Summary
Denne protokollen presenterer en metode for å utføre kvantitativ, enkelt-celle in situ analyse av protein ekspresjon for å studere avstamning spesifikasjon i mus preimplantation embryoer. De prosedyrer som er nødvendige for innsamling av blastocyster, hel-mount immunofluorescent påvisning av proteiner, avbildning av prøvene på en konfokalmikroskop, og kjernefysisk segmentering og bildeanalyse er beskrevet.
Abstract
Denne protokollen presenterer en metode for å utføre kvantitativ, enkelt-celle in situ analyser av protein uttrykk for å studere avstamning spesifikasjon i mus preimplantation embryoer. De prosedyrer som er nødvendige for embryo samling, immunfluorescens, bildebehandling på en konfokalmikroskop og bilde segmentering og analyse er beskrevet. Denne metoden tillater kvantifisering av ekspresjon av multiple markører atom og den romlige (XYZ) koordinerer av alle celler i embryo. Det tar nytte av MINUTTER, et bilde segmentering verktøy spesielt utviklet for analyse av confocal bilder av preimplantation embryoer og embryonale stamcelle (ESC) kolonier. MINUTTER utfører uten tilsyn atom segmentering på tvers av X, Y og Z dimensjoner, og gir informasjon om posisjon celle i tre-dimensjonale rommet, så vel som kjernefysiske fluorescens-nivåer for alle kanaler med minimal brukerundersøkelser. Mens denne protokollen er optimalisert for analyse av bilderav preimplantation stadium mus embryo, kan det lett tilpasses til analyse av eventuelle andre prøver som oppviser en god signal-til-støy-forhold og hvor høy atom tetthet utgjør et hinder for å bilde segmentering (f.eks., ekspresjon analyse av embryonale stamceller (ESC ) kolonier, differensierende celler i kultur, embryoer av andre arter eller stadier, etc.).
Introduction
Musen preimplantation embryo er et paradigme for å studere veksten og vedlikehold av pluripotency in vivo, så vel som en modell for studiet av cellen skjebne beskrivelsen og de novo epithelialization i pattedyr. Preimplantasjonsperioden stadier av pattedyr utvikling er dedikert til etablering av de tre celle linjene som utgjør blastocyst, nemlig pluripotent epiblast - som gir opphav til de fleste somatiske vev og kjønnsceller - og to extraembryonic slektsnavn, det trophectoderm (TE) og primitive endoderm (pre) (figur 1A) 1,2. Denne protokollen beskriver prosedyrer til (1) høsting og fikse preimplantation scenen museembryoer, (2) utføre immunfluorescens å merke proteiner av interesse, (3) gjennomføre hel-mount bildebehandling ved hjelp av en konfokalmikroskop med z-seksjonering evner og (4) utføre atom segmentering av confocal bilder og påfølgende kvantitativ bildeanalyse. Denne rørledningen kan than objektive målinger av proteinnivåer for tildeling av celle identiteter for å karakterisere subpopulasjoner av celler in situ. Denne protokollen kan utføres på så lite som 3 - 4 dager for en enkelt kull (vanligvis opp til 10 mus embryo), fra embryo samling til dataanalyse (figur 1B). Den samtidige analyse av flere kull ville øke avbildnings og dataanalyse tid belastning, og dermed forlenge den totale lengde av protokollen.
Preimplantasjonsperioden scenen museembryo er et eksperimentelt medgjørlig system som, gitt sin lille størrelse og stereotype morfologi 3, er godt egnet for i toto avbildning av cellulære prosesser med encellede oppløsning. For å gjennomføre en objektiv, systemer-nivå analyse av et statistisk relevant antall embryoer, er en automatisk, kvantitativ analyse rørledning ønskelig. Men på grunn av den høye atomtettheten av den indre cellemasse (ICM) av blastocysten (
Analysen rørledning presenteres her dreier seg om MATLAB-baserte bildesegmentering verktøy Modular Interactive Nuclear Segmentering (min) 4. MINUTTER performs unsupervised atom segmentering på store grupper av confocal Z-stabler etter at brukeren har etablert et minimalt antall bildeegenskapene, ved hjelp av et grafisk brukergrensesnitt (GUI) (tabell 1) 4. Denne rørledning har vist seg effektiv for generering av data med høy gjennomstrømning på protein ekspresjon og celle lokalisering i både villtype, eksperimentelt behandlede og genetisk modifisert embryoer og ESCs 5-7. I den foreliggende protokollen beskriver vi bruk av minutter til segmentering av preimplantation-trinns embryo bilder. For eksempler på MINUTTER ytelse på ESCs henvises det til 4,7. Den automatiserte atom segmentering trinn reduserer tiden byrden av celleidentifikasjonsprosessen, mens de romlige og fluorescens intensitetsmålinger gi en objektiv bestemmelse av celle identiteter og generering av tre-dimensjonale kart av genekspresjon domener og celleposisjon i embryoet (figur 1C 5,6. MINUTTER er fritt tilgjengelig på http://katlab-tools.org (programvaren krever en MATLAB lisens).
Ingen tilnærming utviklet til dags dato tillater generering av slike data i dybden på protein uttrykk og celle lokalisering i mus preimplantation embryoer. Alle forsøk hittil på å kvantifisere denne type data er begrenset til den manuelle besluttsomhet og kvantifisering av celle tall for ulike populasjoner i embryoet (enten helt manuelt, eller software-assistert) 9-19. Denne tilnærmingen (som omfatter MINUTTER programvare) har blitt skreddersydd for og testet på mus preimplantation befruktede egg og ESCs; likevel sin ytelse på andre systemer med høy kjernetetthet, men ennå ikke testet, er ventet å være tilsvarende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Alle dyr arbeid, herunder reindrift, avl og offer ble godkjent av Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC), protokoll # 03-12-017.
1. Embryo Collection
Merk: Alle dyr arbeid må være godkjent av institusjonelle og lokale myndigheter og i samsvar med lokale og institusjonelle regler.
- Mate en jomfru hunnmus med en fruktbar stud mannlige av ønskede genotyper.
Merk: Hvis du setter opp naturlige parringer, velger kvinner i estrus fase av estral syklusen øker sjansene for parringen på ønsket dato. Hvis induserende superovulation henvises til protokollen beskrevet i 20. - Sjekke nærværet av en vaginal plugg om morgenen ved hjelp av en stump sonde. Ideelt sett gjør dette før middag (12:00), som copulation plugger er tapt i løpet av dagen. Tenk noon for påvisning av vaginal plugg embryoniske dag (E) 0,5.
