Introduction
Förster Resonance Energy Transfer (FRET) er mye brukt for å få en bedre forståelse av cellulære funksjoner i levende celler med høy tidsmessig og romlig oppløsning 1. I slite, er energi fra en begeistret donor fluorophore overført til en akseptor fluorophore. FRET effektivitet er sterkt avhengig av avstanden mellom donor og akseptor fluorofor og deres orientering, og er derfor følsom avlesning av konformasjonsendringer som påvirker de to fluoroforer. Dette fenomen utnyttes til å generere FRET-baserte biosensorer for avbildning av små molekyler. Endringer i deres konsentrasjon kan måles som økning / reduksjon i forholdet mellom emisjonsintensitet i forhold til donor-akseptor fluoroforen 2. For eksempel, gnage-baserte kalsium biosensorer tillate rask og stabil påvisning av frie kalsiumkonsentrasjoner i levende celler 3. Andre fordeler med FRET-baserte biosensorer er tenkelig i enkle levende celler, tarving ikke-invasivitet, deres evne til å være rettet mot forskjellige celletyper og cellulære 4.
Mange aspekter ved intracellulær gallesyre dynamikk er fortsatt dårlig forstått. For eksempel, er lite kjent om mekanismen underliggende regulering av konjugert og ukonjugert gallesyre transport. Eksisterende teknikker for å overvåke denne transporten i hovedsak benytter seg av luciferase-baserte journalister, radiomerkede gallesyrer, eller fluorescerende gallesyre analoger. Det sistnevnte krever modifikasjon av gallesyrer, eventuelt påvirker deres egenskaper. Luciferase-baserte journalister har dårlig tid oppløsning. Dessuten, disse teknikkene føre til tap av prøven, og er ikke anvendelig for avbildning i enkeltceller. Derfor ville det være fordelaktig å bruke metoder som tillater direkte enkelt celle avbildning av transportaktivitet ved hjelp FRET biosensorer, spesielt siden den inneholder den fordel ratiometrisk deteksjon 5, 6. Mens varianter av CFP / YFP skjema mest brukte FRET parene, nye strategier bruker Morange og mCherry frakte selv foreningen-induserende mutasjoner har ført til en utvidelse av FRET verktøykasse med nye sensorer, inkludert en rød-forskjøvet gallesyre sensor 7.
Vi har tidligere skapt en genetisk kodet FRET gallesyre sensor (BAS), som består av en donor fluorofor (cerulean) og en akseptor-fluorofor (citrine) som er smeltet sammen med den farnesoid X reseptor (FXR) ligand bindingsdomene (FXR-LBD) og et peptid som inneholder en LXXLL motiv 8. Dette peptid forbinder med FXR-LBD i en gallesyreavhengig måte. Ved FXR aktivering, vil avstanden mellom citrin og cerulean endre på grunn av en konformasjonsendring. I pattedyrcellelinjer, FXR aktivering resulterer i en klart påvisbar økning i citrin / dypblå-forholdet, mens det rensede sensoren arbeider i motsatt retning og fører til et redusert FRET-forhold på FXR aktivering. Denne sensoren (CytoBAS)tillater overvåking av cytosoliske gallesyre dynamikk. Ved karboksylterminalt tillegg av subcellulære rettet motiver, kan BAS konstruere være målrettet til kjernen (NucleoBAS) og peroxisomes (PeroxiBAS), slik at målinger av gallesyrekonsentrasjoner i ulike cellulære avdelinger. Selv tillegg av peroksisomal målretting motivet ikke svekker sin respons til gallesyrer, gjorde cellepermeable FXR-ligander ikke fremkalle noen FRET endringer av PeroxiBAS inne peroxisomes 8. Som natur dette avviket er ukjent, protokollen under er fokusert på CytoBAS og NucleoBAS.
Bruken av denne genetisk kodede sensoren FRET nylig ble påvist i celler inneholdende de hepatiske gallesyre transportører Na + / taurocholat co-transporterende polypeptid (NTCP) og organisk oppløsningsmaterialet transporter alpha / beta (OSTαβ) 8. NTCP er hovedlevergallesyre importør og OSTαβ er en basolaterale intestinal gallesyre transporter som kan fungere både som importør og eksport avhengig av den elektrokjemiske gallesyre konsentrasjonsgradient 9, 10. Nye data viste at ved gallesyretransport av NTCP og / eller OSTαβ kan robuste og rask respons i FRET-forhold som et resultat av ligand-FXR-LBD interaksjon holdes.
Her beskriver vi detaljerte protokoller for metoder for å måle FRET som confocal mikroskopisk analyse og fluorescens aktivert celle sortering (FACS), markere viktige skritt, potensielle problemer og diskutere alternative metoder. Ved hjelp av denne genetisk kodet FRET sensor kan gallesyre interaksjon med FXR-LBD kvantifiseres og overvåkes direkte i levende celler, og gir en hurtig og enkel metode for visualisering av gallesyretransport og dynamikk i sanntid. Pattedyr-ekspresjonsplasmider som koder for CytoBAS og NucleoBAS er kommersielt tilgjengelige. Derfor kan dette biosensor ytterligere bidra tilforståelse av gallesyre transportører eller forbindelser som aktiverer FXR og gi en dypere innsikt i gallesyre biologi og signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transient Transfeksjon
Note: CytoBAS og NucleoBAS (Vennligst se Materialer Table) brukes med hell i flere celletyper, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK og HEK293T celler). Det viktigste kravet til å bruke sensoren er at den trenger å bli uttrykt, krever kodende DNA for å gå inn i cellen.
