Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.
Abstract
פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע כמוני, תא בודד באתרו מנתח של ביטוי חלבון ללמוד מפרט שושלת בעוברי preimplantation עכבר. הנהלים הדרושים אוסף העובר, immunofluorescence, הדמיה על מיקרוסקופ confocal, ופילוח תמונה וניתוח מתוארים. שיטה זו מאפשר לכמת את הביטוי של סמנים גרעיניים מרובים ואת מרחבית (XYZ) קואורדינטות של כל תאים בעובר. הוא מנצל MINS, כלי תוכנה פילוח תמונה שפותחו במיוחד עבור ניתוח של תמונות confocal של עוברים preimplantation ואת תאי גזע עובריים מושבות (ESC). MINS מבצעת פילוח גרעיני ללא פיקוח ברחבי ממדי X, Y ו- Z, ומייצרת מידע על מצבת תא בחלל תלת ממדים, כמו גם רמות קרינה גרעינית עבור כל ערוצים עם קלט משתמש מינימאלי. בעוד פרוטוקול זה בצורה מיטבית עבור הניתוח של תמונותשל עוברי עכברים בשלב preimplantation, זה יכול בקלות להיות מותאם הניתוח של כל דוגמאות אחרות מפגינות יחס אות לרעש טוב ואיפה צפיפות גרעינית גבוהה מציבה משוכה פילוח תמונה (לדוגמא., ניתוח ביטוי של תאי גזע עובריים (ESC מושבות), הבחנת תאים בתרבית, עוברים של מינים אחרים או בשלבים, וכו ').
Introduction
עובר preimplantation העכבר הוא פרדיגמה ללמוד את הופעתה ותחזוקה של pluripotency in vivo, כמו גם מודל לחקר מפרט גורל תא דה נובו epithelialization ביונקים. שלבי preimplantation של פיתוח יונקים מוקדשים הקמת שלוש שושלות התאים שמרכיבים את הבלסטוציסט, כלומר epiblast פלוריפוטנטיים - אשר מוליד את רוב הרקמות סומטיים בתאים ניבט - ושתי שושלות extraembryonic, את trophectoderm (TE) ואת endoderm פרימיטיבי (PRE) (איור 1 א) 1,2. פרוטוקול זה מתאר את הנהלים (1) הקציר ולתקן עוברי עכברים בשלב preimplantation, (2) לבצע immunofluorescence לתייג חלבונים בעלי עניין, (3) לבצע כל הר הדמיה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם יכולות חתך-z ו- (4) לבצע פילוח הגרעין של תמונות confocal ומנתח תמונה כמותית שלאחר מכן. צינור זה מאפשר tהוא משוחד מדידת רמות החלבון בגין המחאת זהויות תא לאפיין תת-אוכלוסיות של תאים באתרו. פרוטוקול זה יכול להתבצע בתוך זמן קצר של 3 - 4 ימים עבור המלטה אחת (בדרך כלל עד 10 עוברי עכברים), מאוסף העובר בניתוח הנתונים (איור 1B). הניתוח סימולטני של המלטות כמה יגדיל את ניתוח ההדמיה ונתונים נטלו הזמן, ובכך להאריך את אורכו הכולל של פרוטוקול.
עובר העכבר הבמה preimplantation הוא מערכת צייתנית באופן ניסיוני אשר, בהינתן גודלו הקטן וסטריאוטיפית מורפולוגיה 3, הוא גם מתאים בתחום הדמית טוטו של תהליכים תאיים עם רזולוצית תא בודד. כדי לבצע ניתוח משוחד, מערכות ברמה של מספר סטטיסטית הרלוונטי של עוברים, אוטומטית, צינור ניתוח כמוני רצוי. עם זאת, בשל צפיפות גרעיני גבוה של מסת התאים הפנימית (ICM) של הבלסטוציסט (
צינור הניתוח שמובא כאן סובב סביב כלי הפילוח המבוסס תמונת MATLAB הפילוח הגרעיני האינטרקטיווי מודולרי (דקות) 4. MINS performs פילוח גרעיני ללא פיקוח על קבוצות גדולות של ערימות-Z confocal לאחר שמשתמש קימת מספר מינימאלי של מאפייני תמונה, באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI) (טבלה 1) 4. צינור זה הוכיח עצמו יעיל עבור דור של נתוני העברת נתונים גבוהים על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא סוג שני בר, מטופלים בניסוי וגנטי עוברת משונה ESCs 5-7. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את היישום של דקות עד פילוח תמונות העובר preimplantation הבמה. לדוגמאות של ביצועים MINS על ESCs עיין 4,7. הצעד פילוח גרעיני אוטומטי מפחית באופן משמעותי את נטל הזמן של תהליך זיהוי התא, ואילו מדידות עוצמת מרחבית הקרינה לאפשר קביעה משוחדת של זהויות התא לבין הדור של מפות תלת-ממדיות של תחומים ביטוי גנים בעמדה תא בעובר (איור 1C 5,6. MINS זמין באופן חופשי http://katlab-tools.org (התוכנה דורשת רישיון MATLAB).
אין גישה שפותחה עד היום מאפשר הדור של נתונים מעמיקים כזה על ביטוי חלבון ולוקליזציה תא עוברי preimplantation העכבר. כל הניסיונות עד כה ב לכימות סוגים אלה של נתונים הוגבלו על נחישות quantitation ידני של מספרים סלולריים עבור אוכלוסיות שונות בעובר (או לגמרי באופן ידני, או תוכנה בסיוע) 9-19. הגישה זו (שילוב תוכנה דקה) כבר מותאמת ונבדקה על עוברי preimplantation עכבר ESCs; זאת ביצועיו על מערכות אחרות עם צפיפות גבוהה גרעינית, למרות עדיין נבדק, צפויים להיות שווה ערך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: כל העבודה מן החי, כולל בעלים, רבייה וקרבה אושרה על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי של מרכז סרטן קטרינג סלואן זיכרון ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 03-12-017.
אוסף עובר 1.
הערה: כל עבודת החיה חייבת אושרה על ידי הרשויות מוסדיות המקומיות להתאים חוקים מקומיים ומוסדיים.
- Mate עכברת בתולה עם זכר הרבעה פורה של גנוטיפים הרצוי.
הערה: אם הגדרת הזדווגויות טבעיות, בחירה והנשים בשלב הייחום של מחזור estral מגדיל את הסיכוי של הזדווגות במועד הרצוי. אם גרימת superovulation, עיין בפרוטוקולים המתוארים 20. - בדקו את הנוכחות של תוסף נרתיק בבוקר באמצעות בדיקה בוטה. באופן אידיאלי, לעשות את זה לפני הצהריים (12:00 בצהריים), כמו אטמי הזדווגות אובדים לאורך כל היום. שקול noon של זיהוי של היום עוברי תוסף הנרתיק (E) 0.5.
- ביום הרצוי והשעה של ההתפתחות העוברית, להתחמם M2 או בינוני מחזיק שטיפה (FHM) כדי RT או, עדיף, 37 ºC. הערה: או M2 או FHM יכול לשמש שטיפה עוברת טיפול. כאשר אינו בשימוש, אחסן מדיה אלה ב 4 ºC. להעריך את השימוש ~ 2 מ"ל של מדיום לכל הרחם.
