Summary
Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.
Abstract
Этот протокол представляет собой способ для выполнения количественной, одноклеточный на месте анализов экспрессии белка изучать спецификации клонов в мышиных эмбрионов предимплантационной. Процедуры, необходимые для получения эмбрионов, иммунофлюоресценции, визуализации на конфокальной микроскопии и сегментации изображений и анализа описаны. Этот метод позволяет количественное определение экспрессии нескольких ядерных маркеров и пространственные (XYZ) координаты всех клеток в эмбрионе. Он использует минут, при этом изображения инструмента сегментации программное обеспечение, специально разработанной для анализа конфокальных изображений преимплантационных эмбрионов и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) колоний. MINS осуществляет неконтролируемый ядерный сегментацию через X, Y и Z размеры, и производит информацию о положении клеток в трехмерном пространстве, а также уровень ядерные флуоресценции для всех каналов с минимальным пользовательского ввода. Хотя этот протокол был оптимизирован для анализа изображенийиз предимплантационной эмбрионов этап мыши, он может быть легко адаптированы к анализу любых других образцов, обладающих хорошим соотношением сигнал-шум и где высокая плотность ядер представляет препятствие для сегментации изображений (например., выражение анализ эмбриональных стволовых клеток (ЭСК ) колонии, дифференцируя клеток в культуре, эмбрионы других видов или стадий, и т.д.).
Introduction
Мыши предимплантационной эмбрионов является парадигмой для изучения возникновения и поддержания плюрипотентности в естественных условиях, а также модели для изучения спецификации клеточных судеб и De Novo эпителизации у млекопитающих. В предимплантационная этапы развития млекопитающих посвящены созданию трех клеточных линий, которые составляют бластоцисты, а именно плюрипотентных эпибласте - что приводит к большинству соматических тканей и зародышевых клеток - и двух внеэмбриональные родах, то трофэктодерме (ТЕ) и примитивный эндодермы (предварительно) (1А) 1,2. Этот протокол описывает процедуры (1) эмбрионов урожай и исправить предимплантационной стадии мыши, (2) выполняет иммунофлюоресценции маркировать белки, представляющие интерес, (3) осуществляют весь монтажа изображений с помощью конфокальной микроскопии с Z-секционирования возможностей и (4) выполнить ядерной сегментацию конфокальных изображений и анализирует последующее количественное изображение. Этот трубопровод позволяет тон Несмещенные измерение уровней белка для присвоения клеточных идентичностей охарактеризовать субпопуляции клеток на месте. Этот протокол может быть осуществлена в качестве лишь 3 - 4 дней в течение одного помета (как правило, до 10 эмбрионов мыши), из коллекции эмбриона к анализу данных (Фиг.1В). Одновременный анализ нескольких пометов приведет к увеличению изображения и анализа данных в реальном времени бремя, таким образом, расширяя общую длину протокола.
Эмбрион предимплантационной стадии мышь экспериментально сговорчивым система, которая, учитывая ее небольшие размеры и стереотипное морфология 3, хорошо подходит для в целом визуализации клеточных процессов с разрешением одноклеточного. Для того чтобы осуществить объективную, системы уровня анализа статистически соответствующее количество эмбрионов, автоматизированная, количественный анализ трубопровода желательно. Тем не менее, из-за высокой плотности ядер массы внутренней клеточной (ICM) бластоцисты (
Трубопровод анализ, представленный здесь вращается вокруг MATLAB основе инструмента сегментации изображения Модульная Интерактивная ядерной сегментации (МИН) 4. MINS рerforms неконтролируемого ядерного сегментацию на больших партий конфокальной Z-стеки после того как пользователь установил минимальное количество свойств изображения, используя графический пользовательский интерфейс (GUI) (таблица 1) 4. Этот трубопровод доказала эффективность для генерации данных с высокой пропускной способностью на экспрессии белка и локализации клеток в обоих дикого типа, экспериментально обрабатывают и генетически модифицированные эмбрионы и стволовые клетки 5-7. В настоящем протоколе, мы опишем применение минут до сегментации зародыша изображений предимплантационной стадии. Примеры исполнения минут на ESCs см до 4,7. Автоматизированная шаг ядерная сегментация позволяет значительно сократить время трудоемкости процесса идентификации ячейки, в то время как пространственные и флуоресценции измерений интенсивности позволит объективную определение клеточных идентичностей и генерацию трехмерных карт экспрессии генов доменов и положение клеток в эмбрионе (рис 1С 5,6. MINS находится в свободном доступе на http://katlab-tools.org (программное обеспечение требует лицензии MATLAB).
Нет подход, разработанный на сегодняшний день не позволяет генерировать такие данные углубленных на экспрессию белка и локализации клеток в мышь преимплантационных эмбрионов. Все попытки до сих пор в количественном эти типы данных были ограничены в ручном определения и количественного числа клеток для различных групп населения в зародыше (либо полностью вручную, либо программного обеспечения при содействии) 9-19. Этот подход (включающий программное обеспечение мин) был специально для и протестирован на мышиных эмбрионов и предимплантационной ESCs; Тем не менее его производительность на других системах с высокой плотностью ядерной, хотя еще не проверялось, как ожидается, будет эквивалентна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике: Все животное работа, в том числе животноводства, селекции и жертвы был одобрен Институциональные животных уходу и использованию комитета Memorial Sloan Kettering Cancer Центра (IACUC), протокол # 03-12-017 мимо.
1. эмбрионов
Примечание: Все животное работа должна были одобрены институциональных и местных властей и в соответствии с местными и институциональных норм.
- Мате девственной самки мыши с плодородной шпильки мужчина желаемых генотипов.
Примечание: Если настройка природные вязки, выбирая самок в течки этапе эстрального цикла увеличивает шансы совокупления на нужную дату. Если индукции суперовуляции, пожалуйста, обратитесь к протоколам, описанным в 20. - Проверьте наличие вагинальной пробки по утрам с помощью тупого зонда. В идеале, сделать это до полудня (12:00), а совокупления вилки теряются в течение дня. Рассмотрим Нооп обнаружения вагинального пробки эмбриональный день (E) 0.5.
- На нужный день и время эмбрионального развития, разогреть M2 или промывка держит среды (FHM) до КТ или, предпочтительно, 37 ºC. Примечание: В любом М2 или FHM могут быть использованы для промывки и обработки эмбрионов. Когда устройство не используется, хранить эти средства на 4 ° С. Расчетный использование ~ 2 мл среды для каждого матки.
- Размораживайте 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном растворе (PBS) или подготовить свежий раствор. Расчетный 500 мкл 4% раствора PFA на лунку 4-луночный планшет в. Устранить один помет на каждую лунку 4-луночный планшет в. Примечание: В качестве альтернативы, 96-луночный планшет может быть использован для фиксации и хранения эмбрионов. При использовании 96-луночного планшета с, использовать 100 мкл раствора PFA каждую лунку.
- Вытяните стекло пипетки Пастера использованием открытого огня нарисовать конец капиллярной на кончике.