- Høste celler fra en 80% konfluent 25 cm2 kolbe. Fortynn cellene i fullstendig kulturmedium som er egnet for den bestemte cellelinje (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7-celler).
- Plate-celler ved den ønskede tetthet i en steril 8 godt kamret dekkglass (0,8 cm2). Målet for en sub-konfluent (60-80% konfluens) lag av celler på dag av eksperimentet, selv om dette ikke er essensielt.
- Legg fullstendig kulturmedium til en sluttvolum på 400 ul per brønn. Tillate celler til å feste i 24 timer.
- Forbered transfeksjon mix i et sterilt rør ved å legge 0,5 ug NucleoBASeller CytoBAS DNA til 100 mL av kulturmedium (serum / antibiotika gratis). Vortex godt. Legg til en transfeksjon reagens, og bland ved virvling. Transfeksjon reagenser som gir optimal effektivitet er celletype avhengig og kan kreve før testing.
- For eksempel bruke 2,5 ul av 1 mg / ml polyetylenimin (PEI) og inkuber DNA / PEI bland i 15 min ved RT.
- Tilsett transfeksjon blandingen i dråpene til cellene og bland forsiktig ved å riste brønns plate for hånd. Tilsett 100 ul av blandingen i en brønn av ~ 9,6 cm2. Bruke 10 ul av transfeksjon blandingen for individuelle bildedannende kammer for forbigående transfekterte celler.
Merk: Etter 24 til 48 timer, vil celler som uttrykker gallesyre sensoren og kan brukes til eksperimenter.
2. Stabil Transfeksjon
- Høste celler fra en 80% konfluent 25 cm2 kolbe. Fortynn pellet i fullstendig kulturmedium egnet for den bestemte cellelinje (10% storfe-foster Serum, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7-celler) til en konsentrasjon på 150.000 celler pr ml og tilsett rundt 300 000 celler per brønn i en 6-brønns dyrkingsplate (2 ml sluttvolum).
- Tillate celler til å feste i 24 timer.
- Forbered transfeksjon mix i et sterilt rør ved å legge 0,5 ug CytoBAS eller NucleoBAS DNA (Vennligst se Materialer Table) til 100 mL av kulturmedium (serum / antibiotika gratis). Vortex godt. Legg til en transfeksjon reagens, og bland ved virvling.
- For eksempel bruke 2,5 ul av 1 mg / ml polyetylenimin (PEI) og inkuber DNA / PEI bland i 15 min ved RT.
- Tilsett 100 ul av transfeksjon blandingen i dråpene til cellene og bland forsiktig ved å riste brønns plate for hånd. Inkluderer alltid en utransfekterte kontroll når du oppretter en stabil cellelinje.
- Grow celler O / N ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Cellene trypsineres i henhold til produsentens protokoll (Inkuber cellene ved 37 ° C wed 1,5 ml forvarmet trypsin pr 25 cm2 cellekultur), og spinne dem ned ved 250 xg ved RT i 5 min. Fjern supernatant og resuspender cellene i 13 ml fullstendig dyrkingsmedium. Fordel celler over flere 10 cm diameter kulturskåler: 0,5 ml (lav tetthet), 1,5 ml (middels tetthet), og 4,5 ml (high density). Gjør det samme for resterende 6,5 ml.
- Legg kulturmedium til en sluttvolum på 10 ml. For U2OS celler ved å bruke 800 ug / ml G418 for plasmider med neomycinresistens kassetten slik som CytoBAS og NucleoBAS konstruerer å selektere for positive celler. Disse konsentrasjoner er avhengig av celletype og kan bestemmes ved å velge den laveste antibiotikum (G418) konsentrasjon hvor ikke-transfekterte celler døde i løpet av 2 til 10 dager (800 ug / ml G418 for U2OS celler).
- Oppdatere kulturmediet med det passende antibiotikum (G418) hver 72 timer inntil ikke-transfekterte celler er døde.
- Undersøke kulturen plate under mikroskop med en 20X objektiv forpositive kolonier (fluorescens kan overvåkes bruker mest filtersett som brukes til grønn, cyan eller gul fluorescens).
- Markere de positive kolonier som ligger isolert fra andre kolonier med en penn på utsiden bunnen av kulturen fatet.
- Vask platen to ganger med fosfatbuffret saltvann (PBS) og aspireres den. Ta rundt 15 sterile kloning sylindere og dypp dem i sterile silikon. Bruke dem rundt utvalgte kolonier ved å trykke lett mot petriskål og sørg for at ikke mer enn en koloni er inkludert i kloning ringen.