- Av den ønskede dag og tid for embryoutvikling, oppvarming eller M2 spyleholde medium (FHM) til romtemperatur eller fortrinnsvis 37 ° C. Merk: Enten M2 eller FHM kan brukes til spyling og håndtering embryoer. Når den ikke er i bruk, oppbevar disse mediene ved 4 ºC. Estimer bruk på ~ 2 ml medium for hver livmor.
- Tine frossen 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS) eller forberede noen ny løsning. Estimer 500 pl av 4% PFA oppløsning per brønn av et 4-brønns plate. Fix ett kull på hver brønn av en 4-brønns plate. Merk: Alternativt kan en 96-brønns plate brukes til å fikse og lagre embryoer. Hvis du bruker en 96-brønns plate, bruker 100 ul PFA løsning per brønn.
- Trekk et glass Pasteur pipette ved hjelp av en åpen flamme for å tegne en kapillær slutt på spissen.
- Sacrifice kvinnelig ved halshugging eller CO 2 innånding, eller som kreves av lokale og institusjonelle bestemmelser. Det er ofte ønskeligee å bekrefte eutanasi av dyret ved halshugging.
- Spray magen på dyret med 70% etanol for å minimalisere avgivelse håret og utføre en abdominal snitt, først gjennom huden og deretter gjennom legemet vegg (bukhule) for å eksponere innvollene.
Merk: Følgende trinn beskriver prosedyren for å samle blastocyster fra livmoren til en gravid kvinne musen på ethvert stadium mellom E3.25 og E4.5 (figur 1A). For protokoller på innsamling av preimplantation embryoer tidligere enn E3.25, se 20. - Finn livmoren og fjerne fra dyret. Å holde den cervikale enden av livmoren med en pinsett, skjære gjennom livmorhalsen og trekke opp forsiktig til å strekke begge uterine horn.
- Trim fett fra livmoren, tar seg ikke å pierce livmorveggen. Dette kan gjøres enkelt ved tidspunktet for fjerning, mens de fortsatt er festet til kroppen til dyret, som livmoren kan strekkes ut. Alternativt, detkan utføres senere, under et mikroskop disseksjon, i RT PBS. For en mer detaljert protokoll om disseksjon av livmor, se Protokoller 5 & 8 20
- Skjær ovenfor oviduktene, under eggstokkene, for å frigjøre hele livmoren, sted på en petriskål og dekk med PBS.
Merk: Dette trinnet kan også vasking av overflødig blod eller annet rusk fra livmoren, noe som letter påfølgende blastocyst høsting. - Separate begge uterine horn ved å kutte gjennom den proksimale enden, på begge sider av livmorhalsen og kast livmorhalsen. Skill oviduct fra livmoren ved å kutte under eidet som forbinder dem (figur 1A). Overfør begge hornene til en dråpe manipulasjon medium (enten M2 eller FHM) for embryo innsamling og manipulasjon.
- Under en disseksjon mikroskop, skyll blastocysts ut av livmoren og inn i mediet ved å tvinge 0,5 - 1 ml M2 eller FHM gjennom hvert livmorhorn fra livmorhalsåpningen. Bruk en 1ml sprøyte med en hypodermal nål. Merk: Nålen kan avstumpet ved hjelp av en filing stein for å unngå at det rives uteri, selv om dette ikke er kritisk. En detaljert diagram for livmor spyling kan bli funnet i 21.
- Ved hjelp av disseksjon mikroskop, lokalisere blastocyster, som vil bli spredt utover dråpe medium. Det kan ta inntil 1-2 min for blastocysts å synke til bunnen av fatet etter tømming. Ved hjelp av munn-kontrollert, glass Pasteur pipette med en kapillær slutt, samle alle blastocyster og overføre til en ny dråpe medier.
- Skyll blastocysts ved å flytte dem gjennom 2 - 3 dråper frisk M2 eller FHM. Bevege embryoer i grupper på 5 - 10 blastocyster på en gang.
Merk: Flytting større grupper til enhver tid vil fremskynde prosessen, men det vil også øke sjansene for uhell miste mange embryoer. Hvis utrente i bruk av appetittstyrte pipetter, praktisere embryo manipulasjon og overføring bør vurderes før beginning forsøket. - Fjern Zona pellucida (ZP) fra unhatched blastocyster (vanligvis <E4.0) ved kort å vaske dem i sur Tyrode løsning. Så snart ZP er ikke lenger synlig, overføre blastocysts tilbake til manipulasjon media. Bare holde embryoer i syre Tyrodes så lenge som strengt tatt er nødvendig, for å unngå skade på cellene.
- Vær forsiktig når du håndterer blottet blastocyster, som de holder seg veldig lett til glass og plastflater. Manipulering medium inneholder 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) for å hindre festing, men syre Tyrodes eller PBS ikke gjør det, og derfor å redusere faren for skade på eller tap av embryoene ikke plukke opp mer enn 2 - 5 utarmede blastocyster på et tidspunkt da manipulere dem i BSA-fri eller serum-fri PBS eller syre Tyrodes.
Merk: Alternativt kan belegge glass pipette med 1% BSA før bruk for å redusere klebing av embryoene med glassoverflaten.
- Vær forsiktig når du håndterer blottet blastocyster, som de holder seg veldig lett til glass og plastflater. Manipulering medium inneholder 4 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) for å hindre festing, men syre Tyrodes eller PBS ikke gjør det, og derfor å redusere faren for skade på eller tap av embryoene ikke plukke opp mer enn 2 - 5 utarmede blastocyster på et tidspunkt da manipulere dem i BSA-fri eller serum-fri PBS eller syre Tyrodes.
- Coat bunnen av hver brønnav et 4-brønns vevskulturskål med et tynt lag med 1% agar, 0,9% NaCl for å hindre at embryoer fra å feste seg til plasten. Alternativt kan legge til 4 mg / ml BSA i PBS (PBS-BSA).
- Fylle en brønn av den belagte 4-brønn vevskulturskål med 500 ul av PBS RT (eller PBS-BSA) og en annen brønn med 500 ul 4% PFA i PBS.
- Skyll blastocyster i RT PBS og feste i 4% PFA i PBS i 10 min ved RT. Overføring til PBS (eller PBS-BSA) etter fiksering.
- Hvis embryo ikke kommer til å bli behandlet umiddelbart, dekke PBS som inneholder embryoene med et lag av mineralolje for å hindre fordampning (som fører til uttørking av prøven) og lagre platen ved 4 ºC.
