Abstract
ictus ischemico avvia una robusta risposta infiammatoria che inizia nel compartimento intravascolare e comporta una rapida attivazione delle cellule residenti cerebrale. Un meccanismo chiave di questa risposta infiammatoria è la migrazione delle cellule immunitarie circolanti al cervello ischemico agevolata dal rilascio chemochine e una maggiore espressione di molecole di adesione endoteliale. leucociti cervello-invadendo sono ben noti, contribuendo alla fase iniziale danno ischemico secondario, ma il loro significato per la cessazione di infiammazione e la riparazione del cervello in seguito è stato recentemente notato solo.
Qui, è previsto un semplice protocollo per l'isolamento efficace delle cellule immunitarie dal cervello ischemico mouse. Dopo la perfusione transcardial, gli emisferi cerebrali sono sezionati e dissociate meccanicamente. digestione enzimatica con Liberase segue gradiente di densità (ad esempio Percoll) centrifugazione per rimuovere mielina e detriti cellulari. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo is la procedura gradiente di densità monostrato che non richiede preparazione tempo di gradienti e può essere eseguita in modo affidabile. L'approccio produce conta di cellule altamente riproducibili per l'emisfero del cervello e consente di misurare più pannelli citometria a flusso in una sola replica biologica. La caratterizzazione fenotipica e quantificazione dei leucociti cervello dopo l'ictus che invade sperimentale possono contribuire ad una migliore comprensione dei loro ruoli molteplici in danno e riparazione ischemico.
Introduction
ictus cerebrale innesca una risposta infiammatoria sostenuta che inizia rapidamente dopo la cessazione del flusso ematico locale e coinvolge praticamente tutte le parti del sistema immunitario. Una importante caratteristica di questa risposta infiammatoria è un afflusso temporizzato di cellule immunitarie al cervello che è guidato da l'attivazione delle cellule endoteliali cerebrali, sostanziale la secrezione di chemochine e aumentato efflusso simpatica 1-3. Infiltrazione di cellule infiammatorie è stato precedentemente considerato deleterio in ictus ischemico, tuttavia, diversi studi di trattamento progettati per bloccare indiscriminatamente leucociti uscita al cervello non sono riusciti a indurre un misurabile beneficio clinico 4. Più recentemente, è diventato evidente che le cellule derivate da monociti inizialmente coinvolti nella progressione del danno ischemico 5 potrebbe anche svolgere un ruolo centrale per la risoluzione dell'infiammazione e successiva riparazione dei tessuti 6.
Grazie all'individuazione di fenotipica e functil'eterogeneità onale tra monociti e macrofagi, le conoscenze sul ruolo dei fagociti mononucleari nello sviluppo e nella risoluzione di infiammazione si è notevolmente ampliato. Nei topi, monociti circolanti possono essere classificati in almeno due sottoinsiemi funzionalmente distinte secondo la loro espressione di superficie di linfociti antigene 6 complesso (Ly-6C) 7. Mentre Ly-6C elevati monocytes''inflammatory erano chiaramente dimostrato di essere essenziale per il controllo delle infezioni batteriche 8, il loro ruolo lesioni sterile è più controverso. In ictus ischemico, l'ablazione selettiva di CCR2 + Ly-6C alto monociti provocato emorragica infarto trasformazione 6. Tuttavia, lo stesso approccio sperimentale ha migliorato la disabilità acuta dopo emorragia intracerebrale 9. Allo stesso modo, diversi sottoinsiemi di cellule T si ritiene di esercitare sia azioni lesive 10 o di protezione 11 in danno cerebrale ischemico, tuttavia, i dati sono controversiAl 12,13 e merita ulteriori indagini. Data questa complessità crescente, diventa chiaro che la conoscenza più approfondita sui ruoli delle diverse cellule immunitarie nel danno e riparazione ischemico è cruciale per tradurre i risultati sperimentali in terapie di targeting infiammazione dopo l'ictus.
