Introduction
포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 광범위하게 높은 공간적 해상도를 1로 살아있는 세포에서 세포 기능의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용된다. FRET에서, 여기에서, 도너 형광 에너지 수용체 형광 단에 전송된다. FRET 효율은 도너와 억 셉터 형광체와 그 방향들 사이의 거리에 따라 크게 좌우되며, 따라서 두 형광체에 영향을 구조적 변화에 민감한 판독이다. 이 현상은 작은 분자 이미징 FRET 기반 바이오 센서를 생성하기 위해 이용된다. 증가 / 도너 형광 대 2 수용체의 발광 강도의 비율이 감소함에 따라 자신의 농도 변화를 모니터 할 수있다. 예를 들어, FRET 기반 칼슘 바이오 센서는 세포 3 생활에 유리 칼슘 농도를 빠르고 안정적으로 검출 할 수 있습니다. FRET 기반 바이오 센서의 다른 장점은 하나의 살아있는 세포에서 촬상되어, t상속인 이외의 침입은, 자신의 능력이 서로 다른 종류의 세포 및 세포 구획 4를 대상으로한다.
세포 내 담즙산 역학의 여러 측면은 여전히 저조한 이해된다. 예를 들어, 거의 공액 및 비공 액 담즙산 수송 하부 규제기구에 대해 공지되어있다. 기술이 존재하는 트랜스 포트 주로 기반 루시페라아제 리포터, 방사성 표지 된 담즙산 또는 형광 담즙산 유사체의 사용을 모니터링한다. 후자는 아마도 자신의 특성에 영향을 미치는 담즙산의 수정을 필요로한다. 루시 페라 기반 기자는 가난한 시간 해상도를 가지고있다. 또한,이 기술은 시료의 손실이 발생할 및 단일 세포 이미징을위한 적용되지 않습니다. 따라서,이 비율 적 검출 5, 6의 장점을 포함하고, 특히 이후 FRET 바이오 센서를 이용하여 전송 활동의 실시간 단일 세포 이미징을 허용 방법을 사용하는 것이 유익 할 것이다. 반면 CF의 변형P / YFP 형태는 가장 자주 FRET 쌍, 적색 편이 담즙산 센서 (7)을 포함한 새로운 센서와 FRET 도구 상자의 확장을 주도 자기 협회 유발 돌연변이를 들고 mOrange 및 mCherry를 사용하여 새로운 전략을 사용했다.
우리는 이전에 farnesoid X 수용체 (FXR) 리간드 결합 도메인과 융합 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정)로 구성된 유전자 인코딩 FRET 담즙산 센서 (BAS)을 생성 (FXR-LBD) 및 펩티드 LXXLL 모티브 (8)를 포함. 담즙산 의존적으로 FXR-LBD이 펩티드 어소. FXR 활성화되면, 황수정과 하늘색 사이의 거리가 구조적 변화로 인해 변경됩니다. 포유 동물 세포주에서, 황 / 세룰 리안 비율 명확히 검출 가능한 증가 FXR 활성화 결과, 정제 된 센서는 반대 방향으로 작동하고 FXR 활성화시 FRET 비율 감소에 이르게한다. 이 센서 (CytoBAS)세포질 담즙산 역학의 모니터링을 할 수 있습니다. 세포 내 표적 모티프의 카복실 말단을 첨가하여, BAS 구조체는 다른 세포 구획에서 담즙산 농도의 측정을 허용하는, 핵 (NucleoBAS) 및 퍼 옥시 솜 (PeroxiBAS)을 타겟으로 할 수있다. 퍼 옥시 솜 타겟팅 모티브의 추가가 담즙산에의 대응 성을 손상하지 않지만, 세포 투과성 FXR - 리간드는이 퍼 옥시 솜 (8) 내부 PeroxiBAS의 변화를 FRET 유도하지 않았다. 이 차이의 특성을 알 수있는 바와 같이, 프로토콜은 다음과 CytoBAS NucleoBAS에 집중된다.
이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서의 사용은 최근 간 담즙산 수송 + / 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드 (NTCP) 나 유기 용질 수송 알파 / 베타 (OSTαβ)를 8 함유 세포에서 증명되었다. NTCP는 주 간 담즙산 수입하고 OSTαβ는 기저 장 담즙입니다전기 담즙산 농도 구배 (9), (10)에 따라 수입과 수출 모두 작동 할 수 있습니다 산 수송. 최근의 데이터는 NTCP 및 / 또는 OSTαβ 의한 담즙산 수송시 리간드 FXR-LBD 상호 작용의 결과로서 FRET 비율 견고하고 빠른 응답이 관찰 될 수 있다는 것을 보여 주었다.
여기, 우리는 이러한 공 초점 현미경 분석 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)와 같은 FRET을 측정하는 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명하는 중요한 단계를 강조, 잠재적 인 문제를 해결하고 다른 방법에 대해 설명합니다. 이 유 전적으로 인코딩 된 FRET 센서를 이용하여, FXR-LBD와 담즙산 상호 작용은 정량 및 살아있는 세포에 직접 모니터링하고 실시간으로 담즙산 수송 및 역학을 가시화 신속하고 간단한 방법을 제공 할 수있다. CytoBAS NucleoBAS를 인코딩 및 포유류 발현 플라스미드는 시판되고있다. 따라서,이 바이오 센서는, 상기에 기여담즙산 수송 또는 FXR을 활성화하고 담즙산 생물학 및 시그널링에 대한 깊은 통찰력을 제공하는 화합물의 이해.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 과도 형질
참고 : CytoBAS과 NucleoBAS는 (재료 표 참조) 성공적으로 여러 세포 유형, (U2OS, Huh7, 인 HepG2, H69, MDCK 및 HEK293T 세포)에 사용된다. 센서를 사용하는 주된 요건은 그것이 세포를 입력하는 부호화 DNA를 필요로 표현 될 필요가 있다는 것이다.