- Жертвоприношение самку смещением шейных позвонков или CO 2 ингаляции или в соответствии с местными и институциональных норм. Это часто desirablе, чтобы подтвердить эвтаназию животного смещением шейных позвонков.
- Спрей брюхо животного с 70% -ным этанолом, чтобы свести к минимуму выпадения волос и выполнять брюшную разрез, первый через кожу и впоследствии через стенки тела (брюшины), чтобы обнажить внутренности.
Примечание: Следующие шаги описывают процедуру, чтобы собрать бластоцисты из матки беременной самки мыши на любой стадии между E3.25 и E4.5 (Рис. 1А) Для протоколов по сбору преимплантационных эмбрионов раньше, чем E3.25 см до 20. - Найдите матки и удалить из животного. Держа шейки конец матки с парой щипцов, вырезать через шейку и тянут мягко растянуть оба рога матки.
- Обрежьте жир из матки, заботясь, чтобы не проколоть стенку матки. Это можно легко сделать в момент удаления, а еще привязаны к телу животного, а матка может быть вытянута. Альтернативно, егоможет быть сделано позже, под микроскопом рассечение, в РТ PBS. Для более детального протокола о вскрытии матки, см Протоколы 5 & 8 20
- Вырезать выше яйцеводах ниже яичников, чтобы освободить всю матку, место на чашку Петри и накрыть PBS.
Примечание: Этот шаг также позволяет мойку избыточного крови или другого мусора из матки, что облегчает последующую уборку бластоцисты. - Отдельные обе маточные рожки резанием через проксимальный конец, на обеих сторонах шейки матки и отбросить шейки матки. Отделить каждый яйцевод из матки путем разрезания ниже перешейка, который соединяет их (Рис. 1А) Передача оба рога к падению манипуляции среднего (либо M2 или FHM) для сбора и манипуляции эмбрионов.
- Под микроскопом рассечение, скрытой бластоцисты из матки и в среду, заставляя 0,5 - 1 мл M2 или FHM через каждый рог матки от шейки открытия. Используйте 1мл шприц с иглой гиподермальным. Примечание: Игла может быть притуплены с помощью подачи камень, чтобы избежать разрыва матки, хотя это не является критическим. Подробное схема для матки промывки могут быть найдены в 21.
- Использование рассечение микроскоп, местонахождение бластоцисты, которые будут разбросаны по всей капле среды. Разрешить до 1 - 2 мин для бластоцисты для опускаются на дно чашки после промывки. Использование рот управлением, стекло пипетки Пастера с конца капиллярной, собрать все бластоцисты и передать свежего капли СМИ.
- Промыть бластоцисты, перемещая их через 2 - 3 капли свежего M2 или FHM. Перемещение эмбрионов в группах по 5 - 10 бластоцист одновременно.
Примечание: Перемещение больших групп в любой момент времени будет ускорить процесс, но это также увеличит шансы случайной потери много эмбрионов. Если необученных в использовании рта управлением пипетки, практикующих манипуляции и пересадка эмбрионов должны быть рассмотрены до бeginning эксперимент. - Удалите пеллюцида (ZP) от невыведенного бластоцисты (обычно <E4.0) кратко мыть их в растворе кислой Тирода. Как только ZP больше не видна, передавать бластоцисты обратно манипуляции СМИ. Только держать эмбрионов в кислоту Тирода так долго, как строго необходимым, чтобы предотвратить повреждение клеток.
- Соблюдайте осторожность при обращении денудированные бластоцисты, что они придерживаются очень легко стеклянных и пластиковых поверхностей. Манипуляция среднего содержать 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения вложение, но кислота Тирода или PBS нет, поэтому, чтобы снизить риск повреждения или потери эмбрионов не подобрать более 2 - 5 денудированные бластоцисты в то время, когда манипулируя ими в BSA-бесплатно или бессывороточной PBS или кислоты Тирода.
Примечание: В качестве альтернативы, слой стекло пипетки с 1% BSA перед использованием, чтобы уменьшить прилипание эмбрионов к поверхности стекла.
- Соблюдайте осторожность при обращении денудированные бластоцисты, что они придерживаются очень легко стеклянных и пластиковых поверхностей. Манипуляция среднего содержать 4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) для предотвращения вложение, но кислота Тирода или PBS нет, поэтому, чтобы снизить риск повреждения или потери эмбрионов не подобрать более 2 - 5 денудированные бластоцисты в то время, когда манипулируя ими в BSA-бесплатно или бессывороточной PBS или кислоты Тирода.
- Покройте дно каждой лункииз 4-луночный блюдо культуры ткани с тонким слоем 1% агара, 0,9% NaCl, чтобы предотвратить эмбрионов от присоединения к пластику. Альтернативно, добавить 4 мг / мл БСА в PBS (PBS-BSA).
- Заполните одну лунку покрытием 4-луночного блюдо культуры ткани с 500 мкл RT PBS (или PBS-BSA), а другой хорошо с 500 мкл 4% PFA в PBS.
- Промыть бластоцисты в РТ PBS и зафиксировать в 4% PFA в ФБР в течение 10 мин при комнатной температуре. Переезд в PBS (или PBS-BSA) после фиксации.
- Если эмбрионы не будут обработаны немедленно, покрыть PBS, содержащий зародыши слоем минерального масла для предотвращения испарения (что приводит к высыханию образца) и хранить пластины при температуре 4 ° С.
Примечание: Различные методы фиксации и времена могут быть использованы в зависимости от эксперимента, эпитопы интересных и антитела, которые будут использоваться. Какой бы метод выбора, быть постоянной в течение эквивалентные эксперименты, чтобы облегчить последующее сравнение результатов окрашивания.
Примечание: Паузаточка: Эмбрионы могут храниться при температуре 4 ° С в PBS в течение нескольких недель, прежде чем приступить к следующему шагу. Обеспечить PBS стерильна и / или добавить 100 ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина (Pen-Strep) для предотвращения бактериального заражения (особенно при использовании PBS-BSA), если предвидя длительного хранения.
2. иммунофлуоресценции
- Выполните иммунофлуоресценции с использованием любого протокола, который ранее была проверена и подтверждена, чтобы быть надежной для всей монтажа иммунофлюоресценции. Примечание: Мы рекомендуем те, что описаны в 22 и 11. В настоящей статье бывший будут описаны. Какой бы метод выбора, быть постоянной в течение эквивалентные эксперименты, чтобы облегчить сравнение результатов окрашивания.
- Используйте гибкую, поливинилхлорид, понятно, U-дном 96-луночного планшета для выполнения последовательные стадии протокола иммунофлюоресценции. Заполните каждую лунку 50 - 100 мкл раствора и двигаться эмбрионов от одного решенияк другому с использованием L-образный рот пипеткой. Примечание Этот подход минимизирует использование реагентов и облегчает отслеживание шаги, а также параллельное окрашивание нескольких экспериментальных группах.