Oggi, il più potente strumento per analizzare le risposte immunitarie cellulari è policromatica citometria a flusso. Esso consente l'identificazione e la quantificazione dei vari sottogruppi di cellule immunitarie nel sito di infiammazione, senza la necessità di polarizzare il sistema di etichettatura in vivo o manipolazione genetica 14. Colorazione simultanea di marcatori di superficie delle cellule con anticorpi contro citochine intracellulari 15 o fattori di trascrizione 16 fornisce inoltre informazioni sullo stato funzionale delle singole cellule, fenotipicamente identificati. Come un grave inconveniente, sospensioni di cellule singole sono necessari per le analisi di citometria a flusso, e quindi le informazioni sulla loclizzazione di infiltrati cellulari viene perso. Tuttavia, mentre l'istologia è ideale per ottenere informazioni spaziali, è limitato dal numero di anticorpi che possono essere utilizzati in una sola volta per caratterizzare i sottotipi di cellule immunitarie in un particolare tessuto. Oggi, è necessaria una combinazione di presenza e assenza di vari marcatori di superficie per individuare con certezza rare sottopopolazioni di cellule immunitarie, specialmente le popolazioni di cellule derivate da monociti distinti durante l'infiammazione 17.
Qui, descriviamo un protocollo efficace per isolare un alto numero di leucociti nel cervello postischemico mouse utilizzando una semplice gradiente di densità a singolo strato. Le sospensioni cellulari ottenute possono essere sia analizzati dal flusso multidimensionale citometria o essere ulteriormente arricchita da ordinamento citometria a flusso o la selezione immunomagnetica per eseguire analisi a valle altamente specifici. Il metodo di perfusione dettagli transcardial, la rimozione degli emisferi cerebrali, la dissociazione di tessuto cerebrale in un'unica cella suspensioni, la densità centrifugazione in gradiente per la rimozione della mielina, nonché colorazione degli anticorpi per l'analisi di citometria di flusso.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali devono essere conformi alle norme in funzione per la cura degli animali (ad es., La Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicati dal National Institutes of Health, NIH Publication No. 85-23, rivisto 1996) e devono essere approvati dall'autorità stato appropriato.
1. Preparazione dei reagenti
- Tampone di digestione (1 ml per emisfero): Sciogliere una miscela standardizzata di enzimi digestivi purificati, per esempio, Liberase concentrazione termolisina basso (TL) ad una concentrazione di 2U / ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) contenenti calcio (Ca) e magnesio (Mg)
- tampone di lavaggio con DNAsi: Sciogliere DNAsi I a una concentrazione di 666U / ml in HBSS (Ca / Mg libero) contenente 10% di siero fetale di vitello (FCS)
- Lavaggio buffer senza DNAsi: HBSS (Ca / Mg libero) contenente il 10% di FCS
- Medium Density gradiente (5 ml per emisfero): preparare magazzino gradiente di densità isotonica0; media (SIP; 100%) mescolando nove parti di media gradiente di densità con una parte 1,5 M di cloruro di sodio. Diluire SIP alla densità del 25% con l'aggiunta di un volume adeguato di HBSS (Ca / Mg libero) contenente 3% di FCS
- Citometria a flusso tampone (FC): Preparare tampone fosfato salino (PBS) contenente 3% di FCS
2. transitoria Medio occlusione dell'arteria cerebrale
NOTA: transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) tramite la tecnica di sutura intraluminale è stata eseguita come descritto in precedenza 18 a 12 settimane di età maschi C57BL / 6 topi.
- Brevemente, anestetizzare topi con 2,0% isoflurano in ossigeno al 100%. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 ° C ± 0,5 ° C da un dispositivo di riscaldamento di retroazione controllata.
- Dopo legatura dell'arteria carotide comune e l'arteria carotide esterna, introdurre una standardizzata silicio gomma monofilamento rivestito in arteria carotide comune e farlo avanzare all'origine della c centralearteria erebral.