- 80 %의 합류 25cm 2 플라스크에서 수확 세포. 특정 세포주 (10 % FBS, 1 % L- 글루타민, 1 % 펜 / U2OS 및 Huh7 세포 연쇄상 구균)에 적합한 완전 배지에서 세포를 희석.
- 멸균 8 잘 챔버 커버 유리 (0.8 cm 2)에 원하는 농도에서 플레이트 세포. 이는 필수적인 것은 아니지만, 합류 부 (컨 플루를 60 내지 80 %의 밀집 상태) 실험 당일 세포의 층 조준.
- 물론 당 400 μL의 최종 볼륨에 전체 문화 매체를 추가합니다. 세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- NucleoBAS 0.5 μg의 첨가에 의해 멸균 된 튜브에서 형질 감염 혼합물을 제조또는 배양 배지 100 ㎕에 CytoBAS의 DNA (혈청 / 항생제 무료). 잘 소용돌이. 형질 전환 시약을 추가하고 텍싱하여 혼합한다. 최적의 효율성을 제공 형질 전환 시약은 세포 유형에 의존하고 사전 테스트를해야 할 수도 있습니다.
- 예를 들어, 1 ㎎ / ㎖의 폴리에틸렌 이민 (PEI), 2.5 μl를 사용하여 DNA / PEI는 RT에서 15 분 동안 혼합 배양한다.
- 세포에 물방울 형질 전환 혼합물을 추가하고 부드럽게 손으로 잘 판을 흔들어 섞는다. 9.6 cm 2 ~의 잘에 대한 혼합물의 100 μl를 추가합니다. 일시적으로 형질 감염된 세포에 대한 개별 영상 실에 대한 형질 전환 혼합물의 10 μl를 사용합니다.
참고 : 24 ~ 48 시간 후, 세포가 담즙산 센서를 표현하며 실험에 사용될 수있다.
2. 안정적인 형질
- 80 %의 합류 25cm 2 플라스크에서 수확 세포. 특정 세포주 (10 % 소 태아 S 적합한 완전 배지에서 희석 펠렛erum는, 1 % 용액 당 150,000 세포의 농도로 L- 글루타민, 1 % 펜 / U2OS 및 Huh7 세포 연쇄상 구균) 및 6 웰 배양 플레이트 (2 ㎖ 최종 부피)에서 웰 당 300,000 세포를 추가한다.
- 세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- CytoBAS 또는 NucleoBAS DNA 0.5 μg의를 추가하여 멸균 튜브에 형질 믹스를 준비 배지 100 ㎕ (혈청 / 항생제 무료)을 (자료 표를 참조하십시오). 잘 소용돌이. 형질 전환 시약을 추가하고 텍싱하여 혼합한다.
- 예를 들어, 1 ㎎ / ㎖의 폴리에틸렌 이민 (PEI), 2.5 μl를 사용하여 DNA / PEI는 RT에서 15 분 동안 혼합 배양한다.
- 세포 방울의 형질 전환 혼합물의 100 μL를 추가하고 부드럽게 손으로 잘 판을 흔들어 섞는다. 안정적인 세포주를 만들 때 항상 형질 감염되지 않은 컨트롤을 포함한다.
- 37 ℃에서 세포 O / N 성장, 5 % CO 2.
- 를 Trypsinize 전지는 제조 업체의 프로토콜에 따라 (37 ° C를 W에서 세포를 품어i 번째 1.5 ml를 25cm 2 세포 배양 당 트립신을 데워진)과 5 분 동안 실온에서 250 XG에 그들을 스핀 다운. 완전한 배지 13 ㎖에 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 다양한 직경 10cm 배양 접시 위에 세포를 나눈다 : 0.5 ㎖ (저밀도), 1.5 ㎖ (중 밀도), 및 4.5 ㎖ (고밀도). 6.5 ml의 나머지에 대해 동일한 작업을 수행합니다.
- 10 ㎖의 최종 부피로 배양 배지를 추가한다. U2OS 세포를 들어, CytoBAS로 네오 마이신 저항 카세트 플라스미드 800 μg의 / ㎖의 G418를 사용하고 NucleoBAS는 양성 세포에 대한 선택 구성한다. 이 농도는 세포 종류에 따라 다르며 형질 감염되지 않은 세포 2~10일 (U2OS 세포에 800 μg의 / ㎖의 G418) 이내에 사망 낮은 항생제 (G418) 농도를 선택함으로써 결정될 수있다.
- 형질 감염되지 않은 세포가 죽을 때까지 적절한 항생제 (G418)와 문화 매체마다 72 시간을 새로 고칩니다.
- 20X 목적을위한을 가진 현미경 문화 판을 검사긍정적 인 식민지 (형광 녹색, 청록색 또는 노란색 형광에 사용되는 대부분의 필터 세트를 사용하여 모니터링 할 수 있습니다.)
