Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er almindeligt anvendt til at få en bedre forståelse af cellulære funktioner i levende celler med høj tidsmæssig og rumlig opløsning 1. I FRET, er energi fra en ophidset donorfluorophoren overført til en acceptor fluorophor. FRET effektivitet er stærkt afhængig af afstanden mellem donor og acceptor fluorophor og deres orientering og er derfor en følsom udlæsning af konformationelle ændringer, der påvirker de to fluorophorer. Dette fænomen udnyttes til at generere FRET-baserede biosensorer til billeddannelse af små molekyler. Ændringer i deres koncentration kan overvåges stigninger / fald i forholdet mellem emissionsintensitet acceptoren versus donorfluoroforen 2. For eksempel FRET-baserede calcium biosensorer mulighed for hurtig og stabil detektion af frie calcium-koncentrationer i levende celler 3. Andre fordele ved FRET-baserede biosensorer er billeddannelse i enkelte levende celler, tarving ikke-invasivitet deres evne målrettes til forskellige celletyper og cellulære rum 4.
Mange aspekter af intracellulær galde syre dynamik stadig dårligt forstået. For eksempel er lidt kendt om mekanismen underliggende regulering af konjugeret og ukonjugeret galdesyretransport. Eksisterende teknikker til at overvåge denne transport primært gør brug af luciferase-baserede journalister, radioaktivt mærkede galdesyrer, eller fluorescerende galde-analoger. Sidstnævnte kræver en ændring af galdesyrer, muligvis påvirke deres egenskaber. Luciferase-baserede journalister har dårlig tid opløsning. Udover, disse teknikker resultere i tab af prøven og er ikke gældende for billeddannelse i enkelte celler. Det ville derfor være en fordel at anvende metoder, der tillader levende single cell imaging transport aktivitet under anvendelse af FRET biosensorer, især da det omfatter den fordel ratiometrisk påvisning 5, 6. Mens varianter af CFP / YFP formular hyppigst anvendte FRET par, nye strategier via Morange og mCherry bærer selvassociation-inducerende mutationer har ført til en udvidelse af FRET værktøjskasse med nye sensorer, herunder en rødforskudt galdesyre sensor 7.
Vi har tidligere skabt en genetisk kodet FRET galdesyre sensor (BAS), der består af en donorfluorophor (cerulean) og en acceptor fluorophor (citrin), der er fusioneret med farnesoid X receptor (FXR) ligandbindingsdomæne (FXR-LBD) og et peptid indeholdende en LXXLL motiv 8. Dette peptid associerede med FXR-LBD i en galdesyre-afhængig måde. Ved FXR aktivering, vil afstanden mellem citrin og cerulean ændre på grund af en konformationsændring. I mammale cellelinjer, FXR aktivering resulterer i en klart påviselig forøgelse i citrin / cerulean forhold, mens det oprensede sensor virker i den modsatte retning og fører til en nedsat FRET forhold ved FXR aktivering. Denne sensor (CytoBAS)tillader overvågning af cytosoliske galdesyrebindende dynamik. Med carboxyl-terminale tilsætning af subcellulære målretning motiver, kan BAS-konstruktionen blive målrettet mod kernen (NucleoBAS) og peroxisomer (PeroxiBAS), tillader målinger af galdesyre koncentrationer i forskellige cellulære rum. Selv tilsætningen af peroxisomal targeting motivet ikke forringe dets evne til at galdesyrer, havde cellepermeable FXR-ligander inducerer ikke nogen ændringer i FRET PeroxiBAS inde peroxisomer 8. Da arten af denne uoverensstemmelse er ukendt, protokollen nedenfor er fokuseret på CytoBAS og NucleoBAS.
Anvendelsen af denne genetisk kodet FRET sensor blev for nylig demonstreret i celler, der indeholder de hepatiske galdesyre transportører Na + / taurocholat co-transporterende polypeptid (Ntcp) og opløste organiske transporter alpha / beta (OSTαβ) 8. Ntcp er den vigtigste hepatisk galdesyre importør og OSTαβ er en basolaterale tarm galdesyre transporter, der kan fungere både som importør og eksportør afhængig af den elektrokemiske galdesyre koncentrationsgradient 9, 10. Nylige data viste, at ved galdesyre transport med Ntcp og / eller OSTαβ kan robuste og hurtige reaktioner i forhold FRET som følge af ligand-LBD FXR-interaktion observeres.