- Dopo 45 minuti rimuovere il filamento per consentire la riperfusione. Negli animali sham-operati, ritirare immediatamente il filamento dopo occlusione dell'arteria cerebrale media per evitare l'ischemia.
3. transcardial perfusione e dissezione del cervello
- Preparare una pompa peristaltica perfusione immergendo un'estremità del tubo nel ghiacciata HBSS (Ca / Mg libera). Fissare un ottuso 23 ago G all'altra estremità del tubo di perfusione e accendere la pompa per riempire completamente i tubi con HBSS (Ca / Mg libera).
- Profondamente anestetizzare il mouse con il 4% isoflurano e eutanasia da CO 2 inalazione.
- Mettere dorsale del mouse su una scheda dissezione incorporato in un vassoio di plastica. Diffusione anteriori e zampe posteriori quanto più ampia possibile e fissarli sulla tavola di dissezione con 20 aghi G.
- Afferra la pelle addominale con un dritto 1 x 2 pinze denti e usare le forbici iris affilate di fare una incisione laterale attraverso il tegumento e la parete addominale ed esporre lafegato.
- Sollevare lo sterno e incidere il diaframma con la lama smussata di taglienti / smussato forbici iris. Continuare a tagliare la gabbia toracica laterale su entrambi i lati in direzione caudocranial. Fare attenzione a non danneggiare il polmone, il cuore e le arterie toraciche.
- Sollevare il lembo cutaneo con una pinza smussato e il pin sulla scheda di dissezione. Utilizzare pinze smussato-end e forbici per separare con attenzione il cuore da tessuto connettivo.
- Tenere cuore con un blunt-end pinza e inserire la punta della smussata 23 ago G con il tubo perfusione allegato nella all'apice del ventricolo sinistro. Nota: Non inserire l'ago troppo lontano nel ventricolo sinistro per evitare lesioni del setto interventricolare. Se necessario, fissare la cannula in posizione con un dritto pinze taglienti.
- Incidere l'atrio destro con le forbici iris affilate e girare immediatamente la pompa (portata: 8 - 10 ml / min).
- Continuare fino a quando la perfusione del fegato presenta con un colore caffè leggero (~ 30 ml di HBSS). per tuttola perfusione, evitare attentamente qualsiasi formazione di bolle d'aria nel tubo.
- Decapitare il mouse con le forbici chirurgiche rette appena dietro il cranio. Utilizzare iris forbici per fare una incisione mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
- Mettere una punta di iris forbici affilate nel foro occipitale e tagliare lateralmente nel cranio. Ripetere per l'altro lato.
- Usare le forbici iris affilato per tagliare con cura dalla stessa cavità la linea mediana verso il naso. Prova di mantenere la fine delle forbici come superficiali possibile per evitare lesioni del cervello.
- Utilizzare una pinza sottile per sbucciare delicatamente le ossa craniche da ciascun emisfero del cervello. Nota: tessuto infartuato può aderire alle meningi o il cranio; fare attenzione a non perdere il tessuto cerebrale a causa di dissezione incauti
- Sollevare il cervello con una spatola e usare le forbici iris affilate di sezionare con cura le fibre dei nervi cranici che la fissano al cranio. Posizionare il cervello in una provetta da 15 ml riempito con 10 ml di HBSS (+ Ca / Mg) e tenerlo shortly sul ghiaccio.
4. La dissociazione di tessuto cerebrale in sospensioni singola cella
- Rimuovere con cautela tronco cerebrale e del cervelletto con una lama di rasoio pulito. Utilizzare una lama di rasoio pulito per hemisect cervello e tagliare ogni emisfero lungo il piano coronale in tre pezzi di approssimativamente uguale dimensione.