- 배양 접시의 외부 바닥에 펜으로 다른 식민지에서 고립 된 거짓말 긍정적 인 식민지를 표시합니다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 판을 세척하고 대기음. 약 15 무균 복제 실린더를 타고 멸균 실리콘으로 그들을 찍어. 페트리 접시에 가볍게 눌러 선택한 식민지 주위에 적용하지 개 이상의 식민지가 복제 링에 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 피펫 20 클로닝 실린더에 미리 예열 트립신 (1X, 0.25 %)의 μL와 반올림 한 세포의 대부분은 (현미경 관찰) 할 때까지 37 ℃에서 배양한다.
- 복제 실린더 (U2OS 및 Huh7 세포를 10 % FBS 800 μg의 / ㎖의 G418) 혈청과 적절한 항생제와 문화 매체의 150 μl를 추가 아래로 세포를 재현 탁하고 96에 전송하는 몇 번을 피펫과웰 플레이트. 4-24 시간 후 매체를 새로 고침하고 세포가 다음 몇 일 (37 ℃, U2OS 및 Huh7 세포에 대한 5 % CO 2)에 합류 성장을 할 수 있습니다.
- 매 3 사일 항생제 매체를 새로 고칩니다. 세포가 컨 플루 언트 성장하면, 더 큰 웰 플레이트로 전송. 문화가 실험에 충분히 큰 때까지이 단계를 반복합니다. 백업에 대한 몇 가지 튜브를 Cryopreserve. 냉동 보존 매체는 보충없이 미디어 (DMEM)에 20 % FBS와 20 % DMSO로 구성되어 있습니다.
참고 : 이제, 셀 라인은 단일 클론과 담즙 산성 센서를 표현 안정적인 것으로 간주됩니다. 항생제 G418 (400 μg의 / ㎖)의 절반 농도는 안정 세포주에서의 발현을 유지하는 현재 충분하다.
3. 렌티 바이러스 형질 도입
참고 : 일부 세포주는 이러한 폴리에틸렌 이민 (PEI) 방법으로 전통적인 방법으로 형질하기 어려운 것으로 간주됩니다. 세포의 바이러스 형질 도입 효율은 대체 공구 F이고또는 유전자 전달 및 안정적인 유전자 발현.
- 80 %의 합류 25cm 2 플라스크에서 수확 세포. 특정 세포주 (10 % FBS, 1 % L- 글루타민, 1 % 펜 / U2OS 및 Huh7 세포 연쇄상 구균) 용 완전 배지에서 세포가 적합한 희석하고, 6 웰 배양 플레이트에 웰 당 200,000 세포를 추가한다.
- 물론 당 2 ML의 최종 볼륨에 문화 매체를 추가합니다. 세포는 24 시간 동안 부착 할 수 있습니다.
- 500 μL의 CytoBAS는 렌티 바이러스 (요청시) 매체를 포함에 4 ~ 6 시간 동안 배양 세포에서 바이러스 transductions를 수행하여 10 μg의 / ㎖ 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) -dextran 또는 다른 렌티 바이러스를 포함하는 완전한 배지 1 ML의 총량에 가득 전달 증강. untransduced 대조군 세포에 잘 포함하는 것을 잊지 마십시오.
- 매체를 제거하고 원하는 항생제 (500 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신)를 포함하는 완전한 배지 2 ㎖를 추가합니다. 제공 CytoBAS 전달을위한 렌티 바이러스의 구조를 사용하여S는 세포에 하이 그로 마이신 내성. 원하는 조건에서 세포를 성장.
- 3 일마다 항생제 (500 μg의 / ㎖의 하이 그로 마이신)와 매체를 새로 고침 80 %의 합류는, 모든 음성 대조군 세포가 죽을 때까지 (대부분의 세포 라인에 대한 1-2 주 소요) 때 세포를 분리. 세포주는 이제 담즙산 센서를 표현 안정적인 것으로 간주된다.
- 또한, 1~3일 바이러스 성 전달 후 실험에 대한 세포를 사용합니다. 살아있는 바이러스가 존재할 수있는 바와 같이,이 적절한 안전 수준과 객실 무서워 - 판독 장비를 필요로한다.
- 대안 적으로, 안정한 세포주의 신속한 분리를 위해, 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 수행한다.
- 합류 160cm 2 플라스크에서 수확 세포.
- 용액 당 최대 5 × 106 세포의 농도로 <5 % 라이 보 비츠 혈청 배지에서 세포 (L-15 배지)을 희석
- 정렬 세포의 수집을 위해, 수집 매체의 1 ㎖ (L-1와 외과 튜브를 채우기배지 5 + 1.5 % 펜 / 패 혈성, 1 % L-GLUT 20 % 혈청).
- (405) 레이저와 흥분 황수정 (520-580 nm의) 또는 하늘색 (450-520 nm의)에 대한 정렬 세포.
- 약 50 만 셀을 정렬 한 후, 세포 (5 분, 250 XG)를 스핀 다운 및 5ml에 그들을 재현 탁 정상 완전한 배지 (10 % FBS, 250 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신 U2OS 및 Huh7 CytoBAS 세포)와 T25의 문화를 판 플라스크. 원하는 조건 (37 ° C U2OS 및 Huh7 세포, 5 % CO 2)에서 세포를 성장.
담즙 산성 센서 4. 라이브 세포 이미징
참고 : 담즙산 수송을 포함하는 세포는 친 유성 화합물을 제거 1~10% 숯 여과 혈청 배지에서 배양 할 수있다. 정상 혈청은 종종 담즙 산성 센서의 세포 내 담즙산 축적과 채도로 이어질 수 담즙 산을 포함하고 있습니다.