- paraformaldehyde הקפוא 4% ההפשרה (PFA) ב בופר פוספט (PBS) או להכין איזה פתרון טרי. מעריכים 500 μl של פתרון PFA 4% לכל גם צלחת 4-היטב. תקן המלטה אחד על אחד גם צלחת 4-היטב. הערה: לחילופין, צלחת 96-גם יכול לשמש כדי לתקן עוברים חנות. אם באמצעות צלחת 96-היטב, השתמש 100 μl של פתרון PFA לכל טוב.
- משוך פיפטה כוס פסטר באמצעות להבה פתוחה לצייר סוף נימים בקצה.
- קורבן נקבה ידי נקע בצוואר רחם או שאיפת CO 2, או כנדרש על פי תקנות מקומיות ומוסדיות. זה בדרך כלל desirablדואר כדי לאשר המתת חסד של בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם.
- תרסיס הבטן של חיה עם 70% אתנול למזער שפיכת שיער לבצע חתך בבטן, ראשון דרך עור ובהמשך דרך קיר הגוף (הצפק) לחשוף את הקרביים.
הערה: השלבים הבאים מתארים את הליך לאסוף blastocysts מן הרחם של עכברה בהריון בכל שלב בין E3.25 ו E4.5 (איור 1 א). עבור פרוטוקולים על אוסף של עוברי preimplantation מוקדם יותר E3.25, מתייחסים ל -20. - אתר את הרחם ולהסיר מן החיה. אוחזים בקצה צוואר הרחם של הרחם עם זוג מלקחיים, לחתוך דרך צוואר הרחם ולמשוך בעדינות למתוח הן קרני הרחם.
- Trim שומן מן הרחם, נזהר שלא לנקב את דופן הרחם. ניתן לעשות זאת בקלות בבית בעת ההרחקה, תוך שהיא עדיין מחוברת לגוף של בעלי החיים, כמו הרחם יכול להיות שרוע. לחילופין,ניתן לעשות זאת מאוחר יותר, תחת מיקרוסקופ לנתיחה, ב RT PBS. עבור פרוטוקול מפורט יותר על דיסקציה של רחם, ראה פרוטוקולים 5 & 8 20
- חותכים מעל oviducts, מתחת השחלות, כדי לשחרר את הרחם, המקום כולו על צלחת פטרי ולכסות עם PBS.
הערה: צעד זה גם מאפשר רחיצת דם עודף או ופסולת אחרת מן הרחם, אשר הופך לפשוט קציר הבלסטוציסט שלאחר מכן. - נפרד הוא רחם קרני על ידי חיתוך דרך הקצה הפרוקסימלי, משני צדדים של צוואר הרחם וזורק את צוואר הרחם. הפרד בין oviduct מן הרחם על ידי חיתוך מתחת מצר שמחבר אותם (איור 1 א). העבר הן קרנות כדי ירידה של מדיום מניפולציה (או M2 או FHM) לאיסוף מניפולציה עוברים.
- תחת מיקרוסקופ לנתיחה, blastocysts סומק מתוך הרחם לתוך המדיום ידי אילוץ 0.5 - 1 מ"ל של M2 או FHM דרך כל קרן הרחם מפתיחת צוואר הרחם. השתמש 1מזרק מ"ל עם מחט hypodermal. הערה: מחט ניתן קהה באמצעות אבן הגשה כדי למנוע קריעה של uteri, אם כי זה לא קריטי. שרטוט מפורט עבור שטיפת רחם ניתן למצוא 21.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, לאתר את blastocysts, אשר יהיו פזורים ברחבי ירידה של המדיום. אפשר עד 1 - 2 דקות עבור blastocysts לשקוע בתחתית המנה לאחר שטיפה. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, שבשליטת הפה עם סוף נימים, לאסוף את כל blastocysts ולהעביר לירידה טריה של תקשורת.
- לשטוף blastocysts ידי העביר דרך 2 - 3 טיפות של M2 הטרי או FHM. הזז עוברים בקבוצות של 5 - 10 blastocysts בכל פעם.
הערה: העברת קבוצות גדולות בכל זמן נתון יהיה לזרז את התהליך, אבל זה יהיה גם להגדיל את הסיכוי לאבד עוברים רבים בטעות. אם לא מאומן בשימוש טפטפות שבשליטת פה, תרגול מניפולציה העובר והעברה צריך להיחשב לפני beginning הניסוי. - הסר את המעטפת השקופה (ZP) מ blastocysts שלא נולדה (בדרך כלל <E4.0) על ידי שטיפה אותם בקצרה בתמיסה של Tyrode חומצי. ברגע ZP כבר אינו נראה לעין, להעביר blastocysts חזרה מדיה מניפולציה. רק לשמור עוברים בחומצה Tyrode של עוד הכרחי, על מנת למנוע נזק לתאים.
- תשמור על עצמך בעת טיפול blastocysts הערום, כפי שהוא לדבוק בקלות על משטחי הזכוכית ופלסטיק. מניפולציה בינוני מכיל 4 מ"ג / מ"ל של אלבומין בסרום שור (BSA) כדי למנוע עיקול, אך חומצה Tyrode של או PBS לא, ולכן, כדי להפחית את הסיכון של נזק או אובדן של העוברים לא להרים יותר מ 2 - 5 blastocysts הערומים בכל פעם כאשר מניפולציה אותם BSA חינם או סרום ללא PBS או חומצה Tyrode של.
הערה: לחילופין, מעיל פיפטה זכוכית עם 1% BSA לפני השימוש כדי להפחית הדבקות של עוברים אל משטח זכוכית.
- תשמור על עצמך בעת טיפול blastocysts הערום, כפי שהוא לדבוק בקלות על משטחי הזכוכית ופלסטיק. מניפולציה בינוני מכיל 4 מ"ג / מ"ל של אלבומין בסרום שור (BSA) כדי למנוע עיקול, אך חומצה Tyrode של או PBS לא, ולכן, כדי להפחית את הסיכון של נזק או אובדן של העוברים לא להרים יותר מ 2 - 5 blastocysts הערומים בכל פעם כאשר מניפולציה אותם BSA חינם או סרום ללא PBS או חומצה Tyrode של.
- מעיל התחתון של כל טובשל הצלחת בתרבית רקמה 4-היטב עם שכבה דקה של אגר 1%, 0.9% NaCl כדי למנוע עובר מן דבקות הפלסטיק. לחלופין, להוסיף 4 מ"ג / מ"ל של BSA אל PBS (PBS-BSA).
- מלאו גם אחד של המנה בתרבית רקמה 4-היטב מצופה 500 μl של PBS RT (או PBS-BSA) ועוד היטב עם 500 μl של 4% PFA ב PBS.
- לשטוף blastocysts ב RT PBS ולתקן ב 4% PFA ב PBS במשך 10 דקות ב RT. מעבירים PBS (או PBS-BSA) לאחר קיבוע.
- אם עובר לא הולכים להיות מעובד מייד, מכסה את PBS המכיל את העוברים עם שכבה של שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי (שמוביל התייבשות של מדגם) ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: שיטות קיבוע שונות ובזמנים ניתן להשתמש בהתאם הניסוי, אפיטופים ריבית לבין הנוגדנים לשמש. לפי שיטת הבחירה, להיות עקבית לאורך ניסויים שווים להקלת ההשוואה הבאה של התוצאות המכתימות.