- Pipetter 20 ul av forvarmet trypsin (1x, 0,25%) i kloningssylinder og inkuber ved 37 ° C inntil mesteparten av cellene har avrundede opp (observere med et mikroskop).
- Legg 150 mL av kultur medium med serum og riktig antibiotika (10% FBS og 800 mikrogram / ml G418 for U2OS og Huh7 celler) i kloning sylinder og pipettér opp og ned flere ganger for å resuspendere cellene og overføre til en 96-brønns plate. Oppdater medium etter 4-24 timer og la cellene til å vokse sammenflytende i de neste dagene (37 ° C, 5% CO 2 for U2OS og Huh7 celler).
- Oppdatere medium med antibiotika hver 3. eller 4. dag. Når cellene har vokst konfluente, overføre dem til en større brønn plate. Gjenta dette trinnet til kulturen er stor nok for eksperimenter. Fryse ned noen ampuller for backup. Nedfrysing medium består av 20% FBS og 20% DMSO i media (DMEM) uten kosttilskudd.
Merk: Nå er monoklonale og anses å være stabilt for å uttrykke gallesyre Sensor cellelinjen. Halvparten av konsentrasjonen av det antibiotiske G418 (400 ug / ml) er nå tilstrekkelig til å opprettholde ekspresjon i stabil cellelinje.
3. Lentiviral Transduksjon
Merk: Noen cellelinjer anses vanskelig å transfektere med mer tradisjonelle metoder slik som polyetylenimin (PEI) -metoden. Viral transduksjon av celler som er et effektivt alternativ verktøy feller gen-levering og stabil transgene uttrykk.
- Høste celler fra en 80% konfluent 25 cm2 kolbe. Fortynn cellene i fullstendig kulturmedium egnet for den bestemte cellelinje (10% FBS, 1% L-glutamin, 1% pen / strep for U2OS og Huh7-celler) og legge rundt 200 000 celler per brønn i en 6-brønners kulturplate.
- Legg kulturmedium til en sluttvolum på 2 ml pr brønn. Tillate celler til å feste i 24 timer.
- Utfør virus transductions ved å inkubere cellene i 4-6 timer med 500 mikroliter CytoBAS lentivirus inneholder medium (tilgjengelig på forespørsel) fylt opp til et samlet beløp på 1 ml med komplett kultur medium som inneholder 10 mikrogram / ml dietylaminoetyl (DEAE) -dextran eller annen lentiviral transduksjon forsterker. Ikke glem å ta en brønn med untransduced kontrollceller.
- Fjern medium og tilsett 2 ml fullstendig dyrkingsmedium inneholdende det ønskede antibiotikum (500 ug / ml hygromycin). Bruk en lentiviral konstruksjon for CytoBAS transduksjon som girs hygromycin motstand mot celler. Grow celler etter ønskede forhold.
- Oppdater medium med (500 mikrogram / ml hygromycin) antibiotika hver 3. dag og splitte cellene når 80% sammenflytende, inntil alle negative kontrollceller er døde (tar ca 1-2 uker for de fleste cellelinjer). Cellelinjen er nå anses å være stabilt for å uttrykke gallesyre Sensor.
- Alternativt kan du bruke celler for eksperimenter 1-3 dager etter virusoverføring. Som levende virus kan være til stede, krever dette FRET-avlesning utstyr i rom med riktig sikkerhetsnivå.
- Alternativt, for hurtig isolering av stabile cellelinjer, utføre fluorescens-aktivert cellesortering (FACS).
- Høste celler fra en sammenflytende 160 cm2 kolbe.
- Fortynn cellene i Leibovitz kulturmedium (L-15 medium) med <5% serum i en konsentrasjon på maksimalt 5 x 10 6 celler pr ml
- For innsamling av sorterte celler, fyll FACS rør med 1 ml samling medium (L-15 medium + 1,5% penn / strep, 1% L-glut og 20% serum).
- Sorter celler for Citrin (520-580 nm) eller cerulean (450-520 nm), glade med 405 laser.
- Etter sortering lag 500.000 celler, spinne ned celler (5 minutter, 250 x g) og resuspender dem i 5 ml normal komplett dyrkingsmedium (10% FBS, 250 ug / ml Hygromycin for U2OS og Huh7 CytoBAS celler) og plate dem i en T25 kultur kolbe. Dyrke celler i henhold til de ønskede betingelser (37 ° C, 5% CO2 i U2OS og Huh7-celler).
4. Live-Cell Imaging av gallesyre Sensor
Merk: Celler som inneholder gallesyre-tilhengere kan være dyrket i medium med 1-10% trekull-filtrert serum som fjerner lipofile forbindelser. Normal serum inneholder ofte gallesyrer som kan føre til intracellulære gallesyre akkumulering og metning av gallesyre Sensor.
- FRET målinger ved hjelp av det konfokale mikroskop
- Plate cellene stabilt eller transiently uttrykker sensoren ved den ønskede tetthet i en steril 8 godt dekk bunn kammeret sleiden (0,8 cm2). Dyrk celler i fullstendig dyrkningsmedium (med trekullfiltrert serum), slik at på dagen for eksperimentet, er omkring 60-70% konfluens.