- 공 초점 현미경을 사용하여 FRET 측정
- 안정적으로 또는 transie 세포를 플레이트ntly 멸균 8 웰 바닥 커버 슬립 챔버 슬라이드에 원하는 농도로 발현하는 센서 (0.8 cm 2). 완전 배지에서 세포를 성장 (숯 여과 혈청을 사용하여) 그래서 실험 날에, 포화 상태는 약 60~70%이다.
- PBS 또는 라이 보 비츠의 L-15 배지 1 배 200 μL 한 번 챔버 슬라이드에 부착 된 세포를 씻으십시오.
- 더 이산화탄소 제어가 필요하지 않도록 기음과 300 μL 라이 보 비츠의 L-15 배지로 교체.
주 : 페놀 레드가없는 DMEM뿐만 아니라 사용하지만, CO 2 버퍼링 조건을 필요로 할 수 있습니다. 담즙산 센서 쇼 (일부) pH의 감도 그래서 데이터 수집 동안의 pH를 일정하게 유지하는 것을 목표로. - L-15 배지에도 촛점 이미징 실험에 사용되는 화합물을 희석한다. 이미징 동안, 챔버 내의 액체의 비교적 큰 양의 샘플 (50 내지 100 μL)의 신속한 혼합을 확보하기 위해 첨가 될 필요가 있음을 고려그래서 3 ~ 5 배 솔루션을합니다.
- 37 ° C 배양 챔버와 공 초점 현미경의 이미징 소프트웨어를 시작하고 보라색 405 nm의 레이저를 켭니다. 목표에 침지 기름 한 방울을 넣고 그 위에 8 실을 배치합니다. FRET의 단일 세포 이미징의 경우, 63X 오일 목표를 사용합니다. 센서는 성공적 RT에서 사용되었지만, 셀의 동작이 변경 될 수도있다.
- 제대로 공 초점 현미경의 설정을 설정합니다.
- 설정 획득 모드 : xyt (단일 초점면의 시간 경과 영상).
- 실험을 일시 정지하지 않고 화합물 취득 사이에 추가 될 수 있도록 20 초 간격으로 화상을 취득.
- 세룰 리안 : 발광 검출을위한 설정 스펙트럼 범위 450-520 nm의; 황수정 : 520-580 nm의.
- transillumination 빛을 사용하여 단일 세포 층에 초점을 맞 춥니 다. 영상을 시작하고 더 정확하게 Z 위치를 조정합니다. 게인을 조정하고 유지하면서 배경에서 신호를 구별하기 위해 각 채널에 대한 오프셋 (offset)관심의 세포에서 모든 픽셀에 대해 잘 포화 이하 보내고.
- 관심 (ROI)의 영역을 정의하는 원을 그립니다. 비슷한 형광 강도를 보여 셀을 선택합니다. 분명히 크기와 모양에 평균 셀과 다른 셀을 피하십시오. 센서의 광표백을 최소화하기 위해 가능한 한 짧은 시간 동안 빛에 세포를 노출. 이 셀 경계에 매우 근접하지 ROI를 그리는 것이 좋습니다. 이 영역 때문에 초점 드리프트 (Z 방향으로 이동하는 세포)가 더 어려워 실험 동안 형광 비의 변화를 모니터링 할 수있게하는 형광 강도의 변화에 가장 민감하다.
- 공 초점 현미경으로 측정을 시작합니다. 하늘색과 황수정 형광이 안정 될 때까지 기다립니다.
- 측정 중에 선택한 시점에서 50 ~ 100 μL 담즙산 또는 다른 화합물을 추가합니다. 액체 (최종 부피의 1/3 1/5)의 상대적으로 높은 양 / P 진탕없이 (10 초 이내)도 유체를 혼합하기 위하여 필요한위아래로 ipetting. 피펫 팁으로 8 잘 챔버의 가장자리를 터치하고 세포의 초점이 맞지하지 않도록 천천히 액체를 추가하지 않도록합니다. 고원 단계에 도달하기 전에 새로운 화합물을 추가하지 마십시오. 이것은 약 200 초 걸립니다.
- 100 μL GW4064, 최종 농도 5 ~ 10 μm의 (센서 포화 량)를 추가하여 각 실험을 종료하고 센서 형광이 안정 될 때까지 기다립니다.
- 실험을 저장하고 .AVI 파일로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- ImageJ에에서 열기 모두 AVI 파일 (채널 00, 하늘색, 01 채널, 황수정) 플러그인> 스택> 스택 인터리버를 선택하여. 또한 직접 이미지 J에서, 수입 공 초점 파일 (예를 들어, .lsm 또는 .lif 파일) (http://www.openmicroscopy.org에서 구입 가능) 적절한 플러그인을 사용하여 4.1.14 단계로 이동합니다.
- 스택 (1)의 경우 : 채널 01 (황수정)를 사용합니다.
- 스택 2의 경우 : 채널 00 (하늘색)를 사용합니다.
- 편집을 클릭> 선택> 추가매니저, 투자 수익 (ROI) 관리자 창을 엽니 다. 확인란을 '전체보기'.
- 타원형 선택 도구를 사용하여 특정 세포를 포함하는 관심의 몇 지역 (로아)를 그립니다. 또한 세포 외부 또는 배경 신호를 결정하기 위해 센서를 발현하지 않는 세포 내부 영역에서 하나의 원을 그립니다. 인한 초점 드리프트 (Z 방향으로 이동 세포) 또는 세포 이동에 대한 형광 강도의 변화가있을 때 명백 실험에서 셀 경계에 매우 근접하지 로아를 그리는 것이 바람직하다.