- Tritare sezionato tessuti di ogni emisfero attraverso un colino cella di 100 micron con il fine stantuffo di una siringa da 5 ml. Continuamente lavare il filtro cella con ghiacciata HBSS (+ Ca / Mg). Conservare i campioni omogeneizzati sul ghiaccio.
- Centrifugare a 286 xg e 4 ° C per 5 min, scartare accuratamente il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone di digestione e trasferire la sospensione in una provetta 2 ml. Incubare sospensione sotto lenta rotazione continua a 37 ° C per 1 ora.
- sospensione cellulare Sieve attraverso un colino cella di 70 micron e risciacquare abbondantemente con 3 ml di tampone di lavaggio contenente DNAsi seguiti da 15 ml di tampone di lavaggio senza DNAsi. Centrifugare a 286 xg e 18 ° C per 5 minuti e scartare il surnatante. Nota: Nota: L'uso di DNAsi elimina il muco DNA causati da lisi cellulare che potrebbe portare alla aggregazione delle cellule compromettere la sopravvivenza delle cellule.
5. gradiente di densità centrifugazione per la rimozione della mielina e Cell Debris
- Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di 25% media gradiente di densità e pipetta la sospensione in un tubo da 15 ml. Mescolare accuratamente da ripetute e delicato pipettaggio evitando la formazione di bolle. Nota: media gradiente di densità deve essere utilizzato a temperatura ambiente per evitare grumi di cellule.
- Centrifugare a 521 xg e 18 ° C per 20 min. Utilizzare basso profilo di accelerazione del rotore e consentire il rotore per interrompere senza freno. Rimuovere delicatamente i tubi dalla centrifuga senza agitare. attenzione aspirare il cappotto mielina e il surnatante preservando il pellet di cellule sul fondo della provetta. Nota: Assicurarsi di rimuovere l'intero cappotto mielina come qualsiasi residuo sarà impaiR analisi di citometria di flusso.
- Risospendere il pellet in 10 ml di DNAsi tampone di lavaggio e di pipetta la sospensione in un nuovo tubo 15 ml. Nota: questo passaggio di lavaggio è fondamentale poiché sufficiente asportazione di media gradiente di densità contribuiscono alla quantità e qualità del campione cellulare finale.
- Centrifuga di nuovo a 286 xg e 10 ° C per 5 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 ml di tampone di lavaggio a freddo e determinare la conta delle cellule e la vitalità con esclusione trypan blu in un emocitometro. Conservare i campioni a 4 ° C e ulteriori loro processo rapidamente.
6. colorazione degli anticorpi per l'analisi citometria a flusso
- Prima di etichettatura anticorpi, incubare la sospensione cellulare a 4 ° C per 10 min con CD16 anti-topo / CD32 FC-Receptor reagente bloccante (concentrazione finale di 2,5 mg / ml, fattore di diluizione 1: 200) per impedire il legame aspecifico.
- Aggiungere anticorpi primari fluoroforo coniugato al unconcentrazione ppropriate (come indicato nella tabella 1) alla sospensione cellulare e incubare a 4 ° C per 20 minuti al buio. Nota: I campioni di controllo non sono colorate con anticorpi primari, ma per il resto trattati allo stesso modo.
- Lavare le cellule con 2 ml di tampone di FC e centrifugare a 350 xg e 10 ° C per 7 min.Carefully aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 200 microlitri di tampone FC. Conservare i campioni temporaneamente a 4 ° C al buio fino al momento dell'analisi di citometria di flusso.
7. quantificazione assoluta per il conteggio sfere
- Inversamente pipetta 40 microlitri di tampone FC e 10 ml di sospensione cellulare in un tubo di conteggio contenente un numero noto di perline fluorescenti. Nota: Fare attenzione che le pipette sono tarati per fornire esattamente 10 ml di campione successivo calcolo della conta dei leucociti si riferisce a questo volume.
- Incubare sospensione cellulare con anticorpi CD45 coniugati con fluoresceina (concentrazione finale5 ug / ml, il fattore di diluizione 1: 100) a 4 ° C per 20 minuti al buio.