Her beskriver vi detaljerede protokoller for metoder til at måle FRET såsom konfokal mikroskopisk analyse og fluorescens cellesortering (FACS), fremhæve kritiske trin, løse potentielle problemer og drøfte alternative metoder. Brug af denne genetisk kodet FRET sensor, kan galdesyre interaktion med FXR-LBD kvantificeres og overvåges direkte i levende celler og giver en hurtig og enkel metode til at visualisere galdesyretransport og dynamik i realtid. Mammale ekspressionsplasmider der koder CytoBAS og NucleoBAS er kommercielt tilgængelige. Derfor kan dette biosensor bidrage yderligere tilforståelse af galde syre transportører eller forbindelser, som aktiverer FXR og give en dybere indsigt i galdesyre biologi og signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transient transfektion
Bemærk: CytoBAS og NucleoBAS (se venligst Materialer tabel), er med held anvendt i flere celletyper, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK og HEK293T celler). Det vigtigste krav for at bruge sensoren er, at det skal komme til udtryk, der kræver det kodende DNA at komme ind i cellen.
- Harvest celler fra en 80% sammenflydende 25 cm 2-kolbe. Fortynd celler i komplet dyrkningsmedium der er egnet til den specifikke cellelinie (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7 celler).
- Plate celler ved den ønskede densitet i en steril 8 godt kamre dækglas (0,8 cm2). Tilstræbe en sub-sammenflydende (60-80% konfluens) lag af celler på dagen for eksperimentet, selvom dette ikke er afgørende.
- Tilføj fuldstændigt dyrkningsmedium til et slutvolumen på 400 pi per brønd. Tillad celler at vedhæfte i 24 timer.
- Forbered transfektion blanding i et sterilt rør ved tilsætning af 0,5 ug NucleoBASeller CytoBAS DNA til 100 pi af dyrkningsmedium (serum / antibiotika gratis). Vortex godt. Tilføj et transfektionsreagens og vortexes. Transfektionsreagenser, der giver optimal effektivitet er celletype afhængige og kan kræve forudgående testning.
- For eksempel anvender 2,5 pi 1 mg / ml polyethylenimin (PEI) og inkuberes DNA / PEI blandes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj transfektionsblandingen i dråber til cellerne og bland ved forsigtigt at ryste brøndplade med hånden. Tilsættes 100 pi af blandingen i en brønd på ~ 9,6 cm2. Brug 10 pi transfektionsblandingen for individuelle imaging kamre til forbigående transficerede celler.
Bemærk: Efter 24-48 timer, vil celler udtrykker galdesyre sensor og kan anvendes til eksperimenter.
2. stabil transfektion
- Harvest celler fra en 80% sammenflydende 25 cm 2-kolbe. Fortynd pellet i komplet dyrkningsmedium der er egnet til den specifikke cellelinie (10% føtalt bovint Serum, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7 celler) til en koncentration på 150.000 celler pr ml og tilsættes omkring 300.000 celler per brønd i en 6-brønds dyrkningsplade (2 ml slutvolumen).
- Tillad celler at vedhæfte i 24 timer.
- Forbered transfektion mix i et sterilt rør ved at tilsætte 0,5 ug CytoBAS eller NucleoBAS DNA (se venligst Materialer tabel) til 100 pi dyrkningsmedium (serum / antibiotika gratis). Vortex godt. Tilføj et transfektionsreagens og vortexes.
- For eksempel anvender 2,5 pi 1 mg / ml polyethylenimin (PEI) og inkuberes DNA / PEI blandes i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsættes 100 pi af transfektionsblandingen i dråber til cellerne og bland ved forsigtigt at ryste brøndplade med hånden. Omfatter altid en utransficerede kontrol, når du opretter en stabil cellelinie.
- Grow celler O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
- Trypsinisér celler ifølge producentens protokol (Cellerne inkuberes ved 37 ° C wed 1,5 ml forvarmet trypsin pr 25 cm 2 cellekultur) og spin dem ned ved 250 xg ved stuetemperatur i 5 min. Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 13 ml komplet dyrkningsmedium. Opdel celler over forskellige 10 cm i diameter dyrkningsskåle: 0,5 ml (lav densitet), 1,5 ml (medium density) og 4,5 ml (High Density). Gør det samme for de resterende 6,5 ml.
- Tilføj dyrkningsmedium til et slutvolumen på 10 ml. For U2OS celler, skal du bruge 800 pg / ml G418 til plasmider med neomycinresistens- kassette såsom CytoBAS og NucleoBAS konstruerer for at vælge for positive celler. This koncentrationer er celletype afhængig og kan bestemmes ved at vælge den laveste antibiotikum (G418) koncentration, hvor transficerede celler døde inden for 2 til 10 dage (800 ug / ml G418 for U2OS celler).
- Opdater dyrkningsmediet med det passende antibiotikum (G418) hver 72 timer, indtil utransficerede celler er døde.
- Undersøg dyrkningsplade under mikroskop med en 20X mål forpositive kolonier (fluorescens kan overvåges ved hjælp af de fleste filtersæt anvendes til grøn, cyan eller gul fluorescens).
- Markere de positive kolonier, der ligger isoleret fra andre kolonier med en pen på ydersiden bunden af dyrkningsskålen.