הערה: השההניתן לאחסן עוברים ב 4 ºC ב PBS עד כמה שבועות לפני שתמשיך לשלב הבא: נקודה. ודא PBS הוא סטרילי ו / או להוסיף 100 U / ml של פניצילין + 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (עט סטרפטוקוקוס) על מנת למנוע זיהום חיידקי (במיוחד כאשר באמצעות PBS-BSA) אם מראש אחסון ממושך.
2. Immunofluorescence
- בצע immunofluorescence באמצעות כל פרוטוקול כי נבדק בעבר והוכח חזקים immunofluorescence כל הר. הערה: אנו ממליצים אלה המתוארים 22 ו -11. במאמר הנוכחי לשעבר יתוארו. לפי שיטת הבחירה, להיות עקבית לאורך ניסויים שווים להקל על ההשוואה של התוצאות המכתימות.
- השתמש, פוליוויניל גמישה, ברור, U-בתחתית הצלחת 96-היטב לבצע את הצעדים סדרתי של פרוטוקול immunofluorescence. ממלא כל טוב עם 50 - 100 μl של פתרון ולעבור עובר מפתרון אחדלמשנהו באמצעות פיפטה בפה בצורת L. הערה גישה זו מפחיתה את צריכת חומרים כימיים ומקל צעדים מעקב כמו גם מכתים מקביל של קבוצות הניסוי מספר.
- אופציונלי: מעיל התחתון של בארות עם שכבה דקה של אגר 1%, 0.9% NaCl כדי למנוע הידבקות של עוברים אל פלסטיק. אל תוסיף BSA לפתרונות immunofluorescence.
- כן PBX (0.1% Triton X-100 ב PBS). אם מראש את ביצוע ניסויים immunofluorescence כמה, להכין 50 מ"ל של PBX ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בין הניסויים.
- כן פתרון permeabilization (0.5% טריטון X-100, גליצין 100mm ב PBS). הפוך 1 מ"ל (או לפי הסכום הדרוש) של פתרון permeabilization טרי עבור כל ניסוי.
- כן פתרון לחסימה (סרום סוס 2% (HS) או 20% בסרום שור עובר (FBS) עם העט-סטרפטוקוקוס ב PBS). הכן 10 מ"ל ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בין הניסויים.
- לא נמצאו הבדלים נצפו בין אםסוג של סרום, עם זאת, להיות עקבי בבחירת פתרון לחסימה המשמש בניסויים מקבילים.
- שטפו עוברי קבוע במשך 5 דקות ב RT ב PBX (~ 100 μl).
- Permeabilize עוברים במשך 5 דקות ב RT בתמיסה permeabilization (~ 100 μl).
- לשטוף עוברים במשך 5 דקות ב RT ב PBX (~ 100 μl).
- עובר בלוק למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
הערה: עובר יכול להיות חסום עד O / תקופות N ב 4 ºC ללא שיפור ניכר או לרעה כשמשווות 30 צעדי חסימת דקות. - דגירה עוברת O / N ב 4 ºC ב נוגדן ראשוני / נוגדנים מדוללים חסימת פתרון (~ 100 μl). מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
- לקבוע דילול אופטימלי עבור כל נוגדן ראשוני לפני כן. ראה דסעיף iscussion וחומרי דילולים נבדקים של מספר הנוגדנים.
- לאחר דגירה O / N, לשטוף עוברים 3x עבור 5 דקות כל אחד ב RT PBX (~ 100 μl).
- עובר בלוק למשך 30 דקות עד 1 שעה ב RT ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
- דגירה עוברת 1 עד 2 שעות ב 4 ºC נוגדן / נוגדנים משני מדולל ב 4 מיקרוגרם / מיליליטר ב ~ 100 μl של פתרון לחסימה. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
- עוברים לשטוף 2x עבור 5 דקות כל אחד ב RT PBX.
- זז העוברים כתם DNA עדיף. אם באמצעות Hoechst 33342, לדלל עד 5 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS. מכסה את הפתרון בשכבת שמן מינרלים על מנת למנוע אידוי או לשמור בתא humidified.
הערה: נקודת השהה: אם עוברים אינם צילמו מיד, הם יכולים להישמר במשך up לכמה שבועות בתמיסה מכתימה גרעינית. במקרה זה, להבטיח PBS הוא סטרילי ו / או להוסיף פן-סטרפטוקוקוס או נתרן אזיד כדי למנוע התפתחות חיידקים וזיהום.
3. הדמיה Confocal
הערה: תצורות מיקרוסקופ confocal פרט תדרושנה פרמטרי רכישה ספציפיים להיות מותאם עבור מערכה והתוכנה במקום. עם זאת, בסעיף הבא מספק סט של חוקים כלליים לעקוב שאמורה לחול על כל התקנה נתונה.
- בעזרת פיפטה בפה בסדר, לעשות microdrops של PBS או פתרון גרעיני כתם על משטח הזכוכית של צלחת זכוכית תחתונה 35mm ומכסי שמן מינרלים. כחלופה, להשתמש coverslip רגיל עם מפרידי סיליקון כדי למנוע נזק עוברי ומכסים שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. הערה: בעת שימוש coverslip קבוע, עובר לא יכול לאחר מכן לשנות את מיקומו או התאושש עבור גנוטיפ, ולכן אנו ממליצים בחום על שימוש של זכוכית תחתונהכלי אוכל.
- עוברים מקום ב microdrops ולסדר באופן העולה בקנה אחד, רצוי עם מקביל לציר ICM-חלל אל משטח זכוכית. הגדרת צלחת על בעל מיקרוסקופ. הערה: תמונות מתקבל על מיקרוסקופים confocal סריקת לייזר סובלים הפסד הקשורים ציר Z של עוצמת הקרינה. לכן, העקביות בהסדר חשובה להשוואת עוצמות בין אזורים השווים על עוברים שונים.
- הגדרת פרמטרים להתייחסות באמצעות עוברים סוג בר שלא הייתם כפופים לכל סוג של טיפול שעשוי לשנות ביטוי גנים.
- לרכוש תמונות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה (כלומר, 40X ומעלה) על מנת לקבל נתונים שיאפשרו פילוח מדויק באמצעות כלי -4 דקות נוספות.
הערה: שימוש בזום דיגיטלי על מטרת 20X לא יניב תמונות ברזולוציה של הולם הפילוח באמצעות דקות. כדאי גם לציין את מרחק העבודה (WD) של המטרה, כפי שהוא אמור להיותמספיק כדי לאפשר רכישה של מחסנית Z כי משתרע על פני הבלסטוציסט כולו, ובכך ארוכה WD (~ 130 - 150 מיקרומטר) המטרה היא בדרך כלל יש צורך. התמונות מוצגים איורים 2 - 4 נרכשו באמצעות טבילה אובייקטיבי 40X / NA 1.30 שמן עם מרחק עבודה של 210 מיקרומטר. - השתמש בפלט לייזר הנמוך ביותר המספק יחס אות לרעש חזק בלי הלבנת fluorophores.