- 하나의 셀을 선택합니다. 플러그인> 비율 프로파일을 클릭합니다. RAW, 비와 Ratio_Profile이 3 화면에서 발생합니다. RAW 창은 FRET가있는 경우 황수정 (파란 선)의 강도의 증가와 하늘색 (레드 라인)의 감소를 보여줍니다. 비율 창이 FRET의 증가와 함께 증가한다 하늘색 비 시트린 /에 대한 정보를 제공한다. Ratio_Profile 창이 양쪽 채널에서 측정 된 형광 강도의 실제 수치를 제공한다. 마이크로 경우파일은 채널 순서가 반전 될 수 있습니다 사용되는 설정 - 특정 파일 (예를 들어, .lsm 또는 .lif 대신 .AVI)에 대응.
- 보충 자료로 첨부 된 스프레드 시트의 Ratio_Profile 창에서 데이터를 복사합니다. 다른 모든 세포 (및 배경 ROI)에 대해 동일한 마십시오.
주 : 온라인 스프레드 시트에서, 모든 데이터가 최대 BAS 활성화가 기대되는 조건으로 정규화된다. GW4064는 FXR의 가장 강력한 활성임을 감안할 때, GW4064의 잉여와 인큐베이션 후, 형광 비율 그것은 GW4064 첨가하여 모든 실험을 종료하는 것이 중요하다 1로 설정된다. 이것의 장점은 데이터가 더 이상 쉽게 비교 될 수있는 다른 일에 레이저 강도 또는 검출기 이득 및 실험에 의존하지 않는다는 것이다. 또한, 스프레드 시트의 아래쪽 그래프에서, 실행 평균은 실험적 노이즈 곡선을 매끄럽게 할 수있다. 실행 avera 때문에, 운동 데이터를 분석하는 경우에는,이 그래프를 사용하지GE 부드러운 빠른 운동 응답도 않습니다.
- 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 FRET 측정 (FACS)
- 무균 외과를 흡수 완충액 (0.3 mM의 EDTA, 0.5 % BSA, 0.01 % NaN의 3, 10 mM의 D-포도당)의 FACS 실험에 대한 모든 화합물을 희석.
- PBS에서 5 mM의 EDTA를 사용하여 80 % 합류 T 160cm-2 세포 배양 플라스크로부터 세포를 수확. 5 분 250 XG에 원심 분리기 세포. 실온에서 5 ml의 외과 흡수 버퍼에 씻어 세포 펠릿의 2 배.
- 콜터 카운터 또는 카운팅 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 1 × 106 세포 / ml의 농도로 흡수 FACS 버퍼에 펠렛을 희석. 단일 세포의 균일 한 현탁액을 만들 수 아래로 피펫합니다. 세포들을 분해하기 어려운 경우, 노즐 막힘을 최소화하기 위해 정렬하기 전에 셀 스트레이너를 통해 샘플을 넣어.
- 피펫 200 μL의 FACS 튜브 당 세포와 빛으로부터 보호.
- 화합물의 원하는 농도를 추가 (예 :, 담즙산 합성 FXR 리간드, 수송 억제제). 와동. (어둠 속에서) 흔들어 동안 실온에서 20 ~ 30 분 동안 품어.
- 한편, FACS를 (레이저 예열 시간이 필요)를 시작합니다.
- 실험 (그림 3 참조)에 대한 게이팅 매개 변수 유동 세포 계측법을 설정합니다 :
- 문을 결정하는 세포를 형질 전환 10-20 NucleoBAS 또는 CytoBAS 주위에 넣습니다.
- 먼저 플롯의 중심에 세포를 플롯 FSC와 SSC 전압을 조정합니다.
- 바이올렛 레이저를 사용하여, 하늘색 (40분의 450 ㎚) 전압 값과 황수정 (20분의 525 ㎚) 전압을 조정하고 모든 NucleoBAS 또는 CytoBAS 양성 세포는 산포도에서 플롯되어 있는지 확인합니다.
- 그림 4 참조, 올바른 게이트 (게이트 P4까지 문 P1)을 설정합니다.
- SSC-A / FSC-플롯의 중간에 주요 인구를 선택하여 일반적으로 왼쪽 하단 모서리에 표시 죽은 세포를 제외 게이트 (P1)을 사용합니다.
- 에 게이트 (P2)를 사용하여FSC-H / FSC-창은 분석에서 duplets를 제거합니다. 단일 세포는 이중보다 대각선에 제시되어있다.
- 황수정의 게이트 P3 (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창이 황수정과 하늘색 높은 세포를 게이팅에 의해, NucleoBAS / CytoBAS에 대한 긍정적 인 셀을 선택하는 데 사용할 수, 인구의 오른쪽 위 모서리에 대각선으로 표시 줄거리.
- 가능한 한 가까운 인구의 왼쪽 상단에서 게이트 (P4)을 그리고 세포의 더 이상 5 % 이상이 게이트 내에 있는지 확인하십시오.
- 자동 형광을 결정하기 위해 몇 가지 형질 감염되지 않은 세포 (CytoBAS 또는 NucleoBAS없이 표현)를 넣습니다. 형질 감염되지 않은 인구는 게이트 (P3)에 위치 할 수 없습니다. 자동 형광 세포를 제외 할 때 필요한 게이트 (P3)을 조정합니다.