- Vask pladen to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og indsuge det. Tage omkring 15 sterile kloning cylindre og dyp dem i steril silikone. Anvend dem rundt de udvalgte kolonier ved at trykke let mod petriskål og sørg for, at der ikke mere end en koloni er inkluderet i kloning ringen.
- Pipetter 20 pi foropvarmede trypsin (1x, 0,25%) i kloning cylinder og inkuberes ved 37 ° C, indtil de fleste af cellerne er afrundet (observere med et mikroskop).
- Tilsæt 150 pi kulturmedium med serum og passende antibiotikum (10% FBS og 800 ug / ml G418 for U2OS og Huh7 celler) i kloning cylinderen og pipetteres op og ned flere gange for at resuspendere cellerne og overføres til en 96-brønds plade. Opdater medium efter 4-24 timer og tillade celler til at vokse sammenflydende i de næste par dage (37 ° C, 5% CO2 i U2OS og Huh7 celler).
- Opdatere medium med antibiotikum hver 3 eller 4 dage. Når cellerne er vokset konfluerende, overføre dem til en større brønds plade. Gentag dette trin, indtil kulturen er stor nok til eksperimenter. Kryopræservere nogle hætteglas til backup. Kryopræservering medium består af 20% FBS og 20% DMSO i medier (DMEM) uden tillæg.
Bemærk: Nu er cellelinien monoklonale og være stabilt til ekspression af Bile Acid Sensor. Halvdelen af koncentrationen af antibiotikummet G418 (400 ug / ml) er nu tilstrækkelig til at opretholde ekspression i stabil cellelinie.
3. Lentiviral Transduktion
Bemærk: Nogle cellelinier anses for vanskelige at transficere ved mere traditionelle fremgangsmåder, såsom polyethylenimin (PEI) metode. Viral transduktion af celler er et effektivt alternativ værktøj feller gen-levering og stabil transgenekspression.
- Harvest celler fra en 80% sammenflydende 25 cm 2-kolbe. Fortynd celler i komplet dyrkningsmedium der er egnet til den specifikke cellelinie (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7 celler) og tilsæt omkring 200.000 brønd i en 6-brønds dyrkningsplade.
- Tilføj dyrkningsmedium til et slutvolumen på 2 ml per brønd. Tillad celler at vedhæfte i 24 timer.
- Udfør virale transduktioner ved at inkubere cellerne i 4-6 timer med 500 pi CytoBAS lentivirus medium (kan rekvireres) fyldes op til et samlet beløb på 1 ml med komplet dyrkningsmedium indeholdende 10 ug / ml diethylaminoethyl (DEAE) -dextran eller en anden lentivirale transduktion forstærker. Glem ikke at inkludere et godt med utransducerede kontrol celler.
- Fjern mediet, og der tilsættes 2 ml komplet dyrkningsmedium indeholdende det ønskede antibiotikum (500 ug / ml hygromycin). Brug en lentiviral konstruktion til CytoBAS transduktion, der givers hygromycin resistens over for celler. Grow celler under ønskede betingelser.
- Opdater medium med (500 pg / ml hygromycin) antibiotikum hver 3 dage, og opdele celler, når 80% sammenflydende, indtil alle negative kontrol celler er døde (tager ca. 1-2 uger for de fleste cellelinjer). Cellelinien er nu at være stabilt til ekspression af Bile Acid Sensor.
- Alternativt kan du bruge celler til eksperimenter 1-3 dage efter viral transduktion. Som levende virus kan være til stede, kræver dette FRET-udlæsning udstyr i rum med et passende sikkerhedsniveau.
- Alternativt til hurtig isolering af stabile cellelinier, udføre fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
- Harvest celler fra et konfluent 160 cm2 kolbe.
- Fortynd celler i Leibovitz dyrkningsmedium (L-15-medium) med <5% serum til en koncentration på højst 5 x 10 6 celler pr ml
- Til opsamling af sorterede celler, fylde FACS rør med 1 ml indsamlingen medium (L-15-medium + 1,5% pen / strep, 1% L-overflod og 20% serum).
- Sorter celler for citrin (520-580 nm) eller Cerulean (450-520 nm), ophidset med 405 laser.
- Efter sortering ca. 500.000 celler, spin ned celler (5 min, 250 x g) og resuspender dem i 5 ml normal komplet dyrkningsmedium (10% FBS, 250 pg / ml hygromycin for U2OS og Huh7 CytoBAS celler) og pladen dem i en T25 kultur kolbe. Grow celler under ønskede betingelser (37 ° C, 5% CO2 i U2OS og Huh7 celler).
4. Levende Cell Imaging af Bile Acid Sensor
Bemærk: Celler indeholdende galdesyre transportører kan dyrkes i medium med 1-10% trækul-filtreret serum, der fjerner lipofile forbindelser. Normalt serum indeholder ofte galdesyrer, der kan føre til intracellulær galdesyre ophobning og mætning af Bile Acid Sensor.