Merknad: Forskjellige festemetoder og tider kan anvendes, avhengig av forsøket, epitopene av interesse og de antistoffer som skal anvendes. Uansett hvilken metode for valg, være konsekvent gjennom tilsvarende forsøk for å lette etterfølgende sammenligning av fargingsresultater.
Merk: PausePunkt: Embryoet kan lagres ved 4 ºC i PBS i opptil flere uker før du går videre til neste trinn. Sørg PBS er sterile og / eller legge til 100 U / ml Penicillin + 100 pg / ml streptomycin (Pen-Strep) for å forebygge bakteriell forurensning (særlig ved bruk av PBS-BSA) hvis forutse langvarig lagring.
2. immunfluorescens
- Utfør immunfluorescens bruker noen protokoll som tidligere har blitt testet og vist seg å være robust for hel-mount immunfluorescens. Merk: Vi anbefaler de som er beskrevet i 22 og 11. I den foreliggende artikkelen førstnevnte vil bli beskrevet. Uansett hvilken metode for valg, være konsekvent gjennom tilsvarende eksperimenter for å lette sammenligningen av flekker resultater.
- Bruke en fleksibel, polyvinylalkohol, klar, U-bunn 96-brønners plate for å utføre de sekvensielle trinnene av immunfluorescens-protokollen. Fyll hver brønn med 50 - 100 ul oppløsning og flytte embryoer fra en løsningtil en annen ved hjelp av en L-formet munn pipette. Merk Denne tilnærmingen reduserer bruken av reagenser og muliggjør sporing trinn samt den parallelle farging av flere eksperimentelle grupper.
- Valgfritt: Coat bunnen av brønnene med et tynt lag med 1% agar, 0,9% NaCl for å forhindre adhesjon av befruktede egg til plasten. Ikke legg BSA til immunfluorescens løsninger.
- Forbered PBX (0,1% Triton X-100 i PBS). Hvis påvente av resultatene av flere immunofluorescence eksperimenter, forberede 50 ml PBX og oppbevares ved 4 ºC mellom eksperimenter.
- Fremstille permeabiliseringen oppløsning (0,5% Triton X-100, 100 mM glycin i PBS). Lag 1 ml (eller hvilken mengde nødvendig) friskt permeabilization løsning for hvert forsøk.
- Fremstille blokkeringsløsning (2% hesteserum (HS) eller 20% føtalt bovint serum (FBS) med Pen-Strep i PBS). Forbered 10 ml og oppbevares ved 4 ºC mellom eksperimenter.
- Ingen forskjeller ble observert mellom ententypen av serum er imidlertid være konsekvent ved valg av blokkeringsløsning anvendt for tilsvarende eksperimenter.
- Skyll faste embryoer i 5 min ved RT i PBX (~ 100 ul).
- Permeabilize embryoer i 5 min ved RT i permeabiliseringen-løsning (~ 100 ul).
- Skyll embryoer i 5 min ved RT i PBX (~ 100 ul).
- Blokk-embryoer i 30 minutter til 1 time ved romtemperatur i ~ 100 ul blokkeringsløsning. Dekk av løsningen med et lag av mineralolje for å hindre fordampning eller holde et fuktet kammer.
Merk: Embryoet kan blokkeres i opptil O / N perioder på 4 ºC uten merkbar forbedring eller skade sammenlignet med 30 min blokkerer trinn. - Inkuber embryoer O / N ved 4 ºC i primær antistoff / antistoffer fortynnet i blokkering løsning (~ 100 mL). Dekk av løsningen med et lag av mineralolje for å hindre fordampning eller holde et fuktet kammer.
- Bestem optimal fortynning for hver primær antistoff forhånd. se discussion og materialer seksjon for testede fortynninger av en rekke antistoffer.
- Etter O / N inkubasjon, skyll embryoer 3x i 5 min hver ved RT i PBX (~ 100 mL).
- Blokk-embryoer i 30 minutter til 1 time ved romtemperatur i ~ 100 ul blokkeringsløsning. Dekk av løsningen med et lag av mineralolje for å hindre fordampning eller holde et fuktet kammer.
- Inkuber embryoer for 1-2 timer ved 4 ºC i sekundær antistoff / antistoffer utvannet ved 4 ug / ml i ~ 100 mL av blokkering løsning. Dekk av løsningen med et lag av mineralolje for å hindre fordampning eller holde et fuktet kammer.
- Skyll embryo 2x i 5 min hver ved RT i PBX.
- Flytt embryoene til foretrukne DNA flekken. Hvis du bruker Hoechst 33342, fortynne til 5 ug / ml i PBS. Dekk av løsningen med et lag av mineralolje for å hindre fordampning eller holde et fuktet kammer.
Merk: Pause Punkt: Hvis embryoer ikke blir avbildes umiddelbart, kan de oppbevares i up til flere uker i nukleær farging løsning. I dette tilfelle sikre PBS er steril og / eller legge til Pen-Strep eller natriumazid for å hindre bakterievekst og forurensning.
3. Confocal Imaging
Merk: Individuelle konfokalmikroskop konfigurasjoner vil kreve konkrete oppkjøps parametere som skal justeres for systemet og programvaren på plass. Imidlertid gir følgende avsnitt et sett med generelle regler å følge som bør være aktuelt for en gitt installasjon.
- Ved hjelp av en fin munn pipette, gjør microdrops PBS eller kjernefysiske flekken løsning på glassoverflaten av en 35mm glassbunn fatet og dekk med mineralolje. Som et alternativ, kan du bruke en vanlig dekkglass med silikon separatorer for å unngå å skade fostre og dekk med et glass objektglass. Merk: Når du bruker en vanlig dekkglass, embryoer kan ikke senere gjen posisjonert eller gjenvinnes for genotyping, derfor anbefaler vi på det sterkeste bruk av glass-bunnretter.
- Plasser embryoer i microdrops og arrangere på en ensartet måte, fortrinnsvis med ICM-hulrom akse parallelt med glassoverflaten. Sett opp rett på mikroskopet holderen. Merk: Bildene som oppnås på laserskanning confocal mikroskoper lider av en Z-aksen assosiert tap av fluorescens intensitet. Derfor er konsistens i ordningen viktig for å sammenligne intensiteter mellom tilsvarende regioner på ulike embryoer.
- Sett opp referanse parametere ved hjelp av vill type embryoer som ikke har vært utsatt for noen form for behandling som kan endre genuttrykk.
