被保存并重新使用或调整为每个特定胚胎 |
表1.敏思特点
| 加载图像 | 在提示符下，引入的Z轴相对分辨率图像。它可以从使用默认阅读器或应用以下公式文件元数据来获得：X（或Y）分辨率/ Z轴分辨率（都在微米）。 |
| 输入的序列号（1 - 5）的信道进行分割。使用用于分割该DNA染色通道将检测所有单元的图像中的，但是，其他信道可以单独地也分段。 | |
| 输入框在（默认1）开始分割。仅适用于具有多个时间框架的文件。 | |
| 提高图像（可选） | 图像的白色和黑色点可以调整，以方便检测。通常降低了白点和再扩展到0 - 255（8位图像）或0 - 4096（12位图像）将会使图像更亮，并促进暗淡核检测。 |
| 检测核 | 选择所估计的核直径（在囊胚通常在30和40像素）。 |
| 对于噪声图像的噪声水平可以被调整。否则，默认值将被应用。 | |
| 段核 | 使用默认参数。 |
| 分类核 | MINS可以在基于位置植入前胚胎区分内细胞团（ICM）细胞滋养外胚层（TE）。这也可以手动完成，或基于荧光的水平，如果使用的TE标志。 |
| 导出结果 | 选择要产生的文件： |
| - 细分覆盖在使用的信道（.TIFF序列文件） | |
| - 分割只（.TIFF序列文件） | |
| - 电子表格的ID对检测到的所有细胞中，XYZ坐标，并为每个单元（.csv文件）所有通道荧光水平（平均总和）。 | |
| 所有文件默认情况下出口。文件保存在SAME目录为图片所在。 |
表2.敏思分割管道
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Discussion
本协议描述在植入前阶段的小鼠胚胎进行全挂载免疫荧光定量分析的方法。一个强大的免疫协议22后跟高分辨率，整个安装使用定制的软件4聚焦成像和图像分割。而免疫协议的选择不是关键，我们发现这里呈现22是快速，可靠，并为许多我们已经测试了抗体的提供可靠的信号之一。其它协议可遵循，条件是它们的应用是在整个等效实验一致。虽然许多因素会影响每个单独的实验的实验之间的结果，并直接比较不一定可能的，我们已经发现，在重复追求一致性和执行足够技术重复大大降低可变性。因此，一旦进行了优化，固定和immunolabelin克试剂和方案，以及摄像条件应保持等效实验之间恒定。
1）质量差染色，以暗信号，以及2）不理想的分割，具有很多错误（即，过冲和下分割）：这协议秋季的应用过程中可能出现成两组的主要问题。低质量免疫通常是由于样品的定影不当或不适合于整个安装免疫的抗体。确保PFA是新鲜的（无论是新鲜制备或者从-20ºC解冻RT不超过前一个星期）。由于植入前胚胎的体积小，10分钟内固定PFA应该足够了。然而，我们已经发现某些抗体具有较长的固定时间（见材料），以产生较强的信号。如果先前已经测试了一种抗体，提供了弱信号，尝试不同的固定协议。并非所有的抗体上的强劲执行整个安装IMMunofluorescence和初级抗体的选择是在实验的结果是至关重要的。新抗体应当对胚胎进行测试和最佳浓度根据经验确定。在Materials图表我们提供我们已经测试和经常使用的一些抗体的细节。考虑新的抗体时，请参考发表的文献和制造商的信息。注意，不适合在Western印迹工作的所有抗体整个安装免疫荧光，和必要的免疫荧光的浓度可以幅度更高的高达一个数量级。商业次级抗体通常工作良好开箱，但是，是在利用主 - 辅抗体组合的整个等效实验认为将要被比较一致。
图像分割的质量取决于核染色的质量和在胚胎的ICM的核密度。永远追求光明，尖锐的细胞核，并使用高分辨率物镜（40X或更多）。如果核染色信号为低，则使用新鲜等分试样或一个新批。只要核染色不用于定量，采集参数可以为了记录锐利，明亮的核被调节为每个胚胎。同样地，如果比核染色另一个信道用于分割，该特定信道的信噪比将决定分割的质量。晚期囊胚（E4.0起）在ICM中存在一个非常高的核密度。因此，它是在这些阶段高质量的染色是最关键的。然而，分割的错误会发生经常在这几个阶段。引进核估计直径在敏思管道的图像噪声水平，探索利用“查看”按钮，每一步的结果，直到获得满意的结果调整参数。使用产生最佳分割参数数据处理过程中并手动更正错误。注意，延迟阶段的胚胎（〜E4.5）具有较高的细胞计数和手工数据校正将是费时的。
这个协议的限制由用于图像采集的共焦显微镜系统确定。如所讨论的，使用高放大倍数的物镜，具有工作距离，该距离允许整个胚胎的Z轴成像（ - 直径160微米的着床前的小鼠胚胎可高达150）。同样地，可以检测表位的数量将信道显微镜可以采集一次的次数来确定。使用该协议，除了该DNA三种不同的表位（4个通道中的数量），可以同时在每个样品上标记。确保仪器校准对于每个荧光通道，门控优化和激光输出是一致的。
此处所描述的方法允许的单元位置沿所述分析XYZ轴以及蛋白质表达水平的原位量化为在小鼠胚泡每一个细胞。根据我们的经验，使用其他可用的软件替代方法不能提供高分辨率的水平，在这个协议中采用的管道能（见第4与其他工具的直接比较）。在囊胚的ICM中发现的高核子密度导致其他工具来生成了这么多的错误，需要手动校正的程度，使它们的使用是不切实际的。替代地，手动细胞计数和荧光测量已经先前用于细胞亚群或胚胎10,11,18,19,24的限定区域。然而，所有的荧光通道和单元位置，在所有的XYZ轴，为几十存在于每个胚胎细胞的人工计数和测量会如此费时，这将不允许为哪些我们的协议被设计出来的高通量分析时间。此外，说明书一荧光水平的ssessment容易发生偏差，而管道如这里所描述的允许荧光强度为小区身份的后续判定的客观测量。为了分配小区标识，研究者应当建立规范的准则，所有样品被应用于设置一个特定的实验。考虑到各种因素 - 生物技术 - 可以影响免疫标记的结果，这个标准应该采用适当的控制实验和此前公布的数据尽可能确定。我们设想一个近期，其中的算法可以被设计为自动确定小区标识无论实验。然而，这样的工具将仅来自更广泛的应用和电流的方法，最有可能加上机器学习算法的改进。
最后，鉴于这条管道的简单性和定型吗啉小鼠植入前胚胎的术，该协议是为大量胚胎的分析可轻松扩展，从而使空表型5,6或任何其他实验操作7的高通量分析。最后，虽然当前协议已被设计和植入前小鼠胚胎和ESC集落的分析而优化，我们认为没有理由先验为什么它不能被应用到其他系统具有类似特征-即高核密度。我们鼓励其他国家尝试并适应该协议的其他方案，并为今后的改进提供反馈。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
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