- FRET målinger ved hjælp af konfokalt mikroskop
- Plate cellerne stabilt eller transiently udtrykker sensoren ved den ønskede densitet i en steril 8 og dækglas bund kammer slide (0,8 cm2). Grow celler i komplet dyrkningsmedium (ved hjælp af kul-filtreret serum), således at på dagen for eksperimentet, konfluens omkring 60-70%.
- Vask adhærente celler i kammeret slide gang med 200 pi 1x PBS eller Leibovitz L-15 dyrkningsmedium.
- Aspirer og erstat med 300 pi Leibovitz L-15 dyrkningsmedium så ingen CO2-kontrol er nødvendig.
Bemærk: DMEM uden phenolrødt kan anvendes som godt, men kræver CO 2 bufrede betingelser. De galdesyre sensor viser (nogle) pH-følsomhed så til formål at holde pH konstant under dataindsamling. - Fortynd forbindelserne, der skal anvendes i det konfokale afbildningseksperiment også i L-15 dyrkningsmedium. Tage hensyn til, under billedbehandling, har hvormed relativt store mængder væske i kamrene for at sikre hurtig blanding af prøven (50-100 pi),så gør 3-5x løsninger.
- Start imaging software af en konfokal mikroskop med et 37 ° C inkubation kammer og tænd den violette 405 nm laser. Sætte en dråbe immersionsolie på objektive og placere 8-kammer oven på den. For enkelt celle billeddannelse af FRET bruge 63X målet olie. Sensoren er blevet anvendt med succes ved stuetemperatur, men celleadfærden vil blive ændret.
- Indstil indstillingerne for konfokalt mikroskop korrekt.
- Set Erhvervelse mode: XYT (time-lapse billeddannelse af enkelt fokalplan).
- Anskaf billeder på 20 sek intervaller for at tillade forbindelser der skal tilføjes mellem opkøb uden pause eksperimentet.
- Sæt spektralområde til påvisning emission: Cerulean: 450-520 nm; Citrin: 520-580 nm.
- Fokus på enkelt celle lag ved hjælp gennemlysning lys. Start billedbehandling og justere z-positionen mere præcist. Juster gain og offset for hver kanal til at skelne signalet fra baggrunden, mens forblivering godt under mætning for alle pixels i celler af interesse.
- Tegn cirkler for at definere området af interesse (ROI). Vælg celler, der viser lignende fluorescens intensitet. Undgå celler, der naturligvis er forskellige fra den gennemsnitlige celle i størrelse og form. Udsættes cellerne for lys i en tid, så kort som muligt for at minimere fotoblegning af sensoren. Det er tilrådeligt at drage ROI'er ikke meget tæt til cellen omkreds. Dette område er mest følsomme over for ændringer i fluorescensintensitet som følge af fokal drift (celler bevæger sig i z-retningen), hvilket gør det vanskeligere at overvåge ændringer i fluorescensforholdet under forsøget.
- Start målinger med konfokalt mikroskop. Vent til Cerulean og citrin fluorescens er stabil.
- Tilføj 50-100 pi galdesyrer eller andre forbindelser på udvalgte tidspunkter under måling. Den relativt høje mængder væske (en femtedel til en tredjedel af det endelige volumen) er nødvendigt at blande væskerne godt (inden for 10 sek) uden at ryste / pipetting op og ned. Sørg for ikke at røre ved kanten af 8-brønd kammer med pipettespidsen og tilsæt væsken langsomt, således at cellerne ikke komme ud af fokus. Må ikke tilføje nye forbindelser, før plateaufasen er nået. Det tager ca. 200 sek.
- Afslut hvert forsøg med tilsætning af 100 pi GW4064, slutkoncentration 5-10 uM (sensor mættende dosis) og vente, indtil sensoren fluorescens er stabil.
- Gem eksperimentet og eksportere dataene som en .AVI fil.
- Åbn i ImageJ både AVI-filer (kanal 00, Cerulean, kanal 01, citrin) ved at vælge Plugins> Stakke> Stack interleaver. Alternativt, import konfokal fil (f.eks .lsm eller .lif filer) direkte i Image J ved anvendelse af passende plugins (findes på http://www.openmicroscopy.org), og flytte til trin 4.1.14.
- For Stack 1: Brug kanal 01 (citrin).
- For Stack 2: Brug kanal 00 (Cerulean).
- Klik på Rediger> Valg> Tilføjtil manager, for at åbne ROI Manager-vinduet. Kontroller afkrydsningsfeltet 'Vis Alle'.
- Tegn et par områder af interesse (ROI'er), der dækker specifikke celler med den ovale markeringsværktøj. Også trække en cirkel i et område uden celler eller inde i en celle, der ikke udtrykker sensoren at bestemme baggrundssignalet. Det er tilrådeligt at tegne ROI'er ikke meget tæt til cellen omkreds i forsøg, hvor ændringer i fluorescensintensitet skyldes fokale drift (celler bevæger sig i z-retningen) eller celle migration var indlysende.