- Vask de adherente cellene i kammer lysbilde en gang med 200 pl 1 x PBS eller Leibovitz L-15 kulturmedium.
- Aspirer og erstatte med 300 ul Leibovitz L-15 kulturmediet slik at ingen CO 2 kontroll er nødvendig.
Merk: DMEM uten fenolrød kan brukes også, men krever CO 2 bufrede forhold. De gallesyre sensor viser (noen) pH-følsomhet så tar sikte på å holde pH konstant under datainnsamling. - Fortynn de forbindelser som skal anvendes ved konfokal avbildning forsøket også i L-15-kulturmediet. Ta hensyn til at under avbildning, forholdsvis store mengder av væske i kamrene som skal tilsettes for å sikre hurtig blanding av prøven (50-100 ul),så sørg 3-5x løsninger.
- Start bildebehandlingsprogrammer for et konfokal mikroskop med en 37 ° C inkubasjon kammer og slå på fiolett 405 nm laser. Sett en dråpe nedsenking olje på målet og plasser åtte-kammer på toppen av det. For enkelt celle avbildning av slite, bruke 63X olje målet. Sensoren har blitt brukt på RT, men celle atferd kan endres.
- Riktig innstilt innstillingene av konfokal mikroskop.
- Still Oppkjøp modus: XYT (time-lapse avbildning av enkeltfokusplan).
- Hente bilder på 20 sek mellomrom for å tillate forbindelser som skal legges mellom oppkjøp uten pause forsøket.
- Still spektralområde for deteksjon utslipp: Cerulean: 450-520 nm; Citrin: 520-580 nm.
- Fokus på enkelt celle laget ved hjelp transillumination lys. Begynn bildebehandling og justere z-posisjon mer presist. Juster forsterkning og forskyvning for hver kanal for å skille signalet fra bakgrunnen mens forbliing godt under metnings for alle piksler i celler av interesse.
- Tegne sirkler å definere regionen av interesse (ROI). Velg celler som viser lignende fluorescens intensitet. Unngå celler som tydelig avviker fra den gjennomsnittlige celle i størrelse og form. Utsette cellene for lys i en tid som er så kort som mulig for å minimalisere fotobleking av sensoren. Det er lurt å trekke ROIs ikke veldig nær cellen omkretsen. Dette området er mest følsom for endringer i fluorescensintensitet på grunn av fokal drift (celler som beveger seg i z-retning), noe som gjør det vanskeligere å overvåke endringer i fluorescens-forholdet i løpet av eksperimentet.
- Starte målinger med konfokal mikroskop. Vent til Cerulean og citrin fluorescens er stabil.
- Legg 50-100 ul gallesyrer eller andre forbindelser på utvalgte tidspunkter under måling. De relativt høye mengder av væske (en femtedel til en tredjedel av det endelige volum) er nødvendig for å blande fluider vel (innen 10 sekunder) uten risting / pipetting opp og ned. Pass på å ikke berøre kanten av 8-brønnen kammer med pipettespissen og tilsett væsken langsomt slik at cellene ikke får ut av fokus. Ikke legg til nye forbindelser før platåfasen er nådd. Dette tar ca 200 sek.
- Avslutt hvert forsøk ved tilsetning av 100 ul GW4064, sluttkonsentrasjonen 5-10 pM (sensor metnings dose) og vente til fluorescens-sensor er stabil.
- Lagre eksperimentet og eksportere data som en AVI-fil.
- Open in ImageJ både AVI-filer (kanal 00, cerulean; kanal 01, citrin) ved å velge Plugins> Stabler> Stack innfelleren. Alternativt, import konfokal fil (f.eks .lsm eller .lif filer) direkte i Image J ved hjelp av egnede plugins (tilgjengelig på http://www.openmicroscopy.org) og går videre til trinn 4.1.14.
- For Stack 1: Bruk Kanal 01 (citrin).
- For Stack 2: bruke Kanal 00 (cerulean).
- Klikk på Rediger> Valg> Leggtil manager, for å åpne ROI leder vinduet. Merk av i boksen 'Vis alle'.
- Trekke noen regioner av interesse (Rois) som dekker spesifikke celler med oval markeringsverktøy. Også trekke en sirkel i et område utenfor cellene, eller inne i en celle som uttrykker ikke-sensoren for å bestemme bakgrunnssignalet. Det er lurt å trekke ROIs ikke veldig nær cellen perimeter i eksperimenter når endringer i fluorescens intensitet på grunn av fokus drift (celler som beveger seg i z-retning) eller cellevandring var opplagt.
- Velg en celle. Klikk på Plugins> Ratio Profil. Dette vil resultere i 3 skjermer: RAW, ratio og Ratio_Profile. RAW-vinduet viser økning i intensiteten av citrin (blå linje) og en reduksjon i Cerulean (rød linje) hvis det er gnage. Den Ratio vinduet gir informasjon om forholdet citrin / cerulean, noe som vil øke med en økning i bånd. Den Ratio_Profile vinduet gir de faktiske tallene av fluorescens intensitet målt i begge kanaler. Hvis microstakle setup-spesifikke filer (for eksempel .lsm eller .lif stedet for .avi) filer brukes kanalen orden kan bli reversert.