- Дополнительно: Покрыть дно лунки с тонким слоем 1% агара, 0,9% NaCl, чтобы предотвратить прилипание зародышей к пластмассе. Не добавлять BSA в иммунофлюоресценции решений.
- Подготовьте УАТС (0,1% Тритон Х-100 в PBS). Если ожидая выполнения нескольких экспериментов иммунофлюоресценции, подготовить 50 мл АТС и хранить при температуре 4 ° С между экспериментами.
- Получают раствор проницаемости (0,5% Тритон Х-100, 100 мМ глицина в PBS). Сделать 1 мл (или в зависимости от того количество, необходимое) свежего раствора пермеабилизации для каждого эксперимента.
- Подготовьте блокирующий раствор (2% лошадиной сыворотки (HS) или 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) с Pen-Strep в PBS). Подготовьте 10 мл и хранят при температуре 4 ° С между экспериментами.
- Никаких различий не наблюдалось между либотип сыворотки, однако, быть последовательным в выборе блокирующий раствор, используемый для эквивалентных экспериментах.
- Промыть фиксированные эмбрионы в течение 5 мин при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
- Проницаемыми эмбрионов в течение 5 мин при комнатной температуре в пермеабилизации раствора (~ 100 мкл).
- Промыть эмбрионы в течение 5 мин при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
- Блок эмбрионы в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
Примечание: Эмбрионы могут быть заблокированы до O / N периодов при 4 ° С без заметного улучшения или ущерб по сравнению с 30 мин блокирующих шагов. - Выдержите эмбрионов O / N при 4 ° С в первичных антител / антитела разводили в блокирующем растворе (~ 100 мкл). Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
- Определить оптимальную разбавление для каждого первичного антитела заранее. См дiscussion и материалы раздела для тестируемых разбавлений ряда антител.
- После O / N инкубации, промыть эмбрионы 3x в течение 5 минут каждый при комнатной температуре в УАТС (~ 100 мкл).
- Блок эмбрионы в течение 30 мин до 1 ч при комнатной температуре в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
- Инкубируйте эмбрионов для 1 до 2 ч при температуре 4 ° С в вторичное антитело / антител разбавленного в 4 мкг / мл в ~ 100 мкл блокирующего раствора. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
- Промыть эмбрионы 2x в течение 5 мин каждый при комнатной температуре в УАТС.
- Перемещение эмбрионов предпочтительного пятна ДНК. При использовании Hoechst 33342, разбавить до 5 мкг / мл в PBS. Накройте решение со слоем минерального масла, чтобы предотвратить испарение или держать во влажной камере.
Примечание: Пауза точку: Если эмбрионы не изображаемого сразу, они могут быть сохранены для ир до нескольких недель в растворе ядерного окрашивания. В этом случае, обеспечить PBS стерильна и / или добавить Pen-Strep или азид натрия, чтобы предотвратить рост бактерий и загрязнений.
3. конфокальной микроскопии
Примечание: Отдельные конфокальной конфигурации микроскопа потребует особых параметров измерения быть скорректированы для системы и программного обеспечения на месте. Тем не менее, в следующем разделе представлены ряд общих правил, которые следуют, которые должны быть применимы к любой данной системы.
- Использование тонкой рот пипеткой, сделать микрокапель PBS или раствора ядерной пятно на стеклянной поверхности 35мм стеклянным дном блюдо и накрыть минеральном масле. В качестве альтернативы, использовать обычный покровное с силиконовыми сепараторов, чтобы избежать повреждения эмбрионов и накрыть предметное стекло микроскопа. Примечание: При использовании обычного покровное, эмбрионы могут не быть впоследствии вновь расположен или восстановлены для генотипирования, поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать стеклянным дномблюда.
- Место эмбрионов в микрокапель и устроить в согласованном порядке, предпочтительно с осью ICM-полости, параллельной поверхности стекла. Настройка блюдо на держателе микроскопа. Примечание: Изображения, полученные на лазерных сканирующих конфокальных микроскопов страдают от оси Z.-ассоциированной потерей интенсивности флуоресценции. Поэтому последовательность в расположении важно для сравнения интенсивности между эквивалентными регионах на разных эмбрионов.
- Настройка параметров-ссылок, используя дикие эмбрионов типа, которые не были предметом каких-либо лечения, которые могут изменить экспрессию генов.
- Получение изображений с использованием объектива большим увеличением (т.е. 40X или выше), чтобы получить данные, которые будут способствовать точной сегментации, используя инструмент мин 4.
Примечание: Использование цифрового зума на цели 20Х не даст изображения подходящего разрешения для сегментации, используя мин. Следует также отметить, рабочее расстояние (WD) целевой, так и должно бытьдостаточно, чтобы позволить приобретение Z-стека, который охватывает весь бластоцисты, таким образом долгое WD (~ 130 - мкм 150) Цель обычно необходимо. Показанные изображения на рисунках 2 - 4 были получены с помощью 1,30 масляный иммерсионный объектив 40X / NA с рабочим расстоянием 210 мкм. - Используйте самую слабую лазерный, что обеспечивает сильное отношение сигнал-шум без отбеливания флуорофоры.
- Регулировка усиления и смещения для получения широкого динамического диапазона без передержки образца. Разоблачение изображений, чтобы покрыть большую часть, или охватывать весь, серый Диапазон шкалы будет способствовать выявлению небольшими различиями в интенсивности между изображениями.
- С помощью небольшой (1 мкМ) Z-шаг, так как разрешение по оси Z является критическим для точного сегментирования с мин.
Примечание: размеры XY не влияют на процесс ядерного сегментации, только размер файла изображения. Как правило, 512 х 512 пикселей является достаточным разрешением XY для публикации качественных снимков без compromiпеть места на жестком диске. - Критический шаг: Держите визуализации параметров последовательные внутри и между изображениями сессий того же эксперимента с тем, чтобы иметь возможность сравнить образцы.
- Получение изображений с использованием объектива большим увеличением (т.е. 40X или выше), чтобы получить данные, которые будут способствовать точной сегментации, используя инструмент мин 4.
- Визуализация партий эмбрионов:
- Image когерентные группы (пометы, эксперименты) в течение одной сессии, когда это возможно.
- Хранить параметры последовательные внутри и между сеансами изображений для повторов одного и того же эксперимента.
- Эмбрионы Image повсюду (всего оси Z.), чтобы захватить каждую клетку.
Примечание: Если желательно, эмбрион генотипирование может быть сделано после визуализации, как описано в 23. Необходимость ПЦР должна быть определена эмпирически и зависит от локуса, которые необходимо анализировать и праймеров, используемых.
- Убедитесь, чтобы иметь возможность соответствовать эмбрионов к изображениям ретроспективно.
4. Анализ изображения и предварительной обработки данных
- Загрузить и установить минут 4 от HTTP: // Катлаb-tools.org (требуется лицензия MATLAB).