- Vælg en celle. Klik på Plugins> Ratio Profiler. Dette vil resultere i 3 skærme: RAW, ratio og Ratio_Profile. RAW vindue viser stigningen i intensiteten af citrin (blå linje) og et fald i Cerulean (rød linje), hvis der er FRET. Den Ratio vindue giver oplysninger om forholdet citrin / Cerulean, hvilket vil øge med en stigning i FRET. Den Ratio_Profile vindue giver det faktiske antal af fluorescensintensiteten målt i begge kanaler. Hvis mikroerklare setup-specifikke filer (f.eks .lsm eller .lif stedet for .avi) filer bruges kanalen ordre kan være omvendt.
- Kopier data fra Ratio_Profile vindue i regnearket vedlagt som supplerende data. Gør det samme for alle de andre celler (og baggrund ROI).
Bemærk: I online regneark, alle data er normaliseret til den tilstand, hvor der forventes størst mulig BAS aktivering. Eftersom GW4064 er den mest potente aktivator af FXR, er fluorescensforholdet efter inkubation med et overskud på GW4064 sat til 1. Det er derfor vigtigt at afslutte alle forsøgene med tilsætning af GW4064. Fordelen ved dette er, at dataene ikke længere er afhængig af laser intensitet eller detektorforstærkningen og eksperimenter på forskellige dage kan sammenlignes lettere. Desuden er det i nederste graf i regnearket, et løbende gennemsnit kan anvendes til at udjævne kurverne for eksperimentel støj. Du skal dog ikke bruge denne graf, når man analyserer kinetiske data, da den kørende AveraGE vil også glatte hurtige kinetiske reaktioner.
- FRET målinger ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
- Fortynd alle forbindelser til FACS eksperiment i sterile FACS optagelsesbuffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN3 og 10 mM D-glucose).
- Harvest celler fra en 80% sammenflydende T-160 cm2 cellekultur kolbe under anvendelse af 5 mM EDTA i PBS. Centrifuger cellerne ved 250 x g i 5 min. Vask cellepelleten 2x i 5 ml FACS optagelsesbuffer ved stuetemperatur.
- Tæl celler ved hjælp skæret counter eller en optælling kammer.
- Fortynd pellet i FACS optagelsesbuffer til en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Pipettere op og ned for at skabe en homogen suspension af enkeltceller. Hvis celler er vanskelige at disaggregere, sætte prøverne gennem en celle si før sorteringen at minimere dyse træsko.
- Pipet 200 celler pi pr FACS rør og beskytte dem mod lys.
- Tilføj den ønskede koncentration af forbindelsen (f.eks, Galdesyrer, syntetiske FXR ligander, transporter hæmmere). Vortex. Inkuber i 20-30 minutter ved stuetemperatur under omrystning (i mørke).
- I mellemtiden, starte FACS (lasere har brug for tid til at varme op).
- Indstil flowcytometri gating parametre for eksperimentet (se figur 3):
- Load omkring 100.000-200.000 NucleoBAS eller CytoBAS transfekterede celler til at bestemme portene.
- Først justere FSC og SSC spændinger til at plotte cellerne i midten af plottet.
- Ved hjælp af violet laser, juster Cerulean (450/40 nm) spændingsværdi og citrin (525/20 nm) spænding og sikre, at alle NucleoBAS eller CytoBAS positive celler er plottet inden scatter plot.
- Indstil de korrekte porte (Gate P1 op til Gate P4), se figur 4.
- Brug porten P1 til at udelukke døde celler, normalt vises i nederste venstre hjørne ved at vælge den største befolkning i midten af VSK-A / FSC-Et plot.
- Brug porten P2 iFSC-H / FSC-Et vindue til at fjerne duplets fra analysen. Enkelte celler er præsenteret i en mere diagonal linje end dubletter.
- Gate P3 i citrin (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) vinduet kan bruges til at vælge til NucleoBAS / CytoBAS positive celler, ved gating citrin og Cerulean høje celler, vises en befolkning diagonalt i øverste højre hjørne af handlingen.
- Tegn porten P4 øverst til venstre i befolkningen, så tæt som muligt, og sørg for, at der ikke mere end 5% af cellerne falder inden denne port.
- Indlæse nogle utransfekterede celler (ingen udtryk for CytoBAS eller NucleoBAS) at bestemme auto-fluorescens. Den utransfekterede befolkning må ikke være placeret i porten P3. Juster porten P3 når det er nødvendigt at udelukke auto-fluorescerende celler.
- Vortex prøverne før anbringe rørene i FACS. For hver prøve måles mindst 10.000 celler i porten P3.