- Hente bilder ved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (dvs. 40X eller høyere) for å få data som vil forenkle nøyaktig segmentering bruker MINUTTER verktøy fire.
Merk: Bruk av digital zoom på en 20X objektiv vil ikke gi bilder av tilstrekkelig oppløsning for segmentering bruker min. Man bør også merke seg arbeidsavstanden (WD) av objektiv, som det skal væretilstrekkelig til å tillate oppkjøpet av en Z-stack som spenner over en hel blastocyst, og dermed en lang WD (~ 130-150 nm) Målet er vanligvis nødvendig. Bildene som vises i figur 2 - 4 ble anskaffet ved hjelp av en 40X / NA 1,30 oljeneddyppingsobjektivet med en arbeidsavstand på 210 mikrometer. - Bruk laveste laser utgang som gir et sterkt signal-til-støy-forholdet uten bleking av fluoroforer.
- Juster gain og offset å få et bredest dynamiske området uten å overeksponere prøven. Utsette bildene for å dekke det meste av, eller dekker hele, grå skala område vil lette påvisning av små forskjeller i intensitet mellom bilder.
- Bruke en liten (ca. 1 pm) Z-trinnet, siden Z-aksen oppløsning er kritisk for nøyaktig segmentering med minutter.
Merk: XY dimensjoner påvirker ikke atom segmentering prosessen, kun størrelsen på bildefilen. Vanligvis 512 x 512 piksler er en tilstrekkelig XY oppløsning for publisering kvalitet bilder uten compromisynge plass på harddisken. - Kritisk trinn: Hold bildebehandling parametere konsistente innenfor og på tvers av bilde økter av det samme eksperimentet slik som å kunne sammenligne prøvene.
- Hente bilder ved hjelp av en høy forstørrelse objektiv (dvs. 40X eller høyere) for å få data som vil forenkle nøyaktig segmentering bruker MINUTTER verktøy fire.
- Imaging grupper av embryoer:
- Bilde sammenhengende grupper (kull, eksperimenter) i en enkelt økt når det er mulig.
- Hold parametre konsistente innenfor og på tvers av bilde økter for gjentak av samme eksperiment.
- Bilde embryoer hele (hele Z-aksen) for å fange opp hver celle.
Merk: Hvis ønskelig, embryo kan genotyping gjøres etter avbildning, som beskrevet i 23. Behovet for nestet PCR må bestemmes empirisk, og vil avhenge av locusen som skal analyseres, og primerne anvendt.
- Sørg for å være i stand til å matche embryoer til bilder i ettertid.
4. bildeanalyse og data Pre-behandling
- Last ned og installer MINUTTER 4 fra http: // Katlab-tools.org (MATLAB lisens).
- Utfør bildesegmentering:
- Følg grafisk brukergrensesnitt (GUI) av minutter å laste en confocal bilde eller stable fra harddisken, oppdage kjernen og segment bildet. Legg den hele Z-stack av rådata generert av mikroskop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Se tabell 2 for mer informasjon om hvert trinn og instruksjoner finnes på http://katlab-tools.org og 4. Etter fullført, se utfallet av hvert trinn ved å klikke på 'Vis' knappen. En gul tag over knappen lyser når maskinen er i gang, en grønn tag indikerer drift fullført.
Merk: MINUTTER støtter ikke .czi filer, TIFF sekvenser eller multi-posisjon filer - hver Z-stack må være en selvstendig fil. - Etter tilfredsstillende segmentering, lagre rørledningen laget slik at den kan brukes direkte for andre embryoer eller kull.
- Følg grafisk brukergrensesnitt (GUI) av minutter å laste en confocal bilde eller stable fra harddisken, oppdage kjernen og segment bildet. Legg den hele Z-stack av rådata generert av mikroskop (.lsm, .lif, .oif, etc.). Se tabell 2 for mer informasjon om hvert trinn og instruksjoner finnes på http://katlab-tools.org og 4. Etter fullført, se utfallet av hvert trinn ved å klikke på 'Vis' knappen. En gul tag over knappen lyser når maskinen er i gang, en grønn tag indikerer drift fullført.
- Batch-modus segmentering:
Merk: Single filer kan segmenteres individuelt. Imidlertid, gitt at embryoer i et kull eller eksperiment er generelt av tilsvarende stadium, kan MINUTTER bruke segmenterings rørledningen opprettes for et enkelt bilde til en gruppe av dem uten tilsyn.- Fra Batch-modus Run-menyen, klikk "Legg til filer" og laste alle filer som skal behandles samtidig. Merk: Filer fra ulike kilder kan legges til segmentering køen.
- Klikk på «Start Batch-modus Run" og gi tid for programvare for å behandle filene. Merk: Segmentering produksjonen vil bli lagret i samme katalog hvor originalfilene der ligger.
- Segmentering vurdering og manuell korreksjon
Merk: Min segmenter bilder med svært høy nøyaktighet (> 85%), men kvaliteten på farging og bildebehandling, samt scenen av embryo, kan påvirke MINUTTER ytelse. Generelt, jo høyere atomtettheten i fosteret, vil mer sannsynlig segmenteringsfeil ta place (Tall 2D, 3). Således bør segmentering nøyaktighet evalueres for hver prøve og manuelt korrigeres om nødvendig. To typer feil oppstår vanligvis: over-segmentering og under-segmentering.- Løse over-segmentering:
- Identifisere falske positiver - apoptotiske vesikler (figur 3A a, b, d, stjernetegn) eller andre elementer som ikke er intakte kjerner, men som kan ha blitt identifisert som sådan av minutter.
Merk: Vanligvis slike falske positiver har en mindre størrelse enn reelle kjerner og kan i de fleste tilfeller, lett identifiseres og sorteres på regnearket. Imidlertid er visuell undersøkelse sterkeste, som ofte kjerner kan være bare delvis segmentert, noe som resulterer i en mindre, men gyldig segmenterte volum (figur 3A b, pilspiss). - Slett de tilsvarende postene for falske positiver fra * statistics.csv filen. Bevar de opprinnelige * statistikkCSV fil for fremtidig referanse og redigere bare en kopi av den.
- Hvis en kjerne har vært over-segmentert og presentert som 2 eller flere kjerner (figur 3A c, pil og pilspisser), enten flette postene ved gjennomsnitt deres intensitetsnivå eller, hvis lignende, holde en av postene for at cellen og kast hvile.