- FACS에 튜브를 배치하기 전에 샘플을 소용돌이. 각 샘플의 경우, 게이트 (P3)에서 적어도 10,000 세포를 측정한다.
주 : 인구 계층 윈도우 이벤트의 수를 준다부모 게이트의 각 게이트 %를 표시된다. 문 4에서, 부모의 %는 모든 NucleoBAS 양성 세포의 비율로 증가 황수정 / 하늘색 비율 세포를 말한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
제시된 FRET-BAS 센서는 두 형광 황수정과 하늘색)과 LXXLL 모티브에 부착 FXR (LBD-FXR)의 도메인을 결합 리간드를 기반으로합니다. 이 센서는 높은 공간 및 시간 해상도 (도 1)와 살아있는 세포에서 담즙산 수송으로 조사 할 수있다. 하늘색 및 황에서 돌연변이는 분자 복합체 (도 1 B)의 형성을 촉진하기 위해 적용 하였다. 담즙산과 다른 FXR FXR 리간드에 결합함으로써, 형태 변화에 의해 황 및 하늘색 사이의 거리를 변경. 포유 동물 세포를 살아있는, 이는 증가 된 FRET 효율성 (황 증가, 감소 하늘색) (도 1 C, D (1))을 초래한다. 공 초점 현미경으로 살아있는 세포 양적 강도 기반의 FRET 실험 동안, 나는T는 평균 황수정 / 하늘색 비율이 GW4064 (5 μm의) (그림 치료 후 현저하게 증가 하였다 taurochenodeoxycholic 산 (TCDCA가), FRET의 모든 변경 사항을 표시하지 않습니다 담즙산 수송 부족한 NucleoBAS을 표현 (30 μM) U2OS 세포를 처리 한 것으로 관찰되었다 1 C). 반면, 공동 발현 NucleoBAS을 NTCP와 OSTαβ이 TCDCA의 추가시 황수정 / 하늘색 비율 명확한 증가 및 GW4064의 추가 (그림 1 D) 후 비율에 더 큰 증가를 보여 주 었는가 세포를 U2OS. 이것은 TCDCA는 세포막을 통과 할 수없는 셀을 입력 특정 수송차 필요함 보여준다.
센서의 셀룰러 지역화 특정 위치 파악 신호들의 존재에 의해 결정된다. NucleoBAS 그림 (핵 지역화 신호에 의해 핵를 대상으로 <강한> 2 B), CytoBAS 어떤 지역화 신호를 포함하기 때문에 세포질 (그림 2)에 남아 있지 않지만. 바이오 센서는 또한 동일한 셀에서 단백질 발현 / 지역화 FXR 및 활성화의 측정을 가능하게 다른 형광 단백질의 이미징과 결합 될 수있다. 예를 들어, 그림 2 C는 U2OS 세포가 NucleoBAS과 NTCP-mKate2와 공동 형질 전환을 보여줍니다. 또한, 센서는 동시에 하나 이상의 매개 변수의 세포 내 이미징을위한 센서와 결합 될 수있다. 예를 들어,이 NucleoBAS TGR5 (EST 클론 IMAGE 번호 5,221,127)과 동시에 동일한 셀 TGR5 FXR 및 활성화를 측정 된 cAMP의 세포질 센서 (T EPAC VV) (11)와 함께 나타내었다. 핵에 FXR의 활성화가 마주 동안 TGR5 결합시, 캠프 수준, 캠프 센서에 의해 감지 된 세포질 증가동시에 ualized.도 2D-F GW4064 (5 μM) (도 2 D)로 처리 한 후 NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 셀 6 공 촛점 이미지 이루어지는 시계열을 보여 TCDCA (10 μM) (도 2 E) 또는 체노 콜린 산 (CDCA) (10 μM) t = 0으로 그린 색 (cAMP를 상승을 나타내는) 450분의 525 nm의 발광 비율이 감소되는 영역을 나타내고, 핑크 색상에서 (도 2 F)를 비교하여, 발광 비율 (FXR 활성화)의 증가를 나타낸다 실험의 시작에서 비.
또한, 유동 세포 계측법 단일 세포 수준 또는 전체 모집단 같은 고 처리량 스크리닝에 세포의 풀을 선별하는데 사용될 수있다. NucleoBAS 표현 U2OS 세포 excit 있었다보라색 405 nm의 레이저 형광와 ED는 황수정에 대한 하늘색과 20분의 525 범위에 대한 40분의 450 범위에서 수집 하였다. FACS 기반 FRET 실험의 효율성을 개선하기 위해, 적절한 게이트들은 (도 3)를 설정해야한다. P1 게이트는 세포 파편을 제외하고 P2 게이트는 분석에서 duplets을 제거합니다. 다음으로, 분석 (488 레이저 여기) 및 하늘색 (405 레이저에 의해 여기) 마지막으로 게이트 (3)에 의해 양성 세포 시트린 제한되어, 게이트 P4가 높은 황 / 세룰 리안 발광 비율 세포의 비율을 나타낸다 (하늘색의 음원을 이용하여 ) 405 nm의 레이저와. 각 샘플에 대해, 게이트 (3) 내의 떨어 적어도 10,000 세포를 측정 하였다.