Bemærk: Den Befolkning Hierarki vindue angiver antallet af hændelservises for hver port og% af det oprindelige gate. I gate 4, i% af den forælder hedder celler med en øget citrin / Cerulean-forholdet som en procentdel af alle NucleoBAS positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET-BAS sensor præsenteret er baseret på ligandbindingsdomænet af FXR (LBD-FXR) fastgjort til to fluorophorer citrin og Cerulean) og en LXXLL motiv. Denne sensor giver undersøgelser galdesyretransport i levende celler med høj rumlig og tidsmæssig opløsning (Figur 1 A). Mutationer i cerulean og citrin blev anvendt til at fremme dannelsen af den intramolekylære kompleks (figur 1 B). Galdesyrer og andre FXR ligander binder til FXR og derved at ændre afstanden mellem citrin og cerulean af en konformationsændring. I levende pattedyrceller, resulterer dette i en øget effektivitet FRET (citrine stigning, cerulean fald) (Figur 1 C, 1 D). Under en levende celle kvantitativ intensitet-baserede FRET eksperimentere med det konfokale mikroskop, jegt blev observeret, at taurochenodeoxycholic syre (TCDCA) -behandlede (30 uM) U2OS celler, der udtrykker NucleoBAS mangler galde syre transportører viser ikke nogen ændringer i FRET, mens den gennemsnitlige citrin / Cerulean steg markant efter behandling med GW4064 (5 uM) (Figur 1 C). I modsætning hertil U2OS celler co-udtrykkende NucleoBAS, Ntcp og OSTαβ viste en klar stigning i citrin / cerulean forhold ved tilsætning af TCDCA, og en endnu større stigning i forholdet efter tilsætning af GW4064 (figur 1 D). Dette viser, at TCDCA er i stand til at passere gennem cellemembranen og kræver særlige transportører til ind i cellen.
Cellulær lokalisering af sensoren bestemmes af tilstedeværelsen af specifikke lokaliseringssignaler. NucleoBAS er målrettet mod kernen af kernelokaliseringssignalet (fig <strong> 2 B), mens CytoBAS ikke indeholder nogen lokaliseringssignal, og derfor forbliver i cytosolen (figur 2 A). Biosensoren kan også kombineres med billeddannelse af andre fluorescerende proteiner, der gør det muligt målinger af proteinekspression / lokalisering og FXR aktivering i den samme celle. For eksempel, figur 2 C viser U2OS celler co-transficeret med NucleoBAS og Ntcp-mKate2. Derudover kan sensoren også kombineres med andre sensorer til subcellulær billeddannelse af mere end én parameter samtidigt. For eksempel blev NucleoBAS udtrykt sammen med TGR5 (EST-klon IMAGE # 5.221.127) og en cAMP cytosolisk sensor (T Epac VV) 11 til måling TGR5 og FXR aktivering i den samme celle på samme tid. Ved TGR5 binding, cAMP-niveauer steg i cytosolen, som blev registreret af cAMP sensor, mens FXR aktivering i kernen var overualized samtidigt. figur 2D-F viser en tidsserie bestående af 6 konfokale billeder af NucleoBAS-TGR5- T EPAC vv celler efter behandling med GW4064 (5 uM) (Figur 2 D), med TCDCA (10 uM) (figur 2 E) eller med chenodeoxycholinsyre (CDCA) (10 uM) (Figur 2 F) ved t = 0. Den grønne farve repræsenterer områder, hvor emission forholdet 525/450 nm faldet (der repræsenterer cAMP elevation), og den lyserøde farve repræsenterer en stigning i emission ratio (FXR aktivering), i forhold til forholdene ved starten af forsøget.
Desuden flowcytometri kan anvendes til at screene en pool af celler på enkelt celle niveau eller som high-throughput screening på hele befolkningen. U2OS celler, der udtrykker NucleoBAS var Excited med en violet 405 nm laser, og fluorescens blev opsamlet i 450/40 interval for Cerulean og 525/20 interval for citrin. For at forbedre effektiviteten af FACS-baserede FRET forsøg, skal rette porte indstilles (figur 3). P1 gate udelukker cellerester og P2 gate fjerner duplets fra analysen. Dernæst er analysen begrænset til citrin (ophidset med 488 laser) og Cerulean (ophidset med 405 laser) positive celler ved gaten 3. Endelig gate P4 repræsenterer procentdelen af celler med et højt citrin / Cerulean emission forholdet (ved hjælp af excitation af Cerulean med 405 nm laser). For hver prøve blev mindst 10.000 celler, der faldt inden for porten 3 målt.