- Kopiere data fra den Ratio_Profile vinduet i regnearket vedlagt som supplerende data. Gjør det samme for alle de andre cellene (og bakgrunnen ROI).
Merk: I den elektroniske regnearket, er normalisert til den tilstanden der maksimal BAS aktivering forventes all data. Gitt at GW4064 er den mest potente aktivator av FXR, er fluorescens-forholdet etter inkubering med et overskudd av GW4064 stilt på 1. Det er derfor viktig å avslutte alle forsøkene med tilsetning av GW4064. Fordelen med dette er at dataene er ikke lenger avhengig av laserintensiteten eller detektor forsterkning og eksperimenter på forskjellige dager kan sammenlignes lettere. Videre er det i den nedre graf av regneark, en løpende gjennomsnitt kan brukes til å glatte kurvene for eksperimentell støy. Men ikke bruk denne grafen ved analyse av kinetiske data, siden den kjører gjenge vil også jevne raske kinetiske svar.
- FRET målinger ved hjelp fluorescensaktivert Cell Sorting (FACS)
- Fortynn alle forbindelser for FACS forsøket i sterile FACS opptaksbuffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN 3 og 10 mM D-glukose).
- Høste celler fra en 80% konfluente T-160 cm2 cellekulturflaske ved bruk av 5 mM EDTA i PBS. Sentrifuger cellene ved 250 xg i 5 min. Vask cellepelleten 2x i 5 ml FACS-opptaksbuffer ved RT.
- Cellene telles ved hjelp av Coulter Counter eller et tellekammer.
- Fortynn pellet i FACS opptaksbuffer til en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Pipettere opp og ned for å skape en homogen suspensjon av enkeltceller. Hvis cellene er vanskelig å disaggregert, sette prøvene gjennom en celle sil før sortering for å minimere dyse tresko.
- Pipet 200 ul celler per FACS tube og beskytte dem mot lys.
- Legge til den ønskede konsentrasjonen av forbindelsen (f.eks, Gallesyrer, syntetiske FXR ligander transportører hemmere). Vortex. Inkuber i 20-30 minutter ved romtemperatur under rysting (i mørket).
- Samtidig begynner de FACS (lasere trenger tid til å varme opp).
- Innstill flowcytometri port parametere for forsøket (se figur 3):
- Laste rundt 100,000-200,000 NucleoBAS eller CytoBAS transfekterte celler for å bestemme portene.
- Først justere FSC og SSC spenninger å plotte cellene i midten av tomten.
- Bruke fiolett laser, justere cerulean (450/40 nm) spenningsverdi og Citrin (525/20 nm) spenning og sikre at alle NucleoBAS eller CytoBAS positive celler er plottet i spredningsdiagram.
- Still de riktige portene (Gate P1 opptil Gate P4), se figur 4.
- Bruk gate P1 å utelukke døde celler, vanligvis vises i nedre venstre hjørne ved å velge hoved befolkningen i midten av SSC-A / FSC-A plot.
- Bruk gate P2 iFSC-H / FSC-A vindu for å fjerne duplets fra analyse. Enkeltceller er presentert i en mer diagonal linje enn dubletter.
- Gate P3 i citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) vindu kan brukes til å velge for NucleoBAS / CytoBAS positive celler, ved gating citrin og Cerulean høye celler, vises en befolkning diagonalt i øvre høyre hjørne av handlingen.
- Tegn gate P4 øverst til venstre av befolkningen, så nært som mulig og sørge for at ikke mer enn 5% av cellene faller innenfor denne porten.
- Laste noen utransfekterte celler (ingen uttrykk for CytoBAS eller NucleoBAS) å bestemme auto-fluorescens. Den utransfekterte befolkningen kan ikke være plassert i gate P3. Juster gate P3 når det er nødvendig å ekskludere auto-fluorescerende celler.
- Vortex prøvene før du legger rørene i FACS. For hver prøve, måle minst 10.000 celler i gate P3.
Merk: Befolknings Hierarki Window gir antall hendelservises for hver av portene og% av moder porten. I gate 4,% av den overordnede sier celler med økt Citrin / cerulean forholdet i prosent av alle NucleoBAS positive celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den FRET-BAS sensor presentert er basert på det ligandbindende domene av FXR (LBD-FXR) festet til to fluoroforer citrin og cerulean) og en LXXLL motiv. Denne sensoren gjør undersøkelser i gallesyretransport i levende celler med høy romlig og tidsmessig oppløsning (figur 1 A). Mutasjoner i cerulean og citrine ble anvendt for å fremme dannelsen av den intramolekylære kompleks (figur 1 B). Gallesyrer og andre FXR ligander binder seg til FXR og dermed endre avstanden mellom citrin og cerulean av en konformasjonsendring. I levende pattedyrceller, dette resulterer i en økt effektivitet FRET (citrine økning, cerulean reduksjon) (Figur 1 C, 1 D). Under en levende celle kvantitativ intensitet basert FRET eksperiment med konfokal mikroskop, jegt ble observert at taurochenodeoxycholic acid (TCDCA) -behandlet (30 mm) U2OS celler som uttrykker NucleoBAS mangler gallesyre transportører ikke vist endringer i slite, mens den gjennomsnittlige citrin / cerulean Andelen økte bemerkelsesverdig etter behandling med GW4064 (5 mm) (Figur 1 C). I kontrast, celler som U2OS samuttrykker NucleoBAS, NTCP og OSTαβ viste en klar økning i citrin / cerulean-forhold ved tilsetning av TCDCA, og en enda større økning i forholdet etter tilsetning av GW4064 (figur 1 D). Dette viser at TCDCA er i stand til å passere gjennom cellemembranen og krever særskilte transportører for å gå inn i cellen.