- Identifisere falske positiver - apoptotiske vesikler (figur 3A a, b, d, stjernetegn) eller andre elementer som ikke er intakte kjerner, men som kan ha blitt identifisert som sådan av minutter.
- Løse under-segmentering:
- Identifisere hendelser hvor MINUTTER har ikke klart å påvise grensen mellom to eller flere kjerner og dermed segmentert dem som en enkelt kjerne (figur 3A d, pil og 3B). Merk: Dette utgjør et problem for en nøyaktig legemer, men enda viktigere, for å kvantifisere protein nivåer, som nivåene målt vil være gjennomsnittet av cellene som har vært feilaktig slått sammen, og som kan tilhøre ulike linjene.
- Identifisere hendelser hvor MINUTTER har mislyktes i å oppdage en kjerne helt.
- I disse tilfellene (4.4.2.1 og 4.4.2.2), måle gjennomsnittlig gråtonene feller hver kanal i under- eller un-segmentert cellen (e) ved hjelp av et alternativt verktøy, for eksempel ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/), og erstatte den feilaktige posten med riktige nivåer. Bevare den opprinnelige * statistics.csv fil for fremtidig referanse og redigere bare en kopi av den. For å gjøre dette ved hjelp ImageJ, gjør du følgende:
- Åpne relevant flerkanals stabelen på ImageJ og importere den tilsvarende * overlaid.tiff fil generert av minutter som en virtuell stabel ( 'File'> 'Import'> 'TIFF virtuell stabel ...').
- Finn en medial del av under- eller un-segmentert kjerne.
- Bruke verktøyet for frihåndsutvalg skissere omkretsen av under- eller un-segmentert kjerne på DNA flekken kanal.
- Trykk Crl + M (Cmd + M på en Macintosh) eller gå til Analyze-menyen og velg "Mål". Denne handlingen vil ta opp Mean grå verdi for området skissert og vil vise den på et nytt vindu. Gå til "Analyser">9, sett målinger ... "og sørge for at" Mean grå verdi er valgt. Velg eventuelt andre parametere som skal måles.
- Ved å bruke det samme område som er beskrevet i trinn 4.4.2.3.3, gjenta målingen for hver av fluorescens kanaler av interesse. Resultatene vil bli lagt til den forrige på målingene 'Resultater' vinduet.
- Bruk målinger innhentet for å erstatte de feilaktige poster i * statistics.csv filen. Hvis kjernen ikke hadde blitt segmentert, sette inn en ny rad, tilordne den en ny celle-ID og innføre verdiene oppnådd i ImageJ under tilsvarende kolonne for hver kanal. Denne celle vil ikke ha romlige koordinater (X, Y og Z-verdier). Hvis kjernen hadde blitt undersegmented, duplisere sin rad, tildele forskjellige Cell IDer for hver ny celle og innføre verdiene oppnådd i ImageJ under tilsvarende kolonnen. I dette tilfellet vil begge cellene dele romlige koordinater.
Merk: Hvis romlige fordelingen skal analyseres, vi recommend unntatt XYZ koordinater av disse cellene, så vil de overlappe hverandre. For å oppnå dette, når du oppretter nye rekorder, tildele Cell IDer til dem som er lett skilles fra den opprinnelige seg (for eksempel ikke-heltall).
- Resultat dele celler. Merk: MINUTTER detekterer mitotisk samt mellomfase kjerner, men kan ikke skille mellom dem.
- Hvis mitotiske kjerner skal vurderes separat i analysen, manuelt scorer disse og legge denne informasjonen til datafilen. For å ta opp mitotiske celler, legge til en ny variabel (kolonne) til * statistics.csv datafil og tilordne forskjellige verdier til mitotiske og inter kjerner.
- Løse over-segmentering:
- Data pre-prosessering.
Merk: Når regneark er korrigert for over- og under-segmentering de er klare til å bli analysert. Analyseprosessen og datapresentasjon vil avhenge av den spesifikke forsøket. Men nedenfor er noen generelle datatransformasjoneranbefaler vi å gjennomføre før analyse:- Transform fluorescensintensiteten verdier i sin logaritme eller kvadratroten for å redusere spredning av dataene. Dette bidrar også visualisering, som rådata har en tendens til å konsentrere seg i nærheten av aksene i plottet (se figur 4B, C).
- Korriger Z-forbundet demping av fluorescens:
Merk: Fluorescens intensiteten i laser scanning konfokalmikroskopi bilder synker dypere på Z-aksen en skive er plassert (figur 4E, F).- Dersom en av epitopene detektert i prøvene er en allestedsnærværende og homogent uttrykt rengjøring atom markør, normal fluorescensstyrkene til de andre epitoper ved å dividere deres verdier i hver celle av den tilsvarende verdi av housekeeping markør.
- I fravær av en slik referansemerke, kompensere Z-assosierte tap av fluorescens på følgende måte:
- Plott verdiene for hver markør (Yaksen i diagrammet) over Z-stilling (X-aksen i diagrammet) for å visualisere reduksjonen i intensitet over Z - plottet sammen verdiene for all kontroll, vill-type-embryoer (figur 4F).
- Tilpasse en lineær modell (regresjonskurve) til plottet oppnådd i foregående trinn (intensitetsverdier over Z) for hver markør (figur 4F).
- Korriger alle verdier for hver markør ved hjelp av følgende formel:
log (opprinnelig verdi) + Z * helling av modellen (figur 4D, G).
Merk: De spesifikke trinn for å utføre denne korreksjon vil være avhengig av analyseprogramvare anvendes (R, MATLAB, etc.). Hvis du bruker R, kjører du følgende formel til å passe en lineær modell til dataene:
> Lm (log (kanal) ~ Z, data = dataframe)
der, er kanalen fluorescensen kanal som skal korrigeres, Z er Z-koordinat og dataframe er tabellen som inneholder alle verdiene for det ønskede embryo (e) (i * statistics.csv fil generert av minutter eller en modifikasjon av det).
Merk: Utgangen til den ovenfor angitte formel vil ha følgende format:
(Intercept) Z
4,76373 -,01947
der, er verdien Z helningen av regresjonslinjen for det datasettet, som absoluttverdien skal brukes for å endre den opprinnelige verdi med formelen gitt i 4.5.2.2.3 (se figur 4G for et eksempel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å lette data tolkning og presentasjon, bør man være forsiktig for ikke å skade embryoer under innsamling og manipulasjon, slik at alle celler og deres relative posisjon kan analyseres Figur 2A -. D viser eksempler på intakte blastocysts på ulike stadier med et utvidet hulrom. Skulle oppstå skader, bør det utvises ekstra forsiktighet når analysere og tolke resultater.