- התאם את הרווח לקזז להשיג את הטווח הדינמי הרחבה ללא overexposing המדגם. חשיפת תמונות כדי לכסות את רוב, או להקיף את מגוון התמונה במלואה, אפור יקל על זיהוי ההבדלים קטנים בעוצמה בין התמונות.
- השתמש צעד Z קטן (1 מיקרומטר), מאז החלטת ציר Z היא קריטית עבור פילוח מדויק עם דקות.
הערה: ממדי XY אינם משפיעים על תהליך הפילוח הגרעיני, רק את קובץ תמונה. באופן כללי, 512 x 512 פיקסלים היא החלטה XY מספיק תמונות פרסום באיכות ללא compromiלשיר מקום בכונן הקשיח. - צעד קריטי: שמור הדמית פרמטרים עקביים בתוך ועל פני הפעלות הדמיה של אותו הניסוי כדי להיות מסוגל להשוות בין דגימות.
- לרכוש תמונות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה (כלומר, 40X ומעלה) על מנת לקבל נתונים שיאפשרו פילוח מדויק באמצעות כלי -4 דקות נוספות.
- הדמיה אצוות של עוברים:
- קבוצות תמונה קוהרנטית (המלטות, ניסויים) בפגישה אחת בכל הזדמנות אפשרית.
- שמור פרמטרים עקביים בתוך ועל פני הפעלות הדמיה עבור משכפל של אותו הניסוי.
- עוברים תמונה לאורך (כל ציר Z) כדי ללכוד כל תא.
הערה: אם תרצה, גנוטיפ העובר עלול להיעשות לאחר הדמיה כמתואר 23. הצורך PCR מקוננות צריך להיקבע באופן אמפירי ויהיה תלוי את הלוקוס להיות מנותח ואת פריימרים בשימוש.
- הקפד תוכל להתאים עובר לתמונות למפרע.
תמונה 4. ניתוח נתונים טרום עיבוד
- הורד והתקן MINS 4 מ- http: // Katlab-tools.org (רישיון MATLAB חובה).
- בצעו פילוח תמונה:
- בצע את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של דקות עד לטעינת תמונה confocal או מחסנית מהכונן הקשיח, לזהות את הגרעינים ואת לפלח את התמונה. טען את מחסנית Z כולו של נתונים גולמיים שהופקו על ידי מיקרוסקופ (.lsm, .lif, .oif, וכו '). ראה טבלה 2 לפרטים על כל צעד והוראות למצוא http://katlab-tools.org ו -4. לאחר השלמת, להציג את התוצאה של כל שלב על ידי לחיצה על כפתור 'הצג' המתאים. תג צהוב מעל הכפתור מציין פעולה בתהליך, תג ירוק מציין מסיים את המבצע.
הערה: MINS אינו תומך בשלב זה קבצי .czi, .tiff רצפים או קבצים מרובים מיקום - כל מחסנית Z צריכה להיות קובץ עצמאי. - לאחר פילוח משביע רצון, להציל את צינור נוצר כדי שניתן יהיה להשתמש בהם ישירות על עוברי או המלטות אחרות.
- בצע את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של דקות עד לטעינת תמונה confocal או מחסנית מהכונן הקשיח, לזהות את הגרעינים ואת לפלח את התמונה. טען את מחסנית Z כולו של נתונים גולמיים שהופקו על ידי מיקרוסקופ (.lsm, .lif, .oif, וכו '). ראה טבלה 2 לפרטים על כל צעד והוראות למצוא http://katlab-tools.org ו -4. לאחר השלמת, להציג את התוצאה של כל שלב על ידי לחיצה על כפתור 'הצג' המתאים. תג צהוב מעל הכפתור מציין פעולה בתהליך, תג ירוק מציין מסיים את המבצע.
- פילוח תצווה-Mode:
הערה: Siניתן לפלח קבצים ngle בנפרד. עם זאת, בהתחשב בכך עובר בתוך המלטה או ניסוי הם בדרך כלל שלב השוואה, MINS יכול להחיל את צינור הפילוח נוצר עבור תמונה אחת לקבוצה של אותם ללא השגחה.- מתוך אצווה-Mode בתפריט Run, לחץ על 'הוסף קבצים' ולטעון את כל הקבצים להיות מעובד בו זמנית. הערה: קבצים ממקורות שונים ניתן להוסיף לתור פילוח.
- לחץ על 'התחל תצווה מצב הפעלה "ולאפשר פעמי עבור תוכנה לעבד את הקבצים. הערה: פלט פילוח יישמר באותה ספרייה שבה נמצא קבצים המקוריים שבו ממוקמת.
- הערכת פילוח ו תיקון ידני
הערה: MINS מגזרי תמונות ברמת דיוק גבוה מאוד (> 85%), לעומת זאת, איכות מכתים ההדמיה, כמו גם את השלב של עובר, עשויה להשפיע על ביצועי דקות. באופן כללי, את הצפיפות הגרעינית הגבוהה בתוך העובר, את שגיאות הפילוח הסביר יותר יהיה לקחת Placדואר (2D הדמוי, 3). לפיכך, דיוק פילוח יש להעריך עבור כל דגימה ותקן באופן ידני במידת הצורך. שני סוגים של טעויות מתרחשים בדרך כלל: יתר פילוח ותחת-סגמנטציה.- פתרון על-פילוח:
- לזהות תוצאות חיוביות שגויות - שלפוחית אפופטוטיים (א איור 3 א, ב, ד, כוכביות) או גורמים אחרים שאינם גרעינים שלמים, אך יכולים להיות מזוהים ככאלה על ידי דקות.
הערה: תוצאות חיוביות שגויות באופן כללי כזה יש גודל קטן יותר מאשר גרעינים אמיתיים יכולות, ברוב המכריע של מקרים, להיות מזוהה בקלות מסודרת על הגיליון. עם זאת, בחינה חזותית מומלצת מאוד, כפי שהרבה פעמי גרעינים ניתנים מפולחים באופן חלקי בלבד, וכתוצאה מכך קטן יותר, אבל נפח מפולח תקף (איור 3 א ב, ראש חץ). - מחק את הרשומות המתאימות עבור תוצאות חיוביות שגויים מהקובץ * statistics.csv. לשמור על הסטטיסטיקה * המקורית.csv להגיש לעיון בעתיד ולערוך רק עותק ממנו.
- אם גרעין כבר מעל מפולח ומוצג 2 או יותר גרעינים (איור 3 א ג, חץ וראש חצים), למזג את הרשומות על ידי חישוב ממוצע רמת האינטנסיביות שלהם או, אם דומה, לשמור אחד תקליטים עבור תא זה וזורק לָנוּחַ.
- לזהות תוצאות חיוביות שגויות - שלפוחית אפופטוטיים (א איור 3 א, ב, ד, כוכביות) או גורמים אחרים שאינם גרעינים שלמים, אך יכולים להיות מזוהים ככאלה על ידי דקות.
- פתרון תת פילוח:
- זיהוי אירועים בהם MINS נכשל לזהות את הגבול בין שניים או יותר גרעינים וכתוצאה מכך מפולח בהם גרעין יחיד (איור 3 א ד, חץ 3B). הערה: זה מהווה בעיה עבור ספירת תאי מדויקת, אבל יותר חשובה, לכימות רמות חלבון, כמו רמות הנמדדות יהיה ממוצעת של התאים שמוזגו בטעות, ואשר עשוי להשתייך שושלות שונות.