- In senso inverso riempire il tubo di conteggio con 200 ml di buffer di FC senza alcuna fase di lavaggio e registrare direttamente le cellule CD45 + nel citofluorimetro.
8. citometria a flusso di acquisizione
Nota: Per analizzare il pannello di anticorpi proposto, il citometro appropriata deve essere dotato di un blu (488 nm), rosso (635 nm) e viola (405 nm) del laser e filtri per FITC, PE, PerCP Cy5.5, PECy7, APC-Cy7 e AmCyan.
- Regolare in avanti (FSC) e laterale scatter (SSC) utilizzando cellule non colorate da un emisfero ischemico. Discriminate doppiette da singole cellule in un diagramma a punti che mostra la zona e l'altezza di FSC.
- Visualizzare tutte le singole cellule in istogrammi singolo parametro per ciascun canale di fluorescenza utilizzato e regolare il tubo fotomoltiplicatore (PMT) tensioni in modo che le singole cellule vengono visualizzati nella all'estrema sinistra dell'istogramma.
- Utilizzare un CD45-FITC singolocampione colorato per controllare le impostazioni scatter e PMT per le cellule di interesse da backgating CD45 alte cellule immunitarie in ogni trama istogramma e dispersione. Nota: Adattare tensioni PMT di FITC in modo che CD45 negativo, intermedio (int) e le cellule che esprimono alti possono essere differenziate le une dalle altre.
- Utilizzare anticorpi catturati sfere di compensazione per effettuare la compensazione multicolore. Set porte per la microglia (CD45 INT) e dei leucociti (CD45 alta) e, successivamente, definire sottopopolazioni di leucociti secondo la strategia di gating mostrata nella figura 1.
Representative Results
ischemia cerebrale è stata avviata in 12 settimane di età maschi C57BL / 6 topi via transitoria filamento di occlusione dell'arteria cerebrale media sinistra (MCAO). Per il funzionamento farsa è stato inserito il filamento ad occludere l'arteria cerebrale media sinistra e ritirato immediatamente per consentire la riperfusione istante. È importante sottolineare che, neuroinfiammazione cellulare differisce in modo sostanziale tra i modelli di ictus comunemente applicati 19. Ciò deve essere tenuto in considerazione soprattutto quando estrapolando i risultati di studi su animali per la fisiopatologia eterogeneo di ictus umana.
I topi sono stati sacrificati 24 ore dopo MCAO di analizzare in anticipo l'invasione delle cellule immunitarie al cerebrale ischemico. la conta delle cellule ottenute da dell'emisfero ischemico (MCAO ipsi; 0.95 ± 0.25 x 10E6) dopo centrifugazione in gradiente di densità erano paragonabili a quelli dell'emisfero controlaterale (MCAO controindicazioni; 1.09 ± 0.30 x 10E6) e il ipsilateraleemisfero di topi sham (sham ipsi; 1,12 ± 0,18 x 10E6, ANOVA, p = 0,524). La vitalità delle cellule isolate misurati da trypan esclusione blu era alta e non ha significativamente differiscono tra i gruppi (sham 96.85 ± 0.60%, MCAO contra 97.12 ± 1,18%, MCAO ipsi 95.68 ± 2,04%, a senso unico-ANOVA, p = 0.253 ).
La composizione del cervello infiltrarsi 24 ore dopo MCAO stata determinata mediante analisi citofluorimetrica. La Figura 1 illustra la strategia di gating schematicamente (A) e in un tratto animali rappresentante (B). Leucociti Brain-infiltrazione sono stati definiti come elevati cellule CD45 che può essere differenziata da CD45 int microglia. All'interno di popolazione CD45, neutrofili polimorfonucleati (PMN) sono stati identificati dall'espressione Ly-6G, mentre i linfociti T sono stati delineati come CD45 alta CD3 + cellule. I restanti alte cellule CD45 sono stati poi distinguerecati da CD19 (linfociti B) e l'espressione CD11b. La frazione CD11b + è stato ulteriormente subcategorized in Ly-6C alta `monocytes` infiammatorio e una bassa densità di popolazione Ly-6C che comprende monociti, cellule dendritiche (DC) e macrofagi.