Kvaliteten og påliteligheten av data generert ved bruk av denne protokollen er avhengig av kvaliteten av den fiksering og på den signal-til-støy-forholdet for de antistoffer som brukes for å påvise proteiner av interesse. Bruk alltid frisk bindemiddel og teste nye antistoffer, med passende positive og negative kontroller, før begynnelsen av et sett av eksperimenter. Figur 2A viser eksempler på gode antistoffer for en rekke kjerneproteiner. Figur 2B viser et example av en god antistoff for et cytoplasmisk protein (DAB2). Figur 2C viser et eksempel på et dårlig farging, med lavt signal-til-støy-forhold, hvor prøven ble løst i bare 10 min. I dette tilfellet er antistoffet som brukes for GATA4 (Santa Cruz, sc-1237) krever O / N fiksering for å gi et sterkt signal (se 24 for forekomster av embryoer fast O / N og farget med dette antistoff). Økning av signalnivået under etterbehandlingen avslører en svært støyende bilde. I motsetning til den anti-GATA4 brukes til figur 2A (sc-9053) tilveiebringer høyt signal-til-støy-forholdet etter bare 10 minutters fiksering. Detaljer for disse og andre robuste antistoffer er gitt i Materials delen.
Begrensende faktorer for en god MINUTTER segmentering er a) forstørrelsen av objektiv brukes til bildebehandling, b) Z-oppløsning og c) kvaliteten på det kjernefysiske farging. Figur 2D viser eksempler på embryoer avbildes med en oil nedsenking 40X objektiv med en NA på 1,30 og en 0,21 mm WD. Midt panelene viser forstørrelser av ICMS der enkelte kjerner og grensen mellom dem kan skilles. Hvis du ikke bruker DNA farging (ie., Hoechst, DAPI, TO-PRO3, YO-YO1, etc.) fluorescens verdier for kvantifisering, oppkjøp parametre kan justeres individuelt for å oppnå det beste signalet. Bunnpanelene viser hvordan mer avansert embryoet, jo høyere nukleær tetthet, og dermed jo høyere er sjansen for segmenteringsfeil (pilspiss og pil). Figur 3 viser eksempler på feil som MINUTTER kan begå, slik som påvisning av apoptotiske kjerner som levende celler ( stjernene i paneler i figur 3AA, Ab, Ad), over-segmentering (pil og pilspisser i figur 3AC) eller under-segmentering (pil i figur 3AD). Figur 3B viser en sekvens av Z-skiver av en under-segmentering hendelse, hvor to celler har blitt identifisert som en. Legg merke til hvordan MINUTTER segmentering tar Z-aksen hensyn til segment et volum som omfatter alle sektorer hvor en gitt celle er til stede.
Til slutt, vil detaljene i dataanalyse avhenger av spørsmålet under studien, derfor retningslinjer for analyseprosessen kan ikke gis her. Vi har imidlertid funnet visse innledende datatransformasjoner for å være anvendbare Figur 4B -.. D viser plott av fluorescens verdier for markører Nanog og GATA6 i ICM av embryoet vist i Figur 4A Figur 4B viser de rå fluorescens-verdier oppnådd fra MINUTTER (etter manuell korrigering av under- og over segmentering). Figur 4C viser de samme data etter en logaritmisk transformasjon, som skiller de verdier fra plottet akser (en kvadratrot transformasjon er også mulig og gir et lignende plott). Figur 4D viser de samme data etter automatisk correcting verdier for Z-assosiert dempning i fluorescens, som forklart i trinn 4.5.2.2 av protokollen. Eksempler på denne Z-assosierte fluorescens forråtnelse er gitt i bildet i figur 4E og 4F plottene i. Figur 4G viser effekten av datatransformasjonen forklart i 4.5.2.2. Farger som representerer enten epiblast (rød, Nanog +, GATA6-) eller pre (blå, NANOG-, GATA6 +) identitet har blitt lagt til tomten som en funksjon av Nanog og GATA6 verdier. I dette spesielle eksempel kan celler hvor forholdet mellom log [GATA6] / log [Nanog]> 1,25 ble betraktet som Pre-celler hvor forholdet mellom log [GATA6] / log [Nanog] <1 ble vurdert EPI, og celler med en mellomliggende forholdet ble vurdert uengasjert (ingen i dette tilfellet). Alle datatransformasjoner og plottene har blitt gjort i Rstudio, er imidlertid valget av programvaren ikke kritisk og vil avhenge av sluttbrukeren.
Figur 1. Embryo Plassering, tidslinjen og analyse Pipeline. (A) Skjematisk fremstilling av en (to) mus livmorhorn og stadier av preimplantation utvikling, på linje med det område av hornet, hvor de skulle bli funnet. (B) Eksperimentell tidslinje med timing for hvert trinn. Trinn i protokollen og pause poeng (blå) er angitt. (C) Oppsummering av bildet oppkjøpet og analyse rørledning ved hjelp av minutter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempler på immunfluorescens og Nuclear tetthet. (A) Eksempler på gode immunofluorescence resultater med testede antistoffer for atom transcription faktorer. Anti-CDX2 ble oppdaget med en AlexaFluor 488 esel anti-mus sekundære antistoff, anti-GATA6 med en AlexaFluor 568 esel anti-geit, anti-Nanog med en AlexaFluor 647 esel anti-kanin, anti-GATA4 (Santa Cruz, sc-9053 ) med en AlexaFluor 488 esel-anti-kanin og anti-OCT4 med en AlexaFluor 647 esel anti-mus. Alle primære antistoffer er oppført i Materials tabell. Cytoplasmisk GATA4 nukleær farging er ikke-spesifikk, og vises også i Gata4 null embryoer (ikke vist). (B) Eksempel på god immunofluorescens for et cytoplasmisk protein, DAB2. Det er blitt påvist ved hjelp av en AlexaFluor 488 esel anti-mus. (C) Eksempel på dårlig immunofluorescens, med et lavt signal-til-støy-forholdet for en nukleær faktor. GATA4 er blitt påvist med et anti-GATA4 dannet i geit (Santa Cruz, sc-1237, mens sc-9053 (kanin-anti-GATA4) ble anvendt i (A)) og en AlexaFluor 568 esel anti-geit. (