- זיהוי אירועים בהם MINS נכשל לזהות גרעין לגמרי.
- במקרים אלה (4.4.2.1 ו 4.4.2.2), למדוד את הרמות האפורות הממוצעות fאו כל ערוץ בתא מתחת או בלתי מפולח (הים) באמצעות כלי חלופי, כגון ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), ולהחליף את השיא שגוי עם הרמות נכונות. שמור את קובץ statistics.csv * המקורית לשימוש עתידי ולערוך רק עותק ממנו. כדי לעשות זאת באמצעות ImageJ, בצע את הפעולות הבאות:
- פתח את מחסנית רב ערוצית הרלוונטית על ImageJ ולייבא את קובץ overlaid.tiff * המקביל שנוצרו על ידי MINS כערימה וירטואלית ( 'קובץ'> 'יבוא'> 'מחסנית וירטואלית TIFF ... ").
- מצא קטע המדיאלי של גרעין מתחת או בלתי מפולח.
- שימוש בכלי בחירה ביד החופשי המתאר את ההיקף של הגרעין מתחת או בלתי מפולחת בערוץ כתם DNA.
- לחץ CRL + M (Cmd + M על מקינטוש) או ללכת לתפריט לנתח ובחר "מדוד". פעולה זו תתעד את הערך האפור הממוצע עבור האזור שמסומן ותציג אותו על חלון חדש. עבור אל 'ניתוח'>9; מדידות הגדר ... "ולוודא 'Mean ערך אפור', מסומן. בחרו פרמטרים אחרים כדי להימדד.
- השימוש באותו האזור המוגדר בשלב 4.4.2.3.3, לחזור על המדידה עבור כל אחד מערוצי הקרינה של העניין. התוצאות תצורפנה קודם על החלון 'התוצאות' המדידות.
- השתמש המדידות שהושגו להחליף את הרישומים שגויים בקובץ * statistics.csv. אם הגרעין לא היה מפולח, להכניס שורה חדשה, להקצות לו מספר סלולרי חדש ולהציג את הערכים שהתקבלו ב ImageJ תחת העמודה המתאימה לכל ערוץ. התא זה לא יהיה קואורדינטות מרחביות (X, Y ו- Z ערכים). אם הגרעין היה undersegmented, לשכפל ברציפות שלה, להקצות מזהים תאים שונים לכל תא חדש ולהציג את הערכים שהתקבלו ב ImageJ תחת העמודה המתאימה. במקרה זה, שני תאים יחלקו קואורדינטות מרחביות.
הערה: אם הפריסה המרחבית היא להיות מנותח, אנחנו Recommend למעט XYZ קואורדינטות של תאים אלה, כפי שהם יהיו חופפים. לשם כך, בעת יצירת רשומות חדשות, להקצות מזהים סלולריים להם כי יש להבחין בקלות מן המקוריים (למשל, מספרים לא שלם).
- ציון חלוקת תאים. הערה: MINS מזהה mitotic וכן גרעיני שלבי ביניים, אבל לא יכול להבחין ביניהם.
- אם הגרעינים mitotic נחשבים בנפרד בניתוח, ידני להבקיע אלה ולהוסיף מידע זה לקובץ נתונים. כדי להקליט תאים mitotic, להוסיף משתנה חדש (טור) לקובץ נתונים * statistics.csv ו להקצות ערכים שונים mitotic ו שלבי גרעינים.
- פתרון על-פילוח:
- נתוני עיבוד מראש.
הערה: לאחר הגיליונות האלקטרוניים תוקנו ב- יתר ותחת-פילוח הם מוכנים להיות מנותחים. תהליך הניתוח והצגת נתונים יהיה תלוי בניסוי הספציפי. עם זאת, להלן כמה טרנספורמציות נתונים כללייםאנו ממליצים לבצע לפני ניתוח:- להפוך את ערכי עוצמת הקרינה לתוך לוגריתם שלהם או שורש ריבועי להפחית את מידת הפיזור של הנתונים. זה גם עוזר להדמיה, כמו את הנתונים הגולמיים נוטים להתרכז ליד צירי העלילה (ראה איור 4 ב ', ג').
- תקן את ההנחתה קשורה-Z של קרינה:
הערה: עוצמת הקרינה תמונות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר מקטין את עמוק על Z ציר פרוסה ממוקמת (איור 4E, F).- אם אחד אפיטופים זוהו בדגימות הוא סמן גרעיני ניקיון בכל מקום ועל הומוגנית הביע, לנרמל את עוצמות הקרינה של אפיטופים האחרים על ידי חלוקת ערכיהם בכל תא לפי הערך המקביל של סמן המשק.
- בהעדר אובדן הקרינה כגון סמן התייחסות, לפצות הקשורים-Z באופן הבא:
- מגרש את הערכים של כל סמן (Yציר של הגרף) על פני עמדתו Z (ציר X של הגרף) כדי להמחיש את הירידה באינטנסיביות Z - העלילה יחד את הערכים עבור כל שליטה, עוברים סוג בר (איור 4F).
- התאם מודל ליניארי (עקומת רגרסיה) לעלילה שהושגו בשלב הקודם (עוצמת ערכים מעל Z) עבור כל סמן (איור 4F).
- לתקן את כל הערכים עבור כל סמן באמצעות הנוסחה הבאה:
יומן (הערך המקורי) + Z * שיפוע מודל (איור 4D, G).
הערה: צעדים ספציפיים לבצע תיקון זה יהיה תלוי תוכנת ניתוח בשימוש (R, MATLAB, וכו '). אם באמצעות R, להפעיל את הנוסחה הבאה כדי להתאים מודל ליניארי לנתונים:
> Lm (log (ערוץ) ~ Z, נתונים = dataframe)
שם, הערוץ הוא דורש תיקונים ערוץ הקרינה, Z הוא Z לתאם dataframe היא טבלה המכילה את כל הערכים עבור העובר הרצוי (ים) (על מכת מדינה *istics.csv הקובץ שנוצר על ידי MINS או לשינויו).
הערה: תפוקת הנוסחה דלעיל תהיה במתכונת הבאה:
Z (יירוט)
4.76373 -0.01947
שם, תיאר Z ערך הוא השיפוע של קו הרגרסיה עבור מערך נתונים, אשר ערך מוחלט צריך להשתמש בהם כדי לשנות את הערך המקורי עם הנוסחה הנתונה ב 4.5.2.2.3 (ראה איור 4G עבור דוגמה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להקל על נתונים לפרשנות מצגת, יש להיזהר שלא לפגוע בעוברים במהלך האיסוף והמניפולציה, כך שכל התאי ואת המיקום היחסי שלהם ניתן לנתח איור 2 א -. D מציגה דוגמאות של blastocysts השלם בשלבים שונים עם חלל מורחב. צריך לפגוע להתרחש, טיפול נוסף יש לנקוט בעת ניתוח ופירוש התוצאות.