Nella fase acuta di ictus, le cellule immunitarie mieloidi dominano il cervello infiltrarsi 3,20. I neutrofili entrare nel cervello rapidamente dopo occlusione nave e promuovere la stravaso dei monociti infiammatorie 21. Figura 2A mostra l'aumento percentuale di LY6-G + neutrofili nel ischemico nell'emisfero 24 ore dopo MCAO rispetto al emisfero e finzione chirurgia controlaterale. Per contro, la proporzione di cellule T CD3 + nell'emisfero ischemico è (relativamente) inferiore nel cervello sano. All'interno della popolazione CD11b +, ischemia cerebrale sposta l'equilibrio verso una forte preponderanza di Ly-6C alti monociti infiammatorie (Figura2B).
Oltre alle distribuzioni relativi, tubi conteggio stati utilizzati per determinare il numero assoluto delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni sulla base di CD45 eventi positivi (Figura 3). tubi Conteggio contengono una pastiglia liofilizzata che rilascia un numero noto di perline fluorescenti. Il numero assoluto di cellule positive nel campione può essere determinata relativa eventi cellulari a tallone eventi. Per calcolare il numero di CD45 alti leucociti per emisfero è stata utilizzata la seguente equazione: CD45 alte cellule per emisfero = (CD45 alti eventi x conteggio sfere / eventi perline campione totale) x (volume sospensione totale (100 ml) / volume del campione (10 microlitri )). 24 ore dopo MCAO, totale conta dei leucociti nell'emisfero infarto è risultata significativamente aumentata rispetto al controlaterale emisfero e finzione chirurgia (Figura 3D, ANOVA, p = 0,0004). Conti del di Stinct sottoinsiemi di cellule immunitarie (PMN, cellule T, cellule B, Ly-6C alta e Ly-6C bassi monociti) possono essere facilmente calcolati moltiplicando la frequenza relativa con il CD45 elevato numero totale di leucociti del rispettivo campione.
Figura 1. strategia di gating per citometria a flusso. (A) Rappresentazione schematica della strategia di gating. (B) mostra l'analisi di citometria di flusso dei leucociti isolati da un rappresentante cervello di topo 24 ore dopo occlusione dell'arteria cerebrale media. FSC scatter in avanti, PMN neutrofili polimorfonucleati, CDC classici cellule dendritiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. Differenziazione delle immunitario sottopopolazioni cellulari. La distribuzione relativa di Ly-6G + -neutrophils (A), le cellule T CD3 + (A) e sottoinsiemi monociti individuati dal differenziale espressione di Ly-6C (B) nel ipsilaterale (IPSI) e controlaterale ( contra) nell'emisfero 24 ore dopo occlusione dell'arteria cerebrale (MCAO) oppure un rispettivo chirurgia farsa. Percentuale di ogni popolazione è indicato nella porta. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Quantificazione del cervello leucociti da Counting Beads. (A) mostra il cancello tallone altamente doppio positivo. All'interno della popolazione singola cellula (B) CD45 int microglia può essere differenziata da alti leucociti CD45 (C). Per la quantificazione, il numero di gated alti eventi CD45 era normalizzata agli eventi tallone contati. Si noti che leucociti totali (CD45 alto) i conteggi sono significativamente aumentati nel ipsilaterale (IPSI) emisfero rispetto al controlaterale (contra) emisfero e finzione chirurgia 24 ore dopo occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO). ** P <0.01, *** p <0,001 per ANOVA e Tukey`s post hoc test di confronti multipli. n = 4-6 per gruppo. FSC scatter in avanti. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| fluorocromo | FITC | PE | PerCP | PC7 | V500 | |
| (Cy5.5) | ||||||
| Antigene | CD45.2 | CD3 | Ly-6G | CD19 | Ly-6C | CD11b |
| Concentrazione finale [ug / ml] | 5 | 1 | 0.2 | 0.2 | 1 | 1 |
| fattore di diluizione | 1/100 | 1/200 | 1 / 1.000 | 1 / 1.000 | 1/200 | 1/200 |
| Clone | 104 | 145-2C11 | 1A8 | 6D5 | AL-21 | M1 / 70 |
Tabella 1. base di anticorpi Cocktail per immunitario delle cellule di identificazione nel ischemica cerebrale.