Efterfølgende blev FACS-baserede FRET flowcytometri anvendes til at beregne en stigning i FRET i levende celler efter 30 minutters inkubering med TCDCA og GW4064. Ikke-behandlede U2OS celler, der udtrykker NucleoBAS viste <5% celler i porten P4 (citrin / cerulean høje celler). I mangel af galde syre transportører blev en lignende procentdel observeret i 30 uM TCDCA behandlede celler (figur 4 A). I modsætning hertil celle co-udtrykker NucleoBAS, Ntcp og OSTαβ viste ganske vist en forøget mængde af citrin / cerulean høje celler på ca. 38%. Efter tilsætning af 10 uM GW4064, næsten 90% af cellerne var citrin / cerulean høj uanset ekspression af OSTαβ eller Ntcp (figur 4 B). Data kan præsenteres i søjlediagrammer (% celler i gate 4, population 4) (Figur 4 C, D) eller som befolkningsgrupper histogrammer af citrine-cerulean forhold (figur 4 E, F).
Figur 1. Design af galde Acid Sensor (BAS). (A) Strukturel repræsentation af virkemåde af en genetisk kodet Bile Acid Sensor. Den består af en donorfluorophor (cerulean) og en acceptor fluorophor (citrin) bundet via FXR-LBD og fusioneret til et FXR-cofaktor peptid (LXXLL motivet). (B) Skematisk domæne arkitektur af BAS. De Q204F / V224L fluoroforen mutationer fremme dannelsen af intramolekylære interaktioner mellem Cerulean og citrin. Den NucleoBAS konstruktionen indeholder et C-terminalt kernelokaliseringssignal (NLS), og derfor akkumuleres i kernen, mens CytoBAS konstrukt mangler enhver sekvens målrettet og dermed viser cytosolisk lokalisering. (C) Repræsentant konfokal-baserede FRET eksperimentere med BAS som et værktøj til at overvåge konjugeret galdesyretransport. Observeres ingen ændring i citrin / Cerulean forhold efter den 30. pM TCDCA tilføjelse i celler kun expressing NucleoBAS. Når 5 pM GW4064 var tilsat, blev en stærkt forøget citrin / Cerulean forhold overholdes. (D) Import af TCDCA (30 uM) resulterer i en betydelig aktivering af sensoren i Ntcp og OSTαβ co-transficerede celler. Efterfølgende GW4064 (5 uM) behandling fører til en yderligere stigning i citrin / Cerulean forhold. Resultaterne er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse, n = 6 individuelle celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Lokalisering FRET-BAS konstruktion i levende celler. Konfokalt mikroskop billeder af U2OS celler transficeret med CytoBAS (A) eller NucleoBAS (B). (C) U2OS celler co-transfected med NucleoBAS og Ntcp-mKate2. Skalaen søjle repræsenterer 10 um. (D - F) Tidsserier af NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV transfekterede celler. (D) GW4064 aktiverer FXR (øget 525/450 nm ratio), men ikke TGR5. (E) TCDCA aktiverer TGR5 på plasmamembranen (nedsat 525/450 nm forhold), men er ikke i stand til at komme ind i cellen for at aktivere FXR i kernen. (F) CDCA aktiverer TGR5 på plasmamembranen samt FXR i kernen (øget 525/450 nm-forholdet i kernen, faldt i cytoplasmaet). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flowcytometri gating parameters. (A) P 1 gate i SSC-A / FSC-Et vindue bruges til at udelukke de døde celler. (B) I FSC-H / FSC-Et vindue er P2 porten trukket at fjerne dublet begivenheder fra analysen. (C) I citrin (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) vindue, NucleoBAS (og CytoBAS) positive celler er valgt (Gate P3). (D) Endelig i citrin (525/20 nm) / Cerulean (450/40 nm) vinduet, P4 porten indeholder citrin / Cerulean-høje celler i FACS eksperimentet. Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 4. Repræsentant FACS eksperiment måling galdesyretransport hjælp NucleoBAS. (A >, B) FACS-plots viser mængden af citrin / cerulean høje levende NucleoBAS-udtrykkende U2OS celler (A) og U2OS celler co-udtrykkende NucleoBAS, OSTαβ og Ntcp (B) efter behandling med kontrol puffer (til venstre), 30 uM TCDCA (i midten) eller 10 pM GW4064 (til højre). (C, D) søjlediagram, der viser procentdelen af citrin / Cerulean-high celler efter 30 minutters inkubation med TCDCA eller GW4064 i U2OS celler, der udtrykker NucleoBAS og co-transficeret med (D) eller uden (C) OSTαβ og Ntcp. (E, F) Histogram viser fordelingen af citrin / cerulean forhold i en population af celler, der udtrykker U2OS NucleoBAS med eller uden OSTαβ og Ntcp efter 30 minutters inkubation med TCDCA (gul), GW4064 (rød) eller kontrol-buffer (blå). Alle betingelser blev målt tre gange. Søjler repræsenterer middelværdier + standardafvigelse (SD) (n = 3).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Fil 1:. Skabelon BAS generel Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Fil 2:. Skabelon BAS Zeiss Leica importerede data Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi en detaljeret protokol for anvendelse af en hidtil ukendt genetisk kodet galdesyre sensor stand til at overvåge de spatiotemporale dynamik galdesyretransport i levende celler. Denne biosensor består af Cerulean og citrin fluorescerende proteiner, der er fusioneret til FXR-LBD, hvorved der dannes en FRET-baseret galdesyre sensor (BAS).