איכות ואמינות של הנתונים המופקים באמצעות פרוטוקול זה תלוי באיכות של קיבעון על יחס אות לרעש של נוגדנים המשמשים לאיתור החלבונים של עניין. השתמש תמיד מקבעים טרי ולבדוק נוגדנים חדשים, עם בקרות חיוביות ושליליים מתאימות, לפני תחילת קבוצה של ניסויים. איור 2A מציג דוגמאות של נוגדנים טובים במשך מספר חלבונים גרעיניים. איור 2B מראה examplדואר של נוגדן טוב חלבון cytoplasmic (DAB2). איור 2C מציג דוגמה של מכתים רע, עם יחס אות לרעש נמוך, שבו המדגם היה קבוע עבור רק 10 דקות. במקרה זה, הנוגדן המשמש GATA4 (סנט קרוז, SC-1237) דורש O / קיבעון N לספק איתות חזקה (ראה 24 עבור מקרים של עוברים הקבועים O / N ומוכתמים עם נוגדן זה). הגדלת רמת האות במהלך שלאחר העיבוד מגלה תמונה מאוד רועשת. לעומת זאת האנטי-GATA4 המשמש איור 2 א (SC-9053) מספק יחס אות לרעש גבוה לאחר קיבוע של 10 דקות בלבד. פרטים עבור אלה נוגדנים חזקים אחרים ניתנים בסעיף החומרים.
הגורמים המגבילים עבור פילוח MINS טוב הם א) את ההגדלה של המטרה המשמש הדמיה, ב) ההחלטה-Z ו- C) איכות מכתים גרעיני. איור 2 ד מציג דוגמאות של עוברים צילמו עם oiטבילת l מטרת 40X עם NA של 1.30 ו WD 0.21 מ"מ. לוחות תיכונים להראות בהגדלה של ICMS שבו גרעינים בודדים והגבול ביניהם ניתן להבחין. אם אינכם משתמשים מכתים DNA (כלומר., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, וכו ') ערכי הקרינה כימות, הפרמטרים רכישת יכול להיות מותאם באופן אינדיבידואלי כדי לקבל את האות הטוב ביותר. לוחות תחתונים להראות כיצד יותר קדמו את העובר, הצפיפות הגרעינית הגבוהה וכך עולה גם הסיכוי לתקלות פילוח (חץ חץ). איור 3 מציגים דוגמאות של שגיאות MINS יכול להתחייב, כגון איתור גרעינים אפופטוטיים כמו תאי חיים ( כוכביות בפאנלים באיור 3Aa, Ab, מודעות), על-פילוח (חץ וראשי חצים ב 3Ac איור) או תת פילוח (החץ באיור 3Ad). איור 3 ב מציג רצף של פרוסות Z של אירוע תחת-פילוח, שם שני תאים זוהו כאחד. שים לב איך פילוח MINS לוקח ציר ה- Z בחשבון למגזר נפח הכולל את כל פרוסות שבו תא נתון קיים.
לבסוף, את הפרטים של ניתוח הנתונים יהיו תלוי בשאלה הנחקרת, ולכן, קווים מנחים בתהליך הניתוח אינו יכולים להינתן כאן. עם זאת, מצאו לנו טרנספורמציות נתונים ראשוניים מסוימים להיות שימושי איור 4B -.. D מראה מגרשים של ערכי הקרינה עבור סמנים NANOG ו GATA6 ב ICM של העובר שמוצג באיור 4 א איור 4B מראה את ערכי הקרינה גלם המתקבלים MINS (לאחר תיקון ידני של תת ושוב-פילוח). איור 4C מראה את אותם נתונים לאחר טרנספורמציה לוגריתמית, המפריד בין ערכים מהחלקה גרזנים (טרנספורמציה השורש הריבועי הוא גם אפשרי מניב מגרש דומה). לראות בתרשים 4D באותו נתונים לאחר אוטומטי גorrecting הערכים עבור ההנחתה קשורה-Z קרינה, כמוסבר בשלב 4.5.2.2 של פרוטוקול. דוגמאות של ריקבון קרינת Z הקשורים זה ניתן בתמונה באיור 4E ואת מגרשי 4F. איור 4G מראה את ההשפעה של השינוי הנתונים הסביר 4.5.2.2. צבעים מייצגים או epiblast (אדום, NANOG +, GATA6-) או מראש (כחול, NANOG-, GATA6 +) זהה נוספו לעלילה כפונקציה של NANOG וערכי GATA6. בדוגמה זו בפרט, תאים שבהם יחס של יומן [GATA6] / log [NANOG]> 1.25 נחשבו מראש, תאים שבהם יחס של יומן [GATA6] / log [NANOG] <1 נחשבו EPI, ותאים ביניים יחס נחשב לא מחויב (ללא במקרה זה). כל טרנספורמציות הנתונים והמגרשים נעשו rstudio, לעומת זאת, הבחירה של תוכנה היא לא קריטיים תהיה תלוי למשתמש קצה.
מיקום העובר באיור 1., ציר הזמן ואת ניתוח צינור. (א) סכמטי של אחד (של שני) צופר העכבר הרחם ואת שלבי ההתפתחות preimplantation, מיושר עם האזור של הצופר שבו הם צריכים להימצא. (ב) ציר זמן הניסיון עם תזמון עבור כל שלב. שלבים של הפרוטוקול ונקודות הפסקה (הכחול) מסומן. (ג) סיכום של רכישת תמונת צינור ניתוח באמצעות MINS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דוגמאות איור 2. Immunofluorescence וצפיפות גרעינית. (א) דוגמאות של תוצאות immunofluorescence טובות עם נוגדנים נבדקים עבור סחר גרעיניגורמי anscription. Anti-Cdx2 זוהה עם AlexaFluor 488 חמור נוגדנים משני אנטי עכבר, אנטי GATA6 עם החמור AlexaFluor 568-עז, אנטי NANOG עם החמור AlexaFluor 647 אנטי ארנב, אנטי GATA4 (סנטה קרוז, SC-9053 ) עם אנטי עכבר AlexaFluor 488 חמור ארנבת אנטי ואנטי Oct4 עם החמור AlexaFluor 647. כל הנוגדנים הראשוניים מפורטים בטבלת החומרים. מכתים הגרעיני GATA4 cytoplasmic הוא לא ספציפי, ומופיע גם בעוברי Gata4 null (לא מוצג). (ב) דוגמה של immunofluorescence טוב חלבון cytoplasmic, DAB2. זה זוהה באמצעות חמור AlexaFluor 488-עכבר אנטי. (ג) דוגמא של immunofluorescence הרע, עם יחס אות לרעש נמוך גורם גרעיני. GATA4 זוהה עם-GATA4 אנטי וגדל עיזים (סנטה קרוז, SC-1237; ואילו SC-9053 (ארנב נגד GATA4) שימש ב (א)) וכן חמור AlexaFluor 568-עז נגד. (