Discussion
Qui, si descrive un metodo semplice ed efficace per l'isolamento dei leucociti dal cervello murino dopo ictus sperimentale. L'approccio produce in modo affidabile la conta delle cellule altamente riproducibili per l'emisfero cerebrale che permette di misurare diversi pannelli di flusso in una sola replica biologica.
Apparentemente, una rimozione incompleta del sangue, comprese cellule immunitarie si tradurrà in una visione distorta sulla quantità effettiva di cellule infiammatorie che entrò cerebrale ischemico. Così, quando si utilizza questo protocollo prestare particolare attenzione ad una accurata perfusione transcardial per evitare la contaminazione delle cellule immunitarie infiltrate con non-infiammatorie leucociti circolanti. Per esperienza, l'uso di aghi smussati per la perforazione ventricolo sinistro riduce il rischio di lesioni del setto interventricolare che bypassare perfusione della circolazione sistemica. L'emergere di liquido di perfusione dalle narici è un segno che la perfusione pressureis troppo alta, quindi unaportate nulli> 10 ml / min. Pallido al colore bianco del tessuto cerebrale indica una buona perfusione mentre il colore rosa è un segno di scarsa perfusione.
Un altro passaggio fondamentale di questo protocollo è efficiente dissociazione del tessuto cerebrale che comprende la frammentazione meccanica così come la digestione enzimatica. Tritare il tessuto attraverso il filtro delle cellule è fondamentale per fornire una migliore efficacia della proteasi. Tuttavia, quando omogeneizzare il tessuto, evitare una pressione eccessiva come fagociti mononucleari sono altamente suscettibili di autolisi 22. Per la digestione enzimatica Liberase TL è raccomandato che è una miscela di altamente purificata collagenasi I e II che contiene basse concentrazioni di termolisina proteasi neutra. Il confronto diretto con i protocolli di isolamento precedentemente descritti 14,22,23 rivelati significativamente più alto recupero di cellule vitali per il trattamento Liberase TL (KM dati non pubblicati). Rispetto alla collagenasi che è utilizzare spessod per l'isolamento delle cellule immunitarie dal cervello, Liberase TL contiene livelli trascurabili di endotossine. Questo è di particolare importanza se le cellule sono ordinati per l'analisi a valle a causa elevati livelli di endotossine potrebbe cambiare lo stato di attivazione delle cellule immunitarie 24 e gravemente compromettere la coltura cellulare esiti 25. Un altro inconveniente di collagenasi tradizionale è differenze significative da lotto a lotto delle attività enzimatiche e rischia di compromettere la riproducibilità dei risultati e richiede determinazione della concentrazione di lavoro per ogni lotto 26.
Nel cervello adulto, la rimozione della mielina da centrifugazione in gradiente di densità è un passo indispensabile per le applicazioni a valle, come la citometria a flusso o ulteriori studi sul gene o espressione della proteina. Uno dei principali vantaggi del protocollo è la procedura di densità monostrato che non richiede preparazione tempo di gradienti. Inoltre, il protocollo di differenziazione produce risultati affidabilis anche se effettuata da sperimentatori piuttosto inesperti. È priva di gradienti strati con densità vicini l'uno all'altro che sono difficili da pipetta senza disturbare l'interfaccia tra.