Cellulær lokalisering av sensoren bestemmes av tilstedeværelsen av bestemte lokaliseringssignaler. NucleoBAS er rettet mot kjernen av den kjernefysiske lokalisering signal (Figur <strong> 2 B), mens CytoBAS ikke inneholder noen lokaliseringssignal, og derfor forblir i cytosol (figur 2 A). Biosensoren kan også kombineres med avbilding av andre fluorescerende proteiner, slik at målinger av protein ekspresjon / lokalisering og FXR aktivering i den samme celle. For eksempel viser figur 2 C U2OS celler kotransfektert med NucleoBAS og NTCP-mKate2. I tillegg kan sensoren også kombineres med andre sensorer for subcellulære avbildning av flere parametere samtidig. For eksempel ble NucleoBAS uttrykt sammen med TGR5 (EST klon IMAGE # 5221127), og en cAMP cytosoliske føler (T Epac VV) 11 for å måle TGR5 og FXR aktivering i samme celle på samme tid. Ved TGR5 binding, økt cAMP-nivåer i cytosol som ble gjenkjent av cAMP sensor, mens FXR aktivering i kjernen var visualized samtidig. Tall 2D-F viser en tidsserie bestående av 6 konfokale bilder av NucleoBAS-TGR5- T Epac vv celler etter behandling med GW4064 (5 mm) (figur 2 D), med TCDCA (10 mm) (figur 2 E) eller med chenodeoksycholsyre (CDCA) (10 pM) (figur 2 F) ved t = 0. Den grønne farge representerer områder hvor 525/450 nm emisjonsforholdet blir redusert (som representerer cAMP høyde), og den rosa fargen representerer en økning i emisjonsforholdet (FXR aktivering), sammenlignet forholdene ved starten av eksperimentet.
I tillegg strømningscytometri kan anvendes for å screene en pool av celler på enkeltcelle-nivå eller som high-throughput screening på hele populasjonen. U2OS celler som uttrykker NucleoBAS var Excited med en fiolett 405 nm laser og fluorescens ble samlet i 450/40 rekkevidde for cerulean og 525/20 utvalg for citrin. For å forbedre effektiviteten av FACS-baserte FRET eksperimenter, må egnede porter stilles inn (figur 3). P1 gate utelukker celleavfall og P2 gate fjerner duplets fra analyse. Neste er analysen begrenset til citrin (spent med 488 laser) og cerulean (spent med 405 laser) positive celler ved gate 3. Til slutt, representerer gate P4 prosentandelen av celler med høy citrin / cerulean utslipp ratio (ved hjelp av eksitasjon av Cerulean med 405 nm laser). For hver prøve ble minst 10.000 celler som falt innenfor gate 3 målt.
Deretter ble FACS-baserte FRET flowcytometri brukt til å beregne en økning i FRET i levende celler etter 30 min inkubering med TCDCA og GW4064. Ikke-behandlede U2OS celler som uttrykker NucleoBAS viste <5% celler i gate P4 (Citrin / cerulean høy-celler). I fravær av gallesyre transportører, ble en tilsvarende prosentandel observert i 30 uM TCDCA behandlede celler (figur 4 A). I motsetning til dette, celle ko-uttrykker NucleoBAS, NTCP og OSTαβ gjorde viser en økt mengde citrin / cerulean høye celler av omkring 38%. Etter tilsetning av 10 mM GW4064, nesten 90% av cellene var citrine / cerulean-høy uavhengig av ekspresjon av OSTαβ eller NTCP (figur 4 B). Data kan presenteres i søylediagrammer (% celler i gate 4, befolkning 4) (figur 4 C, D) eller som befolknings histogrammer av citrine-cerulean ratio (figur 4 E, F).