איור 3. דוגמאות של שגיאות דקות. (א) רצף של Z- קטעים הבודד מעובר אחד הצגת דוגמאות של טעויות פילוח דקות. תאים אפופטוטיים שמזוהים זאת כמו גרעינים מסומנים בכוכבית (*) של לוחות A, B ו- D. בסי הפאנל, ID # 39 (חץ), אם כי קטן מאוד, אין לזהות את גרעין המקביל ולכן יכול להיות שמאל ללא תיקון. ב- C פאנל, ID # 66 (חץ) משתרע על פני שני n שוניםuclei, אשר בתורו זוהה בנפרד (ראשי החץ, המזהים # 65 # 54 # ו -53). ברת לוח, שני תאים (ID # 63) זוהו בתור אחד יחיד (ראו חץ המסמן את הגבול הדק) ולהקליט זה ולכן צריך להיות מועתק למטרות ספירת תאים. (ב) MINS מזהה תאים לאורך ציר-Z. התמונות מראות רצף של Z-פרוסות של שני תאים כי כבר הבקיע בטעות כסינגל אחד (# 123). שים לב איך האזור הכחול התוחם את הגרעינים הוא רציף לאורך Z. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דוגמה באיור 4. פילוח נתונים טרנספורמציות. (א) תמונות של תאים ICM של הבלסטוציסט מוכתם עבור NANOG ו GATA6 ואת תמונת מצב של פילוח הגרעין של אותוהעובר באמצעות MINS בערוץ מכתים גרעיני (Hoechst 33342). (BD) NANOG קרינת GATA6 ערכים בתאי ICM נמדדים MINS זממו כמו נתונים גולמיים (B), לאחר ביצוע שינוי לוגריתמים (C) לאחר תיקון הערכים עבור ריקבון הקרינה לאורך ציר Z והקצאת זהויות תא אוטומטי מבוססות על התיקן ערכים (D). (E - G) דוגמאות של תיקון נתונים עבור ריקבון הקרינה לאורך ציר Z. (ה) תמונות של הבלסטוציסט שכותרתו עם Hoechst ואנטי Cdx2 + AlexaFluor 488 (AF488), מראה ירידה הקרינה לאורך ציר Z. (F) מגרש פיזור של ערכי קרינה לאורך ציר Z עבור Hoechst ו AF488 עבור מאגר של העוברי כולל זה מוצג (E). הקו האפור מייצג את עקומת רגרסיה עבור כל קבוצה של ערכים. (G) אותם נתונים כמו F לאחר פיצוי ריקבון קרינה עבור כל תאבאמצעות גורם הבא: ת לתאם * שיפוע מודל ליניארי (ראה שלב 4.5.2.2 בפרוטוקול). לוחות E - G פורסמה במקור על ידי מחברי מאמרים באותו צומת (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) כל נקודה מייצגת תא אחד. סולם = 20 מיקרו-מטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| קלט משתמש |
| * סף בהירות (מקלת זיהוי גרעיני תמונות עמומות) |
| X יחסית / רזולוציה YZ |
| ערוץ לפלח |
| קוטר גרעיני |
| רמת רעש תמונה |
| פלט MINS |
| פילוח Z- מחסנית עם nuclמזהי ei |
| נפח גרעיני |
| XYZ מרכזת לכל גרעין |
| ממוצע והסיכום של ערכי קרינה לכל ערוץ קרינה ואת גרעין |
| יתרונות |
| פילוח מדויק (> 85%) של גרעינים ברחבי המחסנית - מכיר את כל מופעים של גרעין ב z-חלקים סמוכים |
| ברזולוצית תא יחידה |
| פילוח השגחה של אצוות של עוברים |
| צינורות פילוח יכולים להינצל מחדש בשימוש או מתואם לכל עובר בפרט |
לוח 1. תכונות MINS
| תמונה טען | הבשורה, להציג את הרזולוציה היחסית Z עבורתמונה. זה יכול להיות מתקבל מטה הקובץ באמצעות קורא המחדל או החלת הנוסחא הבאה: X (או Y) רזולוציה / רזולוצית Z (והכל מיקרומטר). |
| הזן את מספר הרצף (1 - 5) עבור הערוץ להיות מפולח. באמצעות ערוץ כתם DNA עבור פילוח יאתר את כל התאים את התמונה, עם זאת, ערוצי אחרים עשויים להיות מפולח בנפרד מדי. | |
| הזן את המסגרת להתחיל פילוח ב (1 כברירת מחדל). חל רק על קבצים עם מסגרות זמן מרובים. | |
| שפר תמונה (אופציונלי) | הנקודה הלבנה והשחורה של תמונה יכולה להיות מותאמת על מנת לקדם זיהוי. באופן כללי הורדת נקודה מחדש דרוגה הלבנות - 0. 255 (עבור 8 סיבי תמונות) או 0 - 4096 (12-bit תמונות) יהפוך את התמונה הבהירה יותר ולהקל זיהוי של גרעינים עמומים. |
| זיהוי גרעינים | בחר את קוטר הגרעין מוערך (בדרך כלל בין 30 ל -40 פיקסלים ב blastocysts). |
| לקבלת תמונות רועשות רמת הרעש יכולה להיות מותאמת. אחרת, הערך ברירת המחדל תחול. | |
| גרעיני מגזר | שימוש בפרמטרים מחדל. |
| גרעינים לסווג | MINS יכול להבחין trophectoderm (TE) מ מסת התאים הפנימית (ICM) התאים עוברים preimplantation על בסיס מיקום. זה יכול להיעשות גם באופן ידני או על בסיס רמות קרינה אם סמן TE משמש. |
| תוצאות יצוא | בחר את הקבצים להיווצר: |
| - פילוח מעולף על גבי ערוץ בשימוש (.tiff קובץ רצף), | |
| - רק פילוח (קובץ רצף .tiff), | |
| - גיליון אלקטרוני עם מזהים עבור כל תאים המזוהים, קואורדינטות XYZ ורמות קרינה (ממוצע וסכום) עבור כל ערוצים לכל תא (csv קובץ). | |
| כל הקבצים מיוצאים כברירת מחדל. הקבצים נשמרים בשנות הבספריית ame שם תמונות ממוקמות. |
צינור פילוח טבלה 2. MINS
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבצע ניתוח כמותי של immunofluorescence כל הר על עוברי עכברים בשלב preimplantation. פרוטוקול immunofluorescence חזק 22 ואחריו ברזולוציה גבוהה, כל הר הדמית confocal ועל ידי פילוח תמונה באמצעות פיסת מחויטת של תוכנת 4. בעוד הבחירה של פרוטוקול immunofluorescence אינה קריטית, אנו מוצאים את אחד המוצג כאן 22 להיות מהיר, אמין ולספק אות יציבה עבור רבים של הנוגדנים בדקנו. פרוטוקולים אחרים עשויים להיות מלווה, ובלבד בקשתם עקבית לאורך ניסויים מקבילים. בעוד גורמים רבים משפיע על התוצאה של כל ניסוי פרט, השוואה הישירה בין הניסויים לא בהכרח ניתן, מצאנו כי חתירה עקבית חזרות וביצוע משכפל טכני מספק מקטינה באופן משמעותי השתנות. לכן, אופטימיזציה פעם, קיבעון immunolabelinריאגנטים ופרוטוקולים גרמו, וכן תנאי הדמיה חייבים להישמר קבועים בין ניסויים מקבילים.