Sulla base della espressione del marcatore CD45 di superficie, il protocollo produce tre categorie principali di cellule del cervello ischemico. La stragrande maggioranza delle cellule parte di popolazione negativa CD45 che si compone di cellule neuronali, astrociti, ependimali e cellule endoteliali. La loro presenza abbondante è attribuita al gradiente di densità monostrato che mira soprattutto ad mielina efficiente e rimozione dei residui. Inoltre, una popolazione CD45 int che rappresenta microglia residente 27 può essere differenziata da un'alta popolazione CD45 che contiene principalmente infiltrazione leucociti ematogene. Tuttavia, va notato che la microglia attivata può adottare il fenotipo e la funzione delle cellule mieloidi del sangue-nato. Così, sophisticate solo applicandod tecniche come parabiosis 28, midollo osseo chimere 29 o l'analisi di mappatura destino 30 permettono una netta distinzione tra queste due popolazioni durante l'infiammazione.
L'analisi dei dati in citometria a flusso è spesso limitata alla distribuzione percentuale delle popolazioni di cellule specifiche. Tuttavia, quando si confrontano l'infarto dell'emisfero di tessuto cerebrale non infartuato questa informazione può essere fuorviante, perché non considera la conta leucocitaria totale del cervello che vengono cambiati dal danno ischemico. Così, per tracciare un quadro completo sulla grandezza e il fenotipo di infiltrati infiammatori dopo l'ictus relativa distribuzione di sottoinsiemi di cellule immunitarie dovrebbe essere integrato da numeri di cellulare assoluti. Quando si utilizza microsfere come descritto in questo protocollo, dispensazione di un volume del campione preciso è assolutamente obbligatorio per ottenere risultati attendibili. Inoltre, pipettaggio inverso è fortemente consigliato per evitare la formazione di schiuma nel tubo di conteggio. Arising bolle d'ariaridurrà il volume previsto di microsfere e quindi portare ad una sovrastima della assoluti CD45 conta alta dei leucociti nel campione.
In sintesi, questo protocollo fornisce un metodo semplice e affidabile per isolare le cellule immunitarie dal cervello. Può servire come un valido strumento per sezionare la complessità della risposta infiammatoria di ictus ischemico. Le applicazioni future includono le indagini sul ruolo dipendente dal tempo di sottoinsiemi monociti nella propagazione e la risoluzione dell'infiammazione cerebrale ischemico. Allo stesso modo, il ruolo del sistema immunitario adattativo dopo l'ictus è poco conosciuta. Analisi citofluorimetrica delle sottopopolazioni di cellule T identificati mediante l'espressione di fattori di trascrizione specifici sottoinsieme o citochine in situ potrebbe aiutare a chiarire il loro impatto sulla ripresa a lungo termine dopo l'ictus e promettenti quindi aperti per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Isabell Schulz per un eccellente supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
| Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
| FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
| Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
| Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
| HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
| Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | |
| Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
| Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
| Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
| Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
| Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
| CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
| CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
| CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
| CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
| CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
| Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
| Silicone Tubing, 1 m | World precision instruments | 503022 | |
| Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Straight 1 x 2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| 5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
| Cell strainer, 100 µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
| Omnican Fine dosage syringe 1 ml | Braun | TBD | |
| Cell strainer, 70 µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
| FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
| serological pipettes, 10 ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
| serological pipettes, 10 ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
| serological pipettes, 25 ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
| serological pipettes, 5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
| serological pipettes, 25 ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
| serological pipettes,5 ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
| Tips, 0.1 - 10 µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
| Tips, 100 - 1,000 µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
| Tips, 10 - 200 µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
| Reaction tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
| Reaction tubes 2 ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
| Bacteriological petri dish, 94 x 16 mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
| Falcon 15 ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
| Falcon 50 ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
| Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
| razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |
References
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