- Выполните сегментацию изображения:
- Следуйте графический пользовательский интерфейс (GUI) из минут, чтобы загрузить конфокальной изображение или стек с жесткого диска, обнаружение ядер и сегментировать изображение. Загрузите весь Z-Stack исходных данных, генерируемых микроскопом (.lsm, .lif, .oif и т.д.). См таблицу 2 для подробной информации о каждом шаге и инструкциями по http://katlab-tools.org и 4. После завершения просмотра результатов каждого шага, нажав на кнопку, соответствующую 'View'. Желтый тег над кнопкой указывает операцию в процессе, зеленый бирка указывает операция завершена.
Примечание: MINS настоящее время не поддерживает .czi файлы, .tiff последовательностей или многостраничных файлов позиции - каждый Z-стек должен быть независимым файлом. - После удовлетворительной сегментации, сохранить трубопровод созданную таким образом это может быть использован непосредственно для других эмбрионов или пометов.
- Следуйте графический пользовательский интерфейс (GUI) из минут, чтобы загрузить конфокальной изображение или стек с жесткого диска, обнаружение ядер и сегментировать изображение. Загрузите весь Z-Stack исходных данных, генерируемых микроскопом (.lsm, .lif, .oif и т.д.). См таблицу 2 для подробной информации о каждом шаге и инструкциями по http://katlab-tools.org и 4. После завершения просмотра результатов каждого шага, нажав на кнопку, соответствующую 'View'. Желтый тег над кнопкой указывает операцию в процессе, зеленый бирка указывает операция завершена.
- Сегментация в пакетном режиме:
Примечание: Single файлы могут быть сегментирован по отдельности. Однако, учитывая, что эмбрионы внутри подстилки или эксперимента, как правило, сопоставимой стадии, MINS можно применить сегментации трубопровод, созданный для одного снимка к группе них без присмотра.- Из меню в пакетном режиме Run, нажмите кнопку "Добавить файлы" и загрузить все файлы, которые будут обработаны сразу. Примечание: Файлы из различных источников могут быть добавлены в очередь сегментации.
- Нажмите "Начать пакетном режиме Run 'и дать время для программного обеспечения для обработки файлов. Примечание: Выход Сегментация будут сохранены в той же директории, где исходные файлы, где находится.
- Оценка Сегментация и ручная коррекция
Примечание: MINS сегменты изображения с очень высокой точностью (> 85%), однако, качество окраски и обработки изображений, а также этап эмбриона, может повлиять на производительность мин. Обычно, чем выше ядерная плотность в пределах эмбриона, тем больше вероятность ошибки сегментации примет Placе (Рисунки 2D, 3). Таким образом, точность сегментации должны быть оценены для каждого образца и вручную исправить, если это необходимо. Два типа ошибок, как правило, происходят: чрезмерной сегментации и под-сегментации.- Решение чрезмерной сегментации:
- Определить количество ложных срабатываний - апоптоза везикулы (Фигура 3А а, б, д, звездочками) или другие элементы, которые не являются неизменными ядра, но которые, возможно, были идентифицированы в качестве таковых минут.
Примечание: Как правило, такие ложных срабатываний имеют меньший размер, чем реальных ядер и может, в большинстве случаев, можно легко идентифицировать и сортируются на таблицу. Однако визуальный осмотр настоятельно рекомендуется, так как зачастую ядра могут быть лишь частично сегментированные, в результате чего меньше, но действительный сегментированного объема (Фигура 3А б, стрелки). - Удалить соответствующие записи для ложных срабатываний из файла * statistics.csv. Сохранить оригинальный * Статистика.csv файл для дальнейшего использования и редактирования только его копию.
- Если ядро было чрезмерно сегментирован и представлены в виде 2-х или более ядер (рис 3А с, стрелки и наконечники для стрел), либо объединить эти записи путем усреднения их уровень интенсивности или, если подобное, держать на одной из записей для этой ячейки и отбросить отдых.
- Определить количество ложных срабатываний - апоптоза везикулы (Фигура 3А а, б, д, звездочками) или другие элементы, которые не являются неизменными ядра, но которые, возможно, были идентифицированы в качестве таковых минут.
- Решение под сегментации:
- Определить события, где MINS не удалось обнаружить границу между двумя или более ядер и, следовательно сегментированные их как одно ядро (фиг.3А д, стрелка и 3В). Примечание: Это создает проблему для точного подсчета клеток, но что более важно, для количественного содержания белка, а измеренные уровни будет средним из клеток, которые были ошибочно объединены, и которые могут принадлежать к различным родах.
- Определить события, где MINS не удалось обнаружить ядро в целом.
- В этих случаях (4.4.2.1 и 4.4.2.2), измерить средние уровни серого Fили каждый канал в недо- или снимите сегментированного элемента (элементов) с использованием альтернативного инструмента, таких как ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj), и заменить неисправный запись с правильными уровнях. Сохранение оригинального * statistics.csv файл для дальнейшего использования и редактирования только копию. Чтобы сделать это, используя ImageJ, выполните следующие действия:
- Откройте соответствующую стопку многоканальный на ImageJ и импорта соответствующий * overlaid.tiff файл, созданный с помощью МИНУТ качестве виртуального стека ( 'Файл'> 'Import'> 'TIFF виртуальный стек ... ").
- Найти медиальной раздел недо- или не-сегментированным ядром.
- Используя инструмент выделения произвольной формы очертить периметр понимания или не-сегментированным ядром на канале ДНК пятен.
- Пресс Crl + М (Cmd + M на Macintosh) или перейти к меню Анализ и выберите 'Measure'. Это действие будет записывать среднее значение серого для области, описанной и отобразит его в новом окне. К "Анализ">9; измерения Set ... "и убедитесь, что 'Mean значение серого' выбран. Выберите любые другие параметры должны быть измерены.
- Используя ту же самую площадь, описанной в шаге 4.4.2.3.3, повторить измерение для каждой из флуоресцентных каналов, представляющих интерес. Результаты будут добавлены к предыдущим на окне измерений 'Результаты.
- Используйте полученные замеры, чтобы заменить ошибочные записи в файле * statistics.csv. Если ядро не были сегментирован, вставить новую строку, присвоить ему новое Cell ID и ввести полученные значения в ImageJ под соответствующей колонке для каждого канала. Эта ячейка не имеют пространственные координаты (X, Y и Z.). Если ядро было undersegmented, дублировать строку, присвоить различные идентификаторы мобильных каждому новому клетки и ввести полученные значения в ImageJ под соответствующей колонке. В этом случае, оба клетки будут делиться пространственные координаты.
Примечание: Если пространственное распределение должно быть проанализировано, мы гecommend исключая XYZ координаты этих клеток, как они будут перекрываться. С этой целью, при создании новых записей, назначить идентификаторов сот на них, которые легко отличить от оригинальных (например, не являющихся целыми числами).
- Результат деления клеток. Примечание: MINS обнаруживает митотического а также интерфазных ядрах, но не может их различить.
- Если митоза ядер следует рассматривать отдельно в анализе, вручную набрать эти и добавить эту информацию в файле данных. Для записи митотических клеток, добавьте новую переменную (столбец) в * файла данных statistics.csv и назначать различные значения митотического и интерфазных ядрах.