Figur 3. Eksempler på MINS feil. (A) Sekvens av individuelle Z-profiler fra en embryo som viser eksempler på MINS segmentering feil. Apoptotiske celler som likevel er identifisert som kjerner er merket med en stjerne (*) i platene a, b og d. I panel b, ID # 39 (pilspiss), om enn meget liten, ikke identifisere den tilsvarende cellekjernen og kan således bli stående ukorrigerte. I panelet c, ID # 66 (pil) spenner over to forskjellige nuclei, som har i sin tur blitt identifisert separat (pilspisser, IDer # 65 # 54 og # 53). I panel d, har to celler (ID # 63) er identifisert som en eneste (se pil markerer den tynne kant), og denne posten bør derfor være duplisert for celletellingsformål. (B) MINUTTER detekterer celler langs Z-aksen. Bildene viser en sekvens av Z-skiver av to celler som er blitt feilaktig skåret som en enkelt on (# 123). Legg merke til hvordan det blå området som avgrenser kjernene er kontinuerlig langs Z. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Eksempel på segmentering og Data Transformations. (A) Bilder av ICM celler i en blastocyst farget for Nanog og GATA6 og øyeblikksbilde av atom segmentering av det sammeembryo bruker minutter på det kjernefysiske farging kanal (Hoechst 33342). (BD) Nanog og GATA6 fluorescens-verdier i ICM-cellene, målt ved MINUTTER plottet som rådata (B), etter å ha utført logaritmisk transformasjon (C), og etter korrigering verdier for fluorescens forråtnelse langs Z-aksen og automatisk tilordning av celle identitet basert på den korrigerte -verdier (D). (E - G) Eksempler på data korreksjon for fluorescens forfallet langs Z-aksen. (E) Bilder av en blastocyst merket med Hoechst og anti-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), som viser fluorescens nedgang langs Z-aksen. (F) Spredningsplott av fluorescens verdier langs Z-aksen for Hoechst og AF488 for en pool av embryoer, inkludert den som er vist i (E). Grå linjen representerer regresjonskurven for hvert sett av verdier. (G) Samme data som i F etter kompensering fluorescens for hver celle forråtnelseved hjelp av følgende forhold: Z-koordinat * helningen av den lineære modellen (se trinn 4.5.2.2 i protokollen). Paneler E - G ble opprinnelig publisert av forfatterne i Node (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Hver prikk representerer en celle. Scale = 20 pm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bruker Input |
| Lysstyrke (letter atom deteksjon i dim bilder) |
| Relativ X / YZ oppløsning |
| Channel til segment |
| Nuclear diameter |
| Bilde støynivå |
| MINUTTER Output |
| Segmentering Z-stack med Nuclei IDer |
| Nuclear volum |
| XYZ koordinater for hver kjerne |
| Gjennomsnitt og summering av fluorescens-verdier for hver kanal fluorescens og nucleus |
| Fordeler |
| Nøyaktig segmentering (> 85%) av kjerner i hele stabelen - gjenkjenner alle forekomster av en kjerne i tilstøtende z-seksjoner |
| Enkelt celle oppløsning |
| Unsupervised segmentering av grupper av embryoer |
| Segmentering rørledninger kan enten lagres og gjenbrukes eller justeres for hvert enkelt embryo |
Tabell 1. MINS Funksjoner
| Load bilde | Ved spørsmål, introdusere Z relative oppløsningen forbilde. Den kan hentes fra filen metadata ved hjelp av standardleser eller bruke følgende formel: X (eller Y) oppløsning / Z-oppløsning (alle i mikrometer). |
| Angi sekvensnummer (1-5) for kanalen som skal segmenteres. Ved hjelp av DNA-flekken kanal for segmentering vil påvise alle celler i bildet, men andre kanaler kan være segmentert for seg også. | |
| Skriv inn rammen for å begynne segmentering på (en som standard). Gjelder kun filer med flere tidsrammer. | |
| Forbedre Image (valgfritt) | Den hvite og sorte punkt av bildet kan justeres for å lette deteksjon. Vanligvis senke hvitpunkt og re-skalering til 0 - 255 (for 8-bits bilder) eller 0-4096 (for 12-bit bilder) vil gjøre bildet lysere og legge til rette for påvisning av dim kjerner. |
| oppdage Nuclei | Velge den beregnede atom diameter (vanligvis mellom 30 og 40 px i blastocyster). |
| For støyende bilder kan justeres støynivået. Ellers vil standardverdien legges til grunn. | |
| segment Nuclei | Bruk standard parametere. |
| Gi Nuclei | MINUTTER kan skille trophectoderm (TE) fra indre cellemasse (ICM) celler i preimplantation embryoer basert på posisjon. Dette kan også gjøres manuelt eller basert på fluorescens-nivåene, dersom en TE markør anvendes. |
| eksport~~POS=TRUNC resultater | Velg filene som skal genereres: |
| - Segmentering kledde over kanalen som brukes (TIFF sekvens fil), | |
| - Segmentering bare (TIFF sekvens fil), | |
| - Regneark med IDer for alle celler oppdages, XYZ koordinater og fluorescens nivåer (gjennomsnitt og sum) for alle kanaler for hver celle (CSV-fil). | |
| Alle filer eksporteres som standard. Filer lagres i same katalogen hvor bildene ligger. |
Tabell 2. MINUTTER Segmentering Pipeline
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å utføre en kvantitativ analyse av hel-mount immunfluorescens på preimplantation scenen museembryoer. En robust immunfluorescens protokoll 22 er etterfulgt av høy oppløsning, hel-mount confocal bildebehandling og etter bilde segmentering hjelp av en skreddersydd stykke programvare 4. Mens valget av immunofluorescens-protokollen er ikke kritisk, finner vi den som presenteres her 22 for å være rask, pålitelig og for å tilveiebringe robust signal for mange av antistoffene vi har testet. Andre protokoller kan følges, forutsatt at deres søknad er konsistente på tvers av tilsvarende eksperimenter. Mens mange faktorer påvirker utfallet av hver enkelt eksperiment, og direkte sammenligning mellom eksperimenter er ikke nødvendigvis mulig, har vi funnet ut at streve for konsistens på tvers av repetisjoner og utføre tilstrekkelige tekniske replikater reduserer variasjon. Derfor, når optimalisert, fiksering og immunolabeling reagenser og protokoller, så vel som avbildningsbetingelser bør holdes konstant mellom tilsvarende eksperimenter.