이어서, FACS 기반 FRET 유동 세포 계측법은 TCDCA GW4064과 함께 30 분간 배양 한 후 살아있는 세포의 FRET의 증가를 계산 하였다. NucleoBAS를 발현하는 비 처리 U2OS 세포 보였다 <게이트 P4 5 % 세포 (시트린 / Cerulean 높은 세포). 모든 담즙산 수송 체의 부재에서 유사한 비율은 30 μM TCDCA 처리 된 세포 (도 4)에서 관찰되었다. 반면, 세포 NucleoBAS 공동 발현, NTCP와 OSTαβ은 약 38 %의 황수정 / 하늘색 높은 세포의 증가 된 양을 표시했다. GW4064 10 μM을 첨가 한 후, 세포의 거의 90 % 또는 OSTαβ NTCP (도 4 B)의 발현 시트린 / 하늘색 오름차순 무관 하였다. 데이터는 황수정 - 하늘색 비율 (그림 4 E, F)의 인구 히스토그램이나 (그림 4 C, D) (게이트 4, 인구 4 % 세포) 막대 그래프에 표시 할 수 있습니다.
에프담즙 산성 센서 (BAS)의 igure 1. 디자인. (A) 유전자 인코딩 된 담즙 산 센서의 작용 모드의 구조 표현입니다. 그것은 기증자 형광 (하늘색)와 수용체의 형광 (황수정) FXR-LBD를 통해 연결되어 FXR - 보조 인자 펩타이드 (LXXLL 모티브)에 융합으로 구성되어 있습니다. (B) BAS의 도식 도메인 아키텍처. Q204F / V224L의 형광 돌연변이는 하늘색과 황수정 사이의 분자 내 상호 작용의 형성을 촉진. NucleoBAS 구조는 C- 말단 핵 지역화 신호 (NLS)을 포함하고 CytoBAS 구조가 세포질 지역화를 보여줍니다 따라서 어떤 대상 시퀀스를 결여하고있는 반면, 따라서 핵에 축적. (C)의 공액 담즙산 수송을 감시하는 도구로서 BAS 주제와 촛점 기반 FRET 실험. 황수정 / 하늘색 비율의 변화는 세포에서 30 μM의 TCDCA 추가 만 특급 후 관찰되지ressing NucleoBAS. 5 μM GW4064 첨가하면 강하게 증가 시트린 / 세룰 리안 비율이 관찰되었다. TCDCA의 (D) 가져 오기 (30 μM) NTCP와 OSTαβ 공동 형질 감염된 세포에서 센서의 상당한 활성화에 결과. 이후 GW4064 (5 μM) 처리 황수정 / 하늘색 비율이 더 증가로 이어집니다. 평균 ± 표준 편차, N = 6 각 셀. 같은 결과는 표현 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 현지화 FRET은-BAS는 살아있는 세포에서 구축합니다. CytoBAS (A) 또는 NucleoBAS (B)로 형질 U2OS 세포의 공 초점 현미경 이미지. (C) U2OS 세포 공동 트란NucleoBAS 및 NTCP-mKate2와 sfected. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. (D - F) NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV 형질 감염된 세포의 시계열. (D) GW4064는 FXR (증가 450분의 525 nm의 비율),하지만 TGR5이 활성화됩니다. (E)는 TCDCA TGR5가 세포막에 활성화 (450분의 525 nm의 비율이 감소)하지만, 핵 FXR을 활성화 세포에 들어갈 수 없다. (F) CDCA는 핵의 세포막에 TGR5뿐만 아니라 FXR을 활성화 (세포질 감소, 핵에 450분의 525 nm의 비율을 증가). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 게이팅 paramete 유동 세포 계측법RS. (A) SSC-A / FSC-창에서 P 1 게이트는 죽은 세포를 제외하는 데 사용됩니다. FSC-H / FSC-창에서 (B)는, P2 게이트는 분석에서 이중 이벤트를 제거하기 위해 그려집니다. (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, NucleoBAS (그리고 CytoBAS) 양성 세포가 선택 황수정 (게이트 P3)에서 (C). (D) 마지막으로, 황수정에 (20분의 525 ㎚) / 하늘색 (40분의 450 ㎚) 창, P4 게이트 FACS 실험의 황수정 / 하늘색 높은 세포가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. NucleoBAS를 사용 담즙산 수송 측정 주제 FACS 실험. (A > B)의 양을 보여주는 FACS-플롯 시트린 / 세룰 리안 높은 리빙 NucleoBAS 발현 U2OS 세포 (A) 및 U2OS 세포 공동 발현 NucleoBAS을 OSTαβ와 NTCP (B) 왼쪽 제어 버퍼 (), 30 μM으로 처리 한 후 TCDCA (가운데) 또는 10 μm의 GW4064 (오른쪽). (C, D) NucleoBAS 및 표현 U2OS 세포에서 TCDCA 또는 GW4064 30 분 배양 후 황수정 / 하늘색 높은 세포의 막대 그래프를 보여주는 비율 (D) 또는 (C) OSTαβ 및 NTCP없이 공동 형질. (E, F) TCDCA (노란색)과 30 분 배양 후 OSTαβ 및 NTCP 유무에 관계없이 NucleoBAS을 표현 U2OS 세포, GW4064 (빨간색) 또는 제어 버퍼 (파란색)의 인구 황수정 / 하늘색 비율의 분포를 보여주는 히스토그램. 모든 조건은 세번 측정 하였다. 바 평균값 + 표준 편차 (SD)를 나타냅니다 (N = 3).ttps : //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 :. 템플릿 BAS 총장 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2 :. 템플릿 BAS 자이스 라이카 데이터를 가져 오기 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서 우리는 살아있는 세포에서 담즙산 수송 시공간 역학을 모니터링 할 수있는 새로운 유전자 부호화 담즙산 센서의 사용을 위해 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 바이오 센서함으로써 FRET 기반 담즙산 센서 (BAS)을 형성 FXR-LBD 융합되어 하늘색 및 황 형광 단백질로 구성되어있다.