Figur 1. Design av gallesyre Sensor (BAS). (A) Structural representasjon av modusen for handling av en genetisk kodet gallesyresensor. Det består av en donor fluorofor (cerulean) og en akseptor-fluorofor (citrine) bundet via FXR-LBD og kondensert til en FXR-kofaktor peptid (LXXLL motiv). (B) Skjematisk domene arkitekturen i BAS. De Q204F / V224L fluoroforen mutasjoner fremme dannelsen av intra interaksjoner mellom cerulean og citrin. Den NucleoBAS konstruksjonen inneholder et C-terminalt nukleære lokaliseringssignal (NLS) og derfor akkumuleres i kjernen, mens CytoBAS konstruksjonen mangler noen målretting sekvens, og derfor viser cytosoliske lokalisering. (C) Representant konfokal basert FRET eksperiment med BAS som et verktøy for å overvåke konjugert gallesyre transport. Ingen endring i citrin / cerulean forholdet er observert etter 30 mikrometer TCDCA tillegg i celler bare expressing NucleoBAS. Når fem mikrometer GW4064 ble lagt, ble en sterkt økt citrin / cerulean ratio observert. (D) Import av TCDCA (30 uM) resulterer i en betydelig aktivering av sensoren i NTCP og OSTαβ ko-transfekterte celler. Påfølgende GW4064 (5 mm) behandling fører til en ytterligere økning i citrin / cerulean ratio. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n = 6 individuelle celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Lokalisering FRET-BAS konstruere i levende celler. Konfokalmikroskop bilder av U2OS celler transfektert med CytoBAS (A) eller NucleoBAS (B). (C) U2OS celler co-transfected med NucleoBAS og NTCP-mKate2. Målestokk representerer 10 mikrometer. (D - F) Tidsserier av NucleoBAS-TGR5- T EPAC VV transfekterte celler. (D) GW4064 aktiverer FXR (økt 525/450 nm forhold), men ikke TGR5. (E) TCDCA aktiverer TGR5 på plasmamembranen (redusert 525/450 nm ratio), men er ikke i stand til å gå inn i cellen for å aktivere FXR i kjernen. (F) CDCA aktiverer TGR5 på plasmamembranen samt FXR i kjernen (økt 525/450 nm ratio i kjernen, redusert i cytoplasma). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Flowcytometri gating parameteretrs. (A) P en gate i SSC-A / FSC-A vinduet brukes til å ekskludere de døde cellene. (B) I FSC-H / FSC-Et vindu er P2 gate trukket til eliminere Doublet hendelser fra analyse. (C) I citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) vindu, NucleoBAS (og CytoBAS) positive celler er valgt (Gate P3). (D) Til slutt, i citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) vindu, inneholder P4 gate citrin / Cerulean-høye cellene i FACS forsøket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .
Figur 4. Representant FACS eksperiment måle gallesyretransport hjelp NucleoBAS. (A >, B) FACS-plott som viser mengden av citrin / Cerulean-høy leve NucleoBAS-uttrykker U2OS celler (A) og U2OS celler samtidig uttrykte NucleoBAS, OSTαβ og NTCP (B) etter behandling med kontroll buffer (til venstre), 30 mikrometer TCDCA (midten) eller 10 mm GW4064 (til høyre). (C, D) stolpediagram som viser prosent av citrin / cerulean-høy-celler etter 30 min inkubering med TCDCA eller GW4064 i U2OS celler som uttrykker NucleoBAS og ko-transfektert med (D) eller uten (C) OSTαβ og NTCP. (E, F) Histogram som viser fordelingen av citrine / cerulean forholdet i en populasjon av U2OS celler som uttrykker NucleoBAS med eller uten OSTαβ og NTCP etter 30 min inkubasjon med TCDCA (gul), GW4064 (rød) eller kontroll buffer (blå). Alle betingelser ble målt tre ganger. Linjene representerer middelverdier + standardavvik (SD) (n = 3).ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53659/53659fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Opplysning Fil. 1: Mal BAS generell Klikk her for å laste ned denne filen.
Opplysning Fil. 2: Mal BAS Zeiss Leica importert data Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en detaljert protokoll for anvendelse av et nytt genetisk kodet gallesyre-sensor er i stand til å overvåke tid og rom dynamikken i gallesyretransport i levende celler. Denne biosensor omfatter cerulean og citrin fluorescerende proteiner som er kondensert til FXR-LBD, for derved å danne et FRET-baserte gallesyre sensor (BAS).
Den gallesyre Sensor er relativt enkel og praktisk i bruk når du har grunnleggende erfaring med cellekultur og FACS eller (konfokal) mikroskopi. Men noen aspekter krever litt feilsøking. Ved bruk av gallesyre-sensor i forbindelse med gallesyre transportører, er det anbefalt å dyrke celler i medium med trekull filtrert serum. Kull reduserer gallesyrer nivåene ytterligere ved adsorpsjon fra serumet. Spesielt i nærvær av importører som NTCP, er dette avgjørende for å hindre metning av sensoren i løpet av dyrkingen, siden dette er den mest vanlige årsaken til en ufølsom sensorunder forsøkene. Derfor ble en annen sensor opprettet (NucleoBAS N354K / I372V) som inneholder mutasjoner som endrer følsomheten for gallesyrer, og skaper en større dynamisk område 8. Å definere om sensoren allerede er mettet, kan citrin / cerulean ratio sammenlignes med forholdet i kontrollceller ikke uttrykker noen gallesyre-tilhengere, siden disse cellene antas å ha lav intracellulære gallesyrenivå. Alternativt kan fluorescens-levetid bildebehandling mikroskopi (FLIM) målinger utføres for å undersøke FRET i en intensitet uavhengig 12. Denne teknikken er utenfor omfanget av denne papir, og krever mer spesialisert utstyr. Andre grunner for en ufølsom sensor omfatter bruk av celler som er auto-fluorescerende og / eller har mistet NucleoBAS uttrykk. Av notatet, kan svingninger i intensitet cerulean og citrine (for eksempel på grunn av brenn skift) under forsøket tilsløre direkte visualisering av FRET endringer under bildebehandling, mensden ratiometrisk arten av sensoren fremdeles tillater overvåking av gallesyre dynamikk. Ofte absolutte intensitet endringer er beskjeden for de enkelte fluoroforene ved tilsetning av FXR-ligander, mens økningen i forholdet er tydelig.