De viktigste problemene som kan oppstå ved bruk av denne protokollen faller i to grupper: 1) dårlig kvalitet flekker, med svak signal, og 2) suboptimal segmentering, med mange feil (dvs. over- og under-segmentering). Lav kvalitet immunfluorescens er vanligvis på grunn av feil fiksering av prøvene, eller til antistoffene ikke er egnet for hel-mount immunfluorescens. Sørg PFA er fersk (enten tilberedes eller tint til RT fra -20 ºC ikke lenger enn en uke før). På grunn av den lille størrelsen av preimplantation embryoer, bør 10-min fiksering i PFA være tilstrekkelig. Vi har imidlertid funnet visse antistoffer for å gi et sterkere signal med lengre fikseringstider (se Materials). Hvis et antistoff som tidligere er testet gir svakt signal, prøve forskjellige feste protokoller. Ikke alle antistoffer utføre robust på hel-mount immunofluorescence og valget av primære antistoff er avgjørende for resultatet av eksperimentet. Nye antistoff bør testes på befruktede egg, og den optimale konsentrasjonen bestemmes empirisk. I Materials diagrammet gir vi opplysninger om et antall antistoffer vi har testet og bruker rutinemessig. Se i publisert litteratur eller produsentens informasjon når de vurderer nye antistoffer. Merk at ikke alle antistoffer som er egnet for Western blot arbeid i hel-mount immunfluorescens, og konsentrasjonene som er nødvendige for immunofluorescens kan være opp til en størrelsesorden høyere. Kommersielle sekundære antistoffer generelt fungerer godt ut av boksen, men være konsekvent i bruken av primær-sekundær antistoffkombinasjoner gjennom tilsvarende eksperimenter som skal sammenlignes.
Bildekvaliteten segmentering avhenger både av kvaliteten av nukleær farging og på den atomtettheten i ICM av embryoet. Alltid streve for lyse,skarpe kjerner og bruker en høy oppløsning objektiv (40X eller mer). Hvis den kjernefysiske flekken signalet er lavt, kan du bruke en frisk delmengde eller en ny gruppe. Så lenge kjernefysiske flekken ikke blir brukt for kvantifisering, kan oppkjøpet parametere justeres for hvert embryo for å ta opp skarpe, klare kjerner. Likeledes, hvis en annen enn den nukleær farging kanalen brukes for segmentering, vil signal-til-støy-forholdet for den bestemte kanalen bestemmer kvaliteten av segmenteringen. Sent stadium blastocyster (E4.0 utover) presentere en meget høy atomtettheten i ICM. Derfor er det ved disse trinn at høy kvalitet farging er mest kritisk. Likevel vil segmentering feil skjer oftest på disse stadiene. Introduser estimert kjernediameter og bildet støynivå på MINUTTER rørledningen, utforske utfallet av hvert trinn ved hjelp av "View" -knappen og juster parametrene til et tilfredsstillende resultat er oppnådd. Bruk parametrene som produserer den beste segmenteringog manuelt korrigere feil under databehandlingen. Merk at sent stadium embryoer (~ E4.5) har et høyt celletall og manuell data korreksjon vil være tidkrevende.
Begrensningene i denne protokollen er bestemt av konfokal mikroskop system som brukes for bildeopptak. Som nevnt tidligere, bruk en høy forstørrelse objektiv, med en arbeidsavstand som gjør at Z-aksen avbildning av hele embryo (preimplantation museembryoer kan nå opp til 150-160 mikrometer i diameter). Tilsvarende vil antallet epitoper som kan detekteres bli bestemt av antall kanaler mikroskopet kan tilegne seg på en gang. Ved hjelp av denne protokollen, kan tre forskjellige epitoper i tillegg til DNA-(4 kanaler totalt) merkes samtidig på hver prøve. Kontroller at instrumentet er kalibrert for hver fluorescens kanal, blir lede optimaliseres, og at laserutgangen er konsekvent.
Metodene som er beskrevet her tillater analyse av celle stilling langsXYZ-akser, samt kvantifisering av protein ekspresjonsnivåer in situ for hver enkelt celle i mus blastocyster. I vår erfaring, kan alternative metoder ved hjelp av en hvilken som helst annen tilgjengelig programvare ikke gir du nivået for oppløsning at rørledningen brukt i denne protokollen kan (se 4 for en direkte sammenligning med andre verktøy). Den høye atomtettheten funnet i ICM av blastocysten fører til andre verktøy for å generere så mange feil at graden av manuell korreksjon som kreves gjør deres bruk upraktiske. Alternativt har manuelle celletelling og fluorescensmålinger tidligere blitt brukt til undergrupper av celler eller definerte regioner av embryoet 10,11,18,19,24. Imidlertid ville manuell telling og måling av alle fluorescens-kanaler og celle stilling, på tvers av alle XYZ akser, for å få titalls celler tilstede i hver enkelt embryo være så tidkrevende at det ikke ville tillate for high-throughput-analyse hvor det vår protokollen ble utviklet . Videre manual enssessment av fluorescens-nivåer er utsatt for skjevhet, mens en rørledning, slik som den er beskrevet her gjør det mulig for en objektiv måling av fluorescens-intensitetene for den etterfølgende bestemmelse av celleidentitet. For å tildele celle identiteter, etterforsker bør etablere en standard kriterium som skal brukes på tvers av alle prøvene for en bestemt eksperimentell satt opp. Gitt de ulike faktorene - biologiske og tekniske - som kan påvirke utfallet av immunolabeling, bør dette kriteriet bestemmes ved hjelp av egnede kontrollforsøk og tidligere publiserte data der det er mulig. Vi ser en nær fremtid hvor en algoritme kan være konstruert for automatisk bestemmelse av celleidentiteten uavhengig av forsøket. Imidlertid vil et slikt verktøy bare kommer fra mer utstrakt anvendelse og forbedring av den nåværende metode, mest sannsynlig kombinert med algoritmer for maskinlæring.
Til slutt, gitt enkelhet av denne rørledningen og stereotype morphollogi av mus preimplantation embryoer, er denne protokollen lett skalerbar for analyse av et stort antall embryoer, og dermed gir high-throughput-analyser av null-fenotyper 5,6 eller en hvilken som helst annen eksperimentell manipulasjon 7. Til slutt, mens den nåværende protokollen er utviklet og optimalisert for analyse av preimplantation museembryoer og ESC kolonier, ser vi ingen grunn til a priori hvorfor det ikke kan brukes til andre systemer med tilsvarende egenskaper - nemlig høy kjernetetthet. Vi oppfordrer andre til å eksperimentere og tilpasse denne protokollen til andre scenarier og gi tilbakemeldinger for sin fremtidige forbedringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