- Решение чрезмерной сегментации:
- Данные предварительной обработки.
Примечание: После того, как электронные таблицы были исправлены для избыточной и недостаточной сегментации они готовы быть проанализированы. Процесс анализа и представления данных, будет зависеть от конкретного эксперимента. Тем не менее, ниже приведены некоторые общие преобразования данныхрекомендуется проводить перед анализом:- Transform значения интенсивности флуоресценции в их логарифм или корень квадратный уменьшить разброс данных. Это также помогает визуализация, а исходные данные имеют тенденцию концентрироваться вблизи оси участке (рис 4B, C).
- Исправьте Z-ассоциированной затухание флуоресценции:
Примечание: Интенсивность флуоресценции в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии изображений уменьшается глубже по оси Z. кусочек находится (рис 4E, F).- Если один из эпитопов, обнаруженных в образцах является повсеместно и равномерно выражена уборка ядерного маркера, нормализуют интенсивности флуоресценции других эпитопов путем деления их значения в каждой ячейке по соответствующим значением домашнего хозяйства маркера.
- При отсутствии такого опорного маркера, компенсировать Z-ассоциированной потерей флуоресценции следующим образом:
- Участок значения каждого маркера (Yось графика) над Z положении (ось Х на графике), чтобы визуализировать снижение интенсивности по Z - участок вместе значения всех контролем, дикие эмбрионы типа (рис 4F).
- Установите линейную модель (кривая регрессии) к сюжету, полученного на предыдущей стадии (интенсивность ценностей над Z) для каждого маркера (рис 4F).
- Исправьте все значения для каждого маркера, используя следующую формулу:
Журнал (исходное значение) + Z * наклон модели (рис 4D, G).
Примечание: конкретные шаги для выполнения этой коррекции будет зависеть от программного обеспечения для анализа, используемого (R, MATLAB и т.д.). При использовании R, выполните следующую формулу, чтобы соответствовать линейной модели к данным:
> Лм (журнал (канал) ~ Z, данные = dataframe)
где, канал флуоресценции канала должна быть исправлена, Z является Z координат и dataframe является таблица, содержащая все значения для нужного эмбриона (ов) (в * статistics.csv файл, сгенерированный минут или модификации ней).
Примечание: Выход по вышеприведенной формуле будет иметь следующий формат:
(Переадресация) Z
4,76373 -0,01947
где значение Z представляет собой наклон линии регрессии для этого набора данных, который абсолютное значение должно быть использовано для изменения первоначальной стоимости с формулой, приведенной в 4.5.2.2.3 (рис 4G для примера).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для облегчения интерпретации данных и представления, следует позаботиться, чтобы не повредить эмбрионов во время сбора и обработки, так что могут быть проанализированы все клетки и их взаимное расположение фиг.2А -. D приведены примеры неповрежденных бластоцисты на разных этапах с расширенной полости. В случае повреждения, особую осторожность следует принимать при анализе и интерпретации результатов.
Качество и надежность данных, полученных с помощью этого протокола зависит от качества фиксации и от соотношения сигнал-шум антител, используемых для обнаружения белков, представляющих интерес. Всегда использовать свежие фиксатором и испытать новые антитела, с соответствующими положительным и отрицательным контролем, перед началом ряд экспериментов. Фигура 2А показаны примеры хороших антител для ряда ядерных белков. 2В показан examplе хорошего антитела для цитоплазматическим белком (DAB2). Рисунок 2C показывает пример плохой окрашивания, с низким отношением сигнал-шум, когда образец был зафиксирован лишь 10 мин. В этом случае, антитело, используемое для GATA4 (Santa Cruz, SC-+1237) требует O / N фиксацию обеспечить сильный сигнал (см 24 для экземпляров эмбрионов фиксированных O / N и окрашенных этого антитела). Повышение уровня сигнала во постобработки показывает очень шумный образ. В отличие от анти-GATA4 используется для фиг.2А (SC-9053) обеспечивает высокую отношение сигнал-шум после только 10-минутной фиксации. Детали для этих и других стойких антител представлены в разделе Материалы.
Факторы, ограничивающие сегментации хороший мин являются а) увеличение объектива, используемого для работы с изображениями, б) Z-разрешение и с) качество ядерное окрашивание. Рис 2D показывает примеры эмбрионов визуализируют с помощью ОИл погружение 40X цель с NA 1,30 и 0,21 мм WD. Средний панели показывают увеличениях холодильников, где можно выделить отдельные ядра и граница между ними. Если вы не используете окрашивание ДНК (т.е.., Hoechst, DAPI, к PRO3, YO-YO1 и т.д.) значений флуоресценции для количественного параметры сбора может быть индивидуально настроен для получения наилучшего сигнала. Нижние панели показывают, как более продвинутые эмбрион, тем выше ядерной плотности и, следовательно, тем выше вероятность ошибок сегментации (стрелки и стрелки). Рисунок 3 показывает примеры ошибок, которые MINS может совершить, например, обнаруживать апоптоза ядер, как живых клеток ( звездочки в панелях на рис 3AA, AB, AD), чрезмерной сегментации (стрелка и наконечники стрел на рисунке 3AC) или под-сегментации (стрелка на рисунке 3AD). 3В показана последовательность Z-ломтики события под сегментации, где две клетки были идентифицированы как один, Обратите внимание, как сегментация MINS принимает оси учетом сегментировать объем, который содержит все ломтики где данная ячейка присутствует.
Наконец, специфика анализа данных будет зависеть от вопроса изучается, поэтому рекомендации для процесса анализа не может быть приведен здесь. Тем не менее, мы нашли некоторые преобразования исходных данных, чтобы быть полезным 4В -.. D представлены графики значений флуоресценции для NANOG маркеров и GATA6 в ICM эмбриона, показанной на рисунке 4A Рисунок 4B показывает необработанные значения флуоресценции, полученные из МИНУТ (после ручной коррекции недостаточного и избыточного сегментации). Рисунок 4C показывает те же данные после логарифмической трансформации, которая отделяет значения от участка осей (корень квадратный преобразование также возможно и дает аналогичный участок). показывает рис 4D те же самые данные после автоматически сorrecting значения для Z-ассоциированной затухания флуоресценции, как описано в шаге 4.5.2.2 протокола. Примеры этого Z-ассоциированной флуоресцентного распада даны в изображении на рис 4E и графиков на 4F. Рисунок 4G показывает эффект преобразования данных объясняется в 4.5.2.2. Цвета, представляющие либо эпибласта (красного, NANOG +, GATA6-) или предварительный (синий, NANOG-, GATA6 +) идентичность были добавлены к сюжету в зависимости от NANOG и ценностей GATA6. В этом конкретном примере, клетки, где отношение журнале [GATA6] / войти [NANOG]> 1,25 считались PrE, клетки, где отношение журнале [GATA6] / войти [NANOG] <1 считались EPI, и клетки с промежуточным соотношение считались незавершенных (никто в данном случае). Все преобразования данных и графики были сделаны в Rstudio, однако, выбор программного обеспечения не является критическим и будет зависеть от конечного пользователя.