For FRET analyse i celler transfektert med BAS sensor skal hensiktsmessig laserlys og filtre velges. Økningen på citrin intensitet under FRET må måles med den fiolette diode (405 nm) laser med utslippene overvåkes i løpet av 450-520 (cerulean) og 520-580 (citrine). Et viktig aspekt for å ta hensyn til er følsomheten til sensoren til fotobleking. Når intensiteten av en eller begge fluoroforer langsomt avtar i tid uten tilsetning av ligander, indikerer det ofte fotobleking. Dette fenomenet oppstår hovedsakelig når laseren strømmen er for høy. For å unngå denne uønskede effekt, bør lasere kraften ikke overstige 5% av full kraft, og cellene må holdes i mørke så mye som mulig. Begrensetid for å søke etter de riktige cellene. Svingninger i fluorescens intensitet kan også være forårsaket av fokal drift i z-aksen. For å motvirke dette kan pinhole størrelsen økes og det er tilrådelig å trekke ROIs ikke veldig nær cellen omkretsen.
Gnage sensor for gallesyrer har blitt testet i flere celletyper (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK og HEK293T celler) som kan transfekterte og har en stabil fenotype. Men primære og differensierte celler som hepatocytter er vanskelig å transfektere og for å opprettholde stabil i forhold til egenskaper. Viral transduksjon kan hjelpe med vanskelige å transfeksjon celler (konstruere tilgjengelig på forespørsel). Vi er for tiden å generere en mus linje for å tillate bruk av sensoren i nyisolerte primære celler som raskt dedifferentiate på isolasjon.
For å utføre det konfokale beskrevne forsøk, er det viktig at den valgte cellelinje er vedheftende til en kulturskål og vokser i et single celle laget. Imidlertid, celler som vokser i suspensjon, eller adherente celler som kan trypsinert ganske lett, kan også måles ved hjelp av FACS. Til slutt, er det anbefalt å velge en cellelinje uten endogene gallesyretransport eller syntese ved analyse av en bestemt transportveien. Dvs. når man måler aktiviteten til visse transfekterte (mutant) transportørproteiner.
Den presenterte genetisk kodet fluorescerende biosensor BAS er et verdifullt verktøy for å overvåke enkelt levende celle gallesyretransport. BAS inneholder en FXR-LBD som aktiveres av et stort utvalg av gallesyrer, slik avbildning av subcellulære dynamikken til gallesyrer 8. Dette gir en stor fordel i forhold til bruk av andre teknikker. For eksempel, i promoter-drevet luciferase reporter assays, er luciferase signal som er avhengig av stabiliteten av reporter i cellene, ikke støtter subcellulære informasjon, og krever ødeleggelse av prøven
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoBAS | Addgene | 62860 | |
| NucleoBAS | Addgene | 62861 | |
| Dulbecco's modified Eagles media (DMEM) | Lonza | BE12-614F | High glucose without L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin (pen/strep) | Lonza | 17-602E | |
| L-glutamine (200mM) | Lonza | 17-605E | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 102-70 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Lonza | CC-5012 | |
| T-25 cell culture flask | VWR international | 392-0253 | Laminin coated |
| T-175 cell culture flask | VWR international | 392-0238 | Laminin coated |
| 6-well plate | VWR international | 734-0229 | Poly-L-lysine and Laminin coated |
| 10 cm dish | VWR international | 392-0243 | Laminin coated |
| Diethylaminoethyl (DEAE) - Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Brunschwig | 23966-2 | |
| G418 (geneticin) 50 mg/ml | Invitrogen | 10131-027 | |
| Hygromycin B, 50 mg/ml | Invitrogen | 10687-010 | |
| Cloning cylinder (6 x 8 mm) | Bellco | 2090-00608 | |
| L-15 Leibovitz culture medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Polystyrene round bottom tube (5 ml) Facs tube | Falcon BD | 352008 | No cap, non-sterile |
| Falcon 2,063 tubes (5 ml) | Falcon BD | 352063 | Snap cap, sterile |
| Nunc Lab-Tek 8 well coverglass | Thermo scientific | 155409 | Sterile |
| Charcoal-filtered FBS | Life technologies | 12676011 | |
| GW4064 | Sigma-Aldrich | G5172 | |
| TCDCA | Sigma-Aldrich | T6260 | |
| CDCA | Sigma-Aldrich | C9377 | |
| Other chemicals | Sigma-Aldrich | n.v.t. |
References
- Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
- Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
- van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
- Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
- Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170 (2011).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).