Galden Acid Sensor er forholdsvis enkel og praktisk i brug, når der har grundlæggende erfaring med celledyrkning og FACS eller (konfokal) mikroskopi. Dog kan nogle aspekter kræve nogle fejlfinding. Ved brug af galdesyre sensor i kombination med galdesyrebindende transportører, anbefales det at dyrke celler i medium med kul-filtreret serum. Kul reducerer yderligere galdesyrer niveauer ved adsorption fra serummet. Især i nærvær af importører såsom Ntcp Dette er afgørende for at undgå mætning af sensoren under dyrkning, eftersom det er den mest almindelige årsag til en ufølsom sensorved forsøg. Derfor er et andet sensor blev skabt (NucleoBAS N354K / I372V) indeholdende mutationer ændrer følsomheden for galdesyrer, hvilket skaber et større dynamikområde 8. At definere, om sensoren allerede er mættet, kan citrin / Cerulean forhold sammenlignes med forholdet i kontrol celler, der ikke udtrykker nogen galde syre transportører, da disse celler antages at have lave intracellulære galde syre niveauer. Alternativt kan fluorescens-levetid imaging mikroskopi (FLIM) målinger udført for at undersøge FRET i en intensitet-uafhængig måde 12. Denne teknik er uden for rammerne af dette papir, og kræver mere specialiseret udstyr. Andre årsager til en ufølsom sensor indbefatter anvendelse af celler, som er autofluorescente og / eller har mistet NucleoBAS ekspression. Af note, kan udsving i intensitet cerulean og citrin (for eksempel som følge af fokale forskydninger) i løbet af eksperimentet skjule direkte visualisering af FRET ændringer under billedbehandling, mensDen ratiometriske karakter sensoren stadig giver mulighed for overvågning af galdesyrebindende dynamik. Ofte absolutte intensitet ændringer er beskedne for de enkelte fluoroforer ved tilsætning af FXR ligander, mens stigningen i forholdet er indlysende.
For FRET-analyse i celler transficeret med BAS sensor, skal vælges passende laserlys og filtre. Stigningen i citrin intensitet under FRET skal måles med violette diode (405 nm) laser med emissioner overvåges i løbet af 450-520 (Cerulean) og 520-580 (citrin). Et vigtigt aspekt at tage i betragtning, er følsomheden af sensoren til fotoblegning. Når intensiteten af den ene eller begge fluorophorer langsomt fald i tid uden tilsætning af ligander, er det ofte viser fotoblegning. Dette fænomen primært opstår, når lasereffekten er for høj. For at undgå denne uønskede effekt, bør lasere magt ikke overstige 5% af den fulde effekt, og cellerne skal holdes i mørke så meget som muligt. Begrænstid til at søge efter de rigtige celler. Udsving i fluorescensintensitet kan også være forårsaget af fokal drift i z-aksen. For at modvirke dette kan pinhole størrelse øges, og det er tilrådeligt at trække ROI'er ikke meget tæt til cellen omkreds.
FRET sensor til galdesyrer er blevet testet i flere celletyper (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK og HEK293T celler), der kan transficeres, og som har en stabil fænotype. Er imidlertid vanskelige at transficere og opretholde stabile med hensyn til kendetegn primære og differentierede celler, såsom hepatocytter. Viral transduktion kan hjælpe med vanskelige at transficere celler (konstruere efter anmodning). Vi er i øjeblikket genererer en mus linje for at tillade brugen af sensoren i frisk isolerede primære celler, der hurtigt dedifferentiere ved isolation.
For at udføre det konfokale beskrevne eksperiment, er det bydende nødvendigt, at den valgte cellelinie er klæbende til en dyrkningsskål og vokser i en single cellelag. Celler, der vokser i suspension eller adhærente celler, som kan trypsiniseret temmelig let, kan også måles imidlertid ved hjælp af FACS. Endelig anbefales det at vælge en cellelinie uden endogen galdesyretransport eller syntese, når man analyserer en specifik transportvej. Dvs. når måling af aktiviteten af visse transficerede (mutant) transportproteiner.
De præsenterede genetisk kodet fluorescerende biosensor BAS er et værdifuldt redskab til overvågning af enkelt levende celle galdesyretransport. BAS indeholder en FXR-LBD, som aktiveres af en lang række af galdesyrer, så billeddannelse af subcellulære dynamik galdesyrer 8. Dette giver en stor fordel i forhold til anvendelsen af andre teknikker. For eksempel, i promotordreven luciferase reporter assays luciferasesignal er afhængig af stabiliteten af reporteren i celler, der ikke understøtter subcellulær oplysninger, og kræver destruktion af prøven
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