Рисунок 1. Эмбрион Расположение, временные рамки и анализ трубопроводов. (А) Схематическое одного (двух) мыши рог матки и этапы развития предимплантационной, выровнены с областью рога, где они должны быть найдены. (Б) Экспериментальное график с временем для каждого шага. Шаги протокола и точек паузы (синий) указаны. (C) Резюме получения изображения и трубопровода анализ с использованием мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 2. Примеры иммунофлуоресценции и ядерной плотности. (A) Примеры хороших результатов иммунофлюоресценции с проверенных антител к ядерному трanscription факторы. Анти-CDX2 был обнаружен с AlexaFluor 488 осел анти-мышиного вторичным антителом, анти-GATA6 с AlexaFluor 568 осла анти-козел, анти-NANOG с AlexaFluor 647 осла анти-кролик, анти-GATA4 (Santa Cruz, SC-9053 ) с AlexaFluor 488 осла анти-кролик и анти-OCT4 с AlexaFluor 647 осла анти-мыши. Все первичные антитела, перечислены в таблице материалов. Цитоплазматической GATA4 ядерное окрашивание является неспецифическим, и появляется также в GATA4 нулевых эмбрионов (не показан). (Б) Пример хорошей иммунофлюоресценции для цитоплазматическим белком, DAB2. Было обнаружено, используя AlexaFluor 488 осла анти-мышь. (C) Пример плохой иммунофлюоресценции, с низким отношением сигнал-шум для ядерного фактора. GATA4 была обнаружена с анти-GATA4 поднятой в козла (Santa Cruz, SC-+1237; тогда SC-9053 (кроличье анти-GATA4) был использован в (А)) и AlexaFluor 568 осла анти-козел. (
Рисунок 3. Примеры ошибок минут. (А) последовательность отдельных Z-секций из одного эмбриона, показывая примеры ошибок сегментации мин. Апоптоза клеток, которые, тем не менее, определенные как ядер, отмеченные звездочкой (*) в Панели А, Б и Г. На панели В, ID # 39 (стрелки), хотя и очень маленький, это определить соответствующую ядро и, таким образом, останется без поправки. В панели С, ID # 66 (стрелка) охватывает два разных пuclei, которые, в свою очередь были определены отдельно (наконечники стрел, идентификаторы # 65 # 54 и # 53). В Панель D, две ячейки (ID # 63) были определены как одно (см стрелка маркировки тонкую границу) и, следовательно, эта запись должна быть продублирована в целях подсчета клеток. (B) MINS обнаруживает клетки вдоль Z-оси. Изображения показывают последовательность Z-ломтики двух ячеек, которые были ошибочно набранных как одно (# 123). Обратите внимание, как синяя область разграничении ядра непрерывна вдоль Z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Пример сегментации и данных преобразований. (A) Изображения ICM клеток бластоцисты окрашиваются по NANOG и GATA6 и снимок ядерного сегментации тот жеЭмбрион с помощью мин на канале ядерного окрашивания (Hoechst 33342). (BD) Nanog и GATA6 флуоресценции значения в ICM клеток, измеренных МИНУТ нанесены как необработанные данные (В), после выполнения логарифмическое преобразование (C) и после коррекции значения для флуоресцентного распада вдоль оси Z и автоматически назначая тождества клеточные на основании скорректированного значения (D). (E - G) Примеры коррекции данных для тушения флуоресценции вдоль оси Z. (Е) Изображения бластоцисты, помеченный Hoechst и анти-CDX2 + AlexaFluor 488 (AF488), показывая снижение флуоресценции вдоль оси Z. (F) Диаграммы разброса значений флуоресценции вдоль оси Z. для Hoechst и AF488 для пула эмбрионов включая один показанный в (Е). Серая линия представляет собой кривую регрессии для каждого набора значений. (G) те же данные, в F после компенсации затухания флюоресценции для каждой ячейкииспользуя следующий фактор: Z координат * наклон линейной модели (см шаг 4.5.2.2 в протоколе). Панели E - G первоначально были опубликованы авторами в узле (http://thenode.biologists.com/99problems/discussion/) Каждая точка представляет одну ячейку. Масштаб = 20мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| Ввод данных пользователем |
| Порог яркости * (облегчает обнаружения ядерных при тусклом изображений) |
| Относительная X / разрешение YZ |
| Канал для сегмента |
| Ядерная диаметр |
| Уровень шума изображения |
| МИН Выходной |
| Сегментация Z-стек с Nuclе идентификаторы |
| Ядерная объем |
| XYZ координаты для каждого ядра |
| Средняя и суммирование значений флуоресценции для каждого канала флуоресценции и ядра |
| преимущества |
| Точная сегментация (> 85%) ядер по всему стеку - признает все вхождения ядра в соседних Z-секций |
| Разрешение Single Cell |
| Неконтролируемое сегментация партий эмбрионов |
| Сегментация трубопроводы могут быть либо сохранены и повторно использованы или регулировать для каждого конкретного эмбриона |
Таблица 1. MINS Особенности
| Load Image | В ответ на запрос, ввести Z относительное разрешение дляобраз. Она может быть получена из метаданных файла, используя читателя по умолчанию или с использованием следующей формулы: X (или Y) Разрешение Разрешение / Z (все в мкм). |
| Введите номер последовательности (1 - 5) для канала будет сегментирован. Использование морилки канал ДНК сегментации будет обнаруживать все клетки в изображении, однако, и другие каналы могут быть сегментирован отдельно тоже. | |
| Введите кадр, чтобы начать сегментацию по телефону (1 по умолчанию). Относится только к файлам с несколькими временных. | |
| Повышение изображения (по желанию) | Белый и черный точка изображения может быть скорректирована для облегчения обнаружения. Вообще понижения точки белого и перемасштабирования до 0 - 255 (для 8-битных изображений) или 0 - 4096 (для 12-битных изображений) сделает изображение ярче и облегчить обнаружение тусклых ядер. |
| Обнаружение Ядра | Выберите оценочную ядерной диаметр (как правило, от 30 до 40 точек в бластоцисты), |
| Для шумных изображений уровень шума может быть скорректирована. В противном случае, значение по умолчанию будет применяться. | |
| Сегмент Ядра | Используйте параметры по умолчанию. |
| Классифицировать Ядра | МИН можно выделить трофэктодерме (TE) от внутренней клеточной массы клеток (ICM) в предимплантационной эмбрионов на основе позиции. Это также может быть сделано вручную или на основе уровней флуоресценции, если используется маркер ТЕ. |
| Экспорт результатов | Выберите файлы, которые будут созданы: |
| - Сегментация накладывается по каналу используемого (.tiff файл последовательности), | |
| - Только сегментация (файл последовательности .tiff), | |
| - Таблица с идентификаторами для всех ячеек, обнаруженных, координат XYZ и уровней флуоресценции (в среднем и SUM) для всех каналов для каждой ячейки (.csv файл). | |
| Все файлы экспортируются по умолчанию. Файлы сохраняются в секAme каталог, в котором изображения расположены. |
Таблица 2. MINS трубопроводов Сегментация
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий Протокол описывает метод для выполнения количественного анализа целом монтажа иммунофлуоресценции на предимплантационной эмбрионов этап мыши. Надежный протокол 22 иммунофлюоресценции следует высоким разрешением, целый монтажа конфокальной микроскопии и сегментацией изображения, используя индивидуальный кусок программного обеспечения 4. Хотя выбор протокола иммунофлюоресценции не является критическим, мы находим один представленные здесь 22, чтобы быть быстрым, надежным и обеспечивать надежную сигнал для многих из антител, которые мы тестировали. Другие протоколы могут быть соблюдены, при условии, их применение одинаковым во эквивалентных экспериментов. Хотя многие факторы влияют на исход каждого отдельного эксперимента и прямое сравнение между экспериментами не обязательно это возможно, мы обнаружили, что стремление к согласованности между повторениями и выполнения достаточными техническими повторов значительно снижает изменчивость. Поэтому, как только оптимизирован, фиксация и immunolabelinг реагенты и протоколы, а также условия формирования изображения должно быть постоянным между эквивалентными экспериментов.