세포 배양 및 FACS 또는 (공 초점) 현미경 기본적인 경험을 가지고 할 때 담즙 산성 센서는 사용이 비교적 간단하고 편리합니다. 그러나 일부 측면은 몇 가지 문제가 촬영이 필요할 수 있습니다. 담즙산 수송 체와 조합 담즙산 센서를 이용하면, 숯 여과 혈청 배지에서 배양 된 세포에 권장된다. 목탄은 추가 혈청에서 흡착 담즙산 농도를 감소시킨다. 이 둔감 센서의 가장 흔한 원인이기 때문에 특히 NTCP 수입 등의 존재하에,이 배양 동안 센서의 포화를 방지하는 것이 중요실험 중. 따라서, 다른 센서는 더 큰 동적 범위 (8)을 생성, 담즙산의 감도를 변경 돌연변이를 포함 (NucleoBAS N354K / I372V)를 만들었습니다. 이들 세포는 저 세포 내 담즙산 농도를 갖는 것으로 가정되기 때문에, 센서가 이미 포화되어 있는지 여부를 정의하기 위해, 황 / 하늘색 비는하지 않음 담즙산 수송 체를 발현하는 대조군 세포의 비율과 비교 될 수있다. 대안 적으로, 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 측정 강도에 독립적 인 방식으로 12 FRET을 조사하기 위해 수행 될 수있다. 이 기술은이 문서의 범위를 넘어,보다 전문적인 장비를 필요로한다. 둔감 센서에 대한 다른 이유는 자동 - 형광 및 / 또는 발현을 NucleoBAS 잃은 세포의 사용을 포함한다. 참고로, 실험 기간 동안 (예를 들어 의한 초점의 변화에) 하늘색과 황수정의 강도의 변동은 있지만, 이미징 동안 FRET 변화의 직접 시각화를 모호 할 수 있습니다센서의 비율 적 성질은 여전히 담즙산 역학의 모니터링을 허용한다. 비율의 증가가 분명 동안 종종 절대 강도 변화는, FXR 리간드의 첨가시 개별 형광체 완만하다.
BAS 센서로 형질 세포 FRET 분석을 위해 적절한 레이저 광 필터가 선택되어야한다. FRET 동안 황수정 강도의 증가는 450-520 (하늘색)와 520-580 (황수정)를 통해 모니터링 배출량 바이올렛 다이오드 (405 ㎚) 레이저로 측정 할 수있다. 고려해야 할 중요한 점은 광표백에 대한 센서의 감도이다. 하나 또는 둘의 형광 강도가 서서히 리간드의 첨가없이 시간에 감소 할 때, 종종 광표백을 나타낸다. 레이저 파워가 너무 높은 경우에는 이러한 현상이 주로 발생한다. 이러한 원치 않는 효과를 방지하기 위해, 레이저 전력은 전체 전력의 5 %를 초과하지 않아야하고 세포를 최대한 어두운 유지되어야한다. 제한시간은 바로 세포를 검색합니다. 형광 강도의 변동은, Z 축에 초점 드리프트에 의해 발생 될 수있다. 이에 대응하기 위해 핀홀 크기는 증가 될 수 있으며, 셀 경계에 매우 근접하지 로아를 그리는 것이 바람직하다.
담즙산의 FRET 센서는 형질 전환과 안정적인 표현형이 될 수있는 여러 세포 유형 (U2OS, Huh7, 인 HepG2, H69, MDCK 및 HEK293T 세포)에서 테스트되었습니다. 그러나, 1 차 간세포와 분화 된 세포는 형질과 특성의 관점에서 안정한 유지하기 어렵다. 바이러스 성 전달이 어려운 트랜 세포 (요청 구성)에 도움이 될 수 있습니다. 우리는 현재 급속하게 분리시 탈분화 갓 절연 일차 전지에 센서의 사용을 허용하기 위해 마우스 선을 생성한다.
설명 촛점 실험을 수행하기 위해, 선택된 세포주 배양 접시에 부착하는 것이 필수적이다이고 SI에서 자란다ngle 세포 층. 그러나, 현탁액, 또는 오히려 쉽게 트립신 접착 세포 수의 세포 성장은 또한 FACS를 이용하여 측정 할 수있다. 마지막으로,이 특정 전송 경로를 분석 할 때, 내인성 담즙산 수송 또는 합성없는 세포주를 선택하도록 의뢰한다. 즉, 특정 형질 (돌연변이) 수송 단백질의 활성을 측정 할 때.
제시된 유전자 인코딩 형광 바이오 센서는 단일 BAS 생균 담즙산 수송 모니터링 유용한 도구이다. BAS는 담즙산 (8)의 세포 내 역학의 이미징을 허용, 담즙산의 큰 다양성에 의해 활성화되는 FXR-LBD가 포함되어 있습니다. 이것은 다른 기술의 이용과 관련하여 큰 이점을 제공한다. 예를 들어, 프로모터 구동 루시페라아제 리포터 분석법에, 루시 페라 제는 세포 내 신호 정보를 지원하지 않는, 세포 내의 리포터의 안정성에 의존하고, 시료의 파괴를 필요
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