הבעיות העיקריות שעלולות להתעורר במהלך היישום של נפילת בפרוטוקול זה לשתי קבוצות: 1) מכתים באיכות ירודה, עם אות עמום, ו -2) פילוח הכי מוצלח, עם שגיאות רבות (כלומר, יתר ותחת-פילוח). immunofluorescence איכות נמוכה הוא בדרך כלל בשל קיבעון תקין של דגימות או את הנוגדנים לא להיות מתאים immunofluorescence כל הר. ודא PFA הוא טרי (או מוכן טרי או מופשר RT מ -20 ºC לא יותר משבוע לפני). בהתחשב בגודל הקטן של עבר preimplantation, קיבעון של 10 דק 'ב PFA צריך להספיק. עם זאת, מצא נוגדנים מסוימים להניב חזק איתות עם פעמי קיבעון יותר (ראה חומרים). אם נוגדן כי נבדק בעבר מספק אות חלשה, נסה פרוטוקולי קיבעון שונים. לא כל הנוגדנים לבצע וחסונה על כל הר IMMunofluorescence והבחירה של נוגדן ראשוני היא קריטית עבור התוצאה של הניסוי. נוגדנים חדשים צריכים להיבדק בעוברים ועל הריכוז האופטימלי לקבוע באופן אמפירי. בתרשים חומרים שאנו מספקים פרטים של נוגדנים מספר בדקנו ולהשתמש באופן שגרתי. עיין בספרות שפורסמה או של המידע היצרני כאשר בוחנים נוגדנים חדשים. שים לב שלא כל הנוגדנים מתאימים לעבודת הכתם מערבית כל הר immunofluorescence, ועל הריכוז ההכרחי immunofluorescence עשוי להיות עד אחד בסדר גודל גבוה. נוגדנים משני מסחרי בדרך כלל עובדים טוב מהקופסה, עם זאת, להיות עקבי בשימוש של שילובי נוגדן ראשוניים על-תיכוני ברחבי ניסויים שווים כי הם הולכים להשוות.
איכות פילוח תמונה תלויה היא על איכות המכתים הגרעיני על הצפיפות הגרעינית ICM של עובר. תמיד לשאוף בהיר,גרעינים ברורים ולהשתמש מטרה ברזולוציה גבוהה (40X או יותר). אם האות הגרעיני הכתם נמוך, השתמש aliquot טרי או קבוצה חדשה. כל עוד הכתם הגרעיני אינו משמש כימות, פרמטרי הרכישה יכולים להיות מותאם עבור כל עובר על מנת לרשום גרעינים חדים, בהירה. כמו כן, אם ערוץ אחר מאשר המכתים הגרעיני משמש פילוח, את יחס אות לרעש של שערוץ מסוים יקבע את איכות הפילוח. blastocysts בשלב מאוחר (E4.0 ואילך) מציג צפיפות גרעינית גבוהה מאוד בתוך ICM. לכן, בשלבים האלה כי מכתים באיכות גבוהה הוא קריטי ביותר. אף על פי כן, שגיאות פילוח תתקיימנה לרוב בשלבים אלה. הצג את קוטר הגרעין המוערך ורמת רעש בתמונה על צינור הדקות, לחקור את התוצאה של כל שלב באמצעות הלחצן 'התצוגה' ולהתאים את הפרמטרים עד מתקבלת תוצאת משביעת רצון. השתמש בפרמטרים המייצרים את הפילוח הטוב ביותרלתקן טעויות באופן ידני במהלך עיבוד הנתונים. שים לב העוברי בשלב מאוחר (E4.5 ~) בספירה גבוהה תיקון נתונים ידני יהיה זמן רב.
המגבלות של פרוטוקול זה נקבע על ידי מערכת מיקרוסקופ confocal המשמש לרכישת תמונה. כפי שנאמר, להשתמש מטרה גבוהה ההגדלה, עם מרחק עבודה המאפשר הדמיה ציר Z של העובר כולו (עוברי עכברים preimplantation יכול להגיע עד 150 - 160 מיקרומטר קוטר). באופן דומה, מספר אפיטופים כי ניתן לאתר ייקבע במספר ערוצי המיקרוסקופ יכול לרכוש בבת אחת. השימוש בפרוטוקול זה, שלושה אפיטופים שונים מלבד DNA (4 ערוצים בסך הכל) יכולים להיות מתויגים בו זמנית על כל דגימה. ודא שהמכשיר מכויל עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, gating הוא מותאם וכי פלט לייזר עולה בקנה אחד.
השיטות שתוארו כאן לאפשר ניתוח בעמדת התא לאורךXYZ גרזנים כמו גם כימות של רמות ביטוי החלבון באתר לכל תא ותא blastocysts עכבר. מניסיוננו, שיטות חלופיות באמצעות כל תוכנה אחרת זמין לא יכולות לספק את רמת רזולוציה כי צינור מיושם פרוטוקול זה יכול (ראה 4 עבור השוואה ישירה עם כלים אחרים). הצפיפות הגרעינית הגבוהה נמצאת ICM של הבלסטוציסט גורמת כלים אחרים כדי ליצור כל כך הרבה טעויות, כי היקף תיקון ידני נדרש עושה שימוש שלהם מעשיות. לחלופין, מדידות קרינת ספירת תא ידניות שמשו בעבר עבור תת קבוצות של תאים או באזורים המוגדרים של עובר 10,11,18,19,24. עם זאת, ספירה ידנית ומדידה של כל ערוצי פלואורסצנטי בעמדת התא, בכל צירי XYZ, המתן מענה לעשרות תאים הנמצא כל עובר תהיה כל כך זמן רב כי היא לא אאפשר לניתוח התפוקה הגבוהה עבורו הפרוטוקול שלנו תוכנן . יתר על כן, מדריךssessment של רמות הקרינה נוטה משוא פנים, תוך צינור כגון זה המתואר כאן מאפשר מדידה אובייקטיבית של עוצמות קרינה לקביעה הבאה של זהות תא. כדי להקצות זהויות תא, החוקר צריך להקים קריטריון רגיל להיות מיושם על כל דוגמאות של ניסוי בפרט להגדיר. בהינתן הגורמים השונים - ביולוגיים וטכניים - שיכולים להשפיע על התוצאה של immunolabeling, קריטריון זה צריך להיקבע באמצעות ניסויים בקרה נאותים ונתונים שפורסמו בעבר בכל מקום אפשרי. אנחנו מדמיינים בעתיד הקרוב שבו אלגוריתם יכול להיות מיועד נחישות אוטומטית של זהות תא ללא קשר הניסוי. עם זאת, כגון כלי יהיה רק באים יישום נרחב יותר ושיפור של השיטה הנוכחית, ככל הנראה יחד עם אלגוריתמים של למידה חישובית.
לבסוף, לנוכח הפשטות של צינור זה ואת morphol הסטריאוטיפיתogy של עוברים preimplantation העכבר, פרוטוקול זה ניתן להרחבה בקלות לניתוח כמויות גדולות של עוברים, ובכך מאפשר תפוקה גבוהה מנתח של פנוטיפים null 5,6 או כל 7 מניפולציה ניסויית אחרים. לבסוף, בעוד הפרוטוקול הנוכחי תוכנן והותאם במיוחד עבור ניתוח של עוברי עכברים preimplantation ומושבות ESC, אנחנו לא רואים סיבה אפריורי למה זה לא יכול להיות מיושם על מערכות אחרות בעלות מאפיינים דומים - כלומר צפיפות גרעיני גבוהה. אנו מעודדים אחרים להתנסות להתאים את הפרוטוקול לתרחישים אחרים ולספק משוב לשיפור עתידו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