Основные проблемы, которые могут возникнуть при применении этого протокола, делятся на две группы: 1) плохое качество окраски, с тусклым сигнала, и 2) оптимальным сегментации, с большим количеством ошибок (т.е., избыточной и недостаточной сегментации). Низкое качество иммунофлюоресценции, как правило, из-за неправильного закрепления образцов или антитела не пригодные для всей монтажа иммунофлюоресценции. Убедитесь PFA свежий (либо свеже не подготовлены или оттаивали до комнатной температуры от -20 ° С не более чем за неделю до). Учитывая небольшой размер преимплантационных эмбрионов, 10-мин фиксация в PFA должно хватить. Тем не менее, мы нашли определенные антитела с получением более сильный сигнал с более длительным временем фиксации (см Материалы). Если антитело, которое было ранее проходят обеспечивает слабый сигнал, пробуют различные протоколы фиксации. Не все антитела выполняют энергично на весь монтажа IMMunofluorescence и выбор первичного антитела имеет решающее значение для исхода эксперимента. Новые антитела должны быть проверены на эмбрионах и оптимальная концентрация определяется эмпирически. На графике материалов мы обеспечиваем детали ряда антител, которые мы тестировали, и использовать постоянно. Обратитесь к литературе или информации производителя при рассмотрении новых антител. Обратите внимание, что не все антитела, пригодные для Вестерн-блот работы в целом монтажа иммунофлюоресценции, а концентрации, необходимые для иммунофлуоресценции может составлять до одного порядок выше. Коммерческие вторичные антитела обычно хорошо работают из коробки, однако, быть последовательным в использовании комбинаций первичных вторичных антител на протяжении эквивалентных экспериментов, которые будут сравнивать.
Качество сегментации изображения зависит как от качества ядерного окрашивания и на атомной плотности в ICM эмбриона. Всегда стремиться к яркой,острые ядра и использовать цели с высокой разрешающей способностью (40X или больше). Если сигнал, окрашивающий ядра является низким, используют свежий аликвоты или новую партию. Пока ядерной пятно не используется для количественного, параметры обнаружения могут быть приспособлены для каждого эмбриона с целью записи острые, яркие ядра. Аналогично, если канал, отличный от ядерного окрашивания используется для сегментации, отношение сигнал-шум этого конкретного канала будет определять качество сегментации. Поздние бластоцисты стадии (E4.0 года) представляют очень высокий ядерной плотности в ICM. Поэтому именно на этих этапах, что высокое качество окрашивания, наиболее важно. Тем не менее, ошибки сегментации пройдет чаще на этих этапах. Представьте расчетную ядерной диаметр и уровень шума изображения на трубопроводе мин, исследовать результат каждого шага с помощью кнопки "Просмотр" и настроить параметры, пока не будет получен удовлетворительный результат. Используйте параметры, которые производят наилучшей сегментациии вручную исправлять ошибки в процессе обработки данных. Внимание, что поздний эмбрионов этап (~ E4.5) имеют высокую подсчет клеток и ручную коррекцию данные будут трудоемким.
Ограничения этого протокола определяются конфокальной системы микроскопа, используемого для получения изображения. Как уже обсуждалось, использовать цели с большим увеличением, с рабочим расстоянием, что позволяет Z-оси визуализацию всей эмбриона (предимплантационная мышиные эмбрионы могут доходить до 150 - 160 мкм в диаметре). Аналогичным образом, количество эпитопов, которые могут быть обнаружены, будет определяться числом каналов микроскоп может приобрести сразу. Используя этот протокол, три различных эпитопа помимо ДНК (4 канала суммарно) могут быть помечены одновременно на каждом образце. Убедитесь, что прибор откалиброван для каждого канала флюоресценции, стробирование оптимизирован и что выходная мощность лазера соответствует.
Методы, описанные здесь позволяет анализировать положение ячейки вдольXYZ осей, а также количественной оценки уровней экспрессии белка на месте дл каждую клетку в бластоцисты мыши. По нашему опыту, альтернативные методы, использующие любую другую имеющуюся программного обеспечения, не может обеспечить уровень разрешения, что трубопровод применяется в этом протоколе может (см 4 для прямого сравнения с другими инструментами). Высокой ядерная плотность найдено в ICM бластоциста вызывает другие инструменты для создания так много ошибок, что степень ручной коррекции, необходимой делает их использование непрактичным. В качестве альтернативы, ручных измерений подсчета клеток и флуоресцентных ранее использовались для подмножеств клеток или определенных областях эмбриона 10,11,18,19,24. Однако, руководство подсчет и измерение всех каналов флуоресценции и положение клеток, во всех осей XYZ, для десятков клеток, присутствующих в каждом эмбриона бы так много времени, что не позволит анализа с высокой пропускной способностью, для которых была придумана наш протокол , Кроме того, руководство сssessment уровней флуоресценции склонен к предвзятости, а трубопровод, такой как описан здесь позволяет объективное измерение интенсивности флуоресценции для последующего определения идентичности клеток. Для того чтобы назначить ячейки идентичности, исследователь должен установить стандартный критерий для применения во всех образцах для конкретного экспериментальной установки. Учитывая различные факторы - биологические и технические - которые могут повлиять на исход иммунноокрашивания, этот критерий должен быть определен с использованием соответствующих контрольных экспериментов и ранее опубликованные данные, где это возможно. Мы видим ближайшее будущее, где алгоритм может быть разработан для автоматического определения идентичности клеток независимо от эксперимента. Тем не менее, такой инструмент будет исходить только от более широкого применения и совершенствования текущего метода, скорее всего в сочетании с алгоритмами машинного обучения.
Наконец, учитывая простоту этого трубопровода и стереотипного morpholлогия мыши предимплантационной эмбрионов, этот протокол легко масштабируется для анализа большого числа зародышей, тем самым позволяя высокой пропускной анализов нулевых фенотипов 5,6 или любой другой экспериментальной манипуляции 7. Наконец, в то время как обычный протокол был разработан и оптимизирован для анализа преимплантационных мышиных эмбрионов и ESC колоний, мы не видим никаких оснований априори, почему она не может быть применена к другим системам с аналогичными характеристиками, а именно - большой ядерной плотности. Мы призываем других экспериментировать и адаптировать этот протокол для других сценариев и обеспечить обратную связь для его дальнейшего совершенствования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo collection | |||
| Blunt probe for plug checking | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Surgery scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Pre-assembled aspirator tube & mouthpiece | Sigma | A5177 | |
| Longer rubber tubing | Fisher | 14-178-2AA | |
| M2 | Millipore | MR-015-D | |
| FHM | Millipore | MR-024-D | |
| Acid Tyrode's solution | Millipore | MR-004-D | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| 4-well plates | Nunc/Thermo-Fisher | 12-566-300 | |
| Immunofluorescence | |||
| 96-well U-bottom plates | Fisher | 14-245-73 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| Horse serum | Sigma | H0146 | |
| Primary antibodies | Concentration | ||
| CDX2 | Biogenex | AM392-5M | 1:200 |
| GATA6 | R&D | AF1700 | 1:100 |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-9053 | 1:100, 10 min fixation |
| GATA4 | Santa Cruz | sc-1237 | 1:100, O/N fixation |
| SOX17 | R&D | AF1924 | 1:100 |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | 1:500 |
| OCT4 | Santa Cruz | sc-5279 | 1:100, 10 min to O/N fixation |
| DAB2 | BD | BD-610464 | 1:200 |
| Secondary antibodies | Life Technologies | Various | 1:500 |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Imaging | |||
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Segmentation | |||
| Computer running 64-bit Windows OS | n/a | Verify minimal system requirements at http://katlab-tools.org and in Lou et al., (2014) Stem Cell Reports | |
| MATLAB (software) | Mathworks | n/a | |
| MINS (software) | Free | n/a | http://katlab-tools.org |
References
- Saiz, N., Plusa, B. Early cell fate decisions in the mouse embryo. Reproduction. 145 (3), R65-R80 (2013).
- Schrode, N., Xenopoulos, P., Piliszek, A., Frankenberg, S., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Anatomy of a blastocyst: cell behaviors driving cell fate choice and morphogenesis in the early mouse embryo. Genesis. 51 (4), 219-233 (2013).
- Saiz, N., Plusa, B., Hadjantonakis, A. -K. Single cells get together: High-resolution approaches to study the dynamics of early mouse development. Seminars in cell & developmental biology. , (2015).
- Lou, X., Kang, M., Xenopoulos, P., Muñoz-Descalzo, S., Hadjantonakis, A. -K. A Rapid and Efficient 2D/3D Nuclear Segmentation Method for Analysis of Early Mouse Embryo and Stem Cell Image Data. Stem Cell Reports. 2 (3), 382-397 (2014).
- Le Bin, G. C., Muñoz-Descalzo, S., et al. Oct4 is required for lineage priming in the developing inner cell mass of the mouse blastocyst. Development. 141 (5), 1001-1010 (2014).
- Schrode, N., Saiz, N., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. GATA6 Levels Modulate Primitive Endoderm Cell Fate Choice and Timing in the Mouse Blastocyst. Developmental Cell. 29 (4), 454-467 (2014).
- Xenopoulos, P., Kang, M., Puliafito, A., Di Talia, S., Hadjantonakis, A. -K. Heterogeneities in Nanog Expression Drive Stable Commitment to Pluripotency in the Mouse Blastocyst. Cell Reports. 10 (9), 1508-1520 (2015).
- Saiz, N., Kang, M., et al. Quantitative analyses for elucidating mechanisms of cell fate commitment in the mouse blastocyst. Proceedings of SPIE. Optical Methods in Developmental Biology III, 9334, (2015).
- Fleming, T. P. A quantitative analysis of cell allocation to trophectoderm and inner cell mass in the mouse blastocyst. Developmental biology. 119 (2), 520-531 (1987).
- Dietrich, J. -E., Hiiragi, T. Stochastic patterning in the mouse pre-implantation embryo. Development. 134 (23), 4219-4231 (2007).
- Plusa, B., Piliszek, A., Frankenberg, S., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. Distinct sequential cell behaviours direct primitive endoderm formation in the mouse blastocyst. Development. 135 (18), 3081-3091 (2008).
- Gerbe, F., Cox, B., Rossant, J., Chazaud, C. Dynamic expression of Lrp2 pathway members reveals progressive epithelial differentiation of primitive endoderm in mouse blastocyst. Developmental biology. 313 (2), 594-602 (2008).
- Nichols, J., Silva, J., Roode, M., Smith, A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo. Development. 136 (19), 3215-3222 (2009).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Morris, S. A., Teo, R. T. Y., Li, H., Robson, P., Glover, D. M., Zernicka-Goetz, M. Origin and formation of the first two distinct cell types of the inner cell mass in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6364-6369 (2010).
- Artus, J., Panthier, J. -J., Hadjantonakis, A. -K. A role for PDGF signaling in expansion of the extra-embryonic endoderm lineage of the mouse blastocyst. Development. 137 (20), 3361-3372 (2010).
- Artus, J., Piliszek, A., Hadjantonakis, A. -K. The primitive endoderm lineage of the mouse blastocyst: Sequential transcription factor activation and regulation of differentiation by Sox17. Developmental biology. 350 (2), 393-404 (2011).
- Kang, M., Piliszek, A., Artus, J., Hadjantonakis, A. -K. FGF4 is required for lineage restriction and salt-and-pepper distribution of primitive endoderm factors but not their initial expression in the mouse. Development. 140 (2), 267-279 (2013).
- Bessonnard, S., De Mot, L., et al. Gata6, Nanog and Erk signaling control cell fate in the inner cell mass through a tristable regulatory network. Development. 141 (19), 3637-3648 (2014).
- Behringer, R. R., Gertsenstein, M., Vintersten Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2014).
- Czechanski, A., Byers, C., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Frankenberg, S., Shaw, G., Freyer, C., Pask, A. J., Renfree, M. B. Early cell lineage specification in a marsupial: a case for diverse mechanisms among mammals. Development. 140, 965-975 (2013).
- Artus, J., Vandormael-Pournin, S., Frödin, M., Nacerddine, K., Babinet, C., Cohen-Tannoudji, M. Impaired mitotic progression and preimplantation lethality in mice lacking OMCG1, a new evolutionarily conserved nuclear protein. Molecular and cellular biology. 25 (14), 6289-6302 (2005).
- Saiz, N., Grabarek, J. B., Sabherwal, N., Papalopulu, N., Plusa, B. Atypical protein kinase C couples cell sorting with primitive endoderm maturation in the mouse blastocyst. Development. 140 (21), 4311-4322 (2013).
