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Immunology and Infection

Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53672
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

Introduction

Équido herpesvirus-2 (EHV-2) está involucrado en un síndrome respiratorio, con posibles manifestaciones clínicas tales como la secreción nasal, faringitis y ganglios linfáticos inflamados 1-3. Este virus también es sospechoso de estar asociado con el pobre rendimiento de los caballos, que puede resultar en un impacto económico significativo y negativo para la industria del caballo 2.

Hasta ahora, el estándar de oro para gamma-EHV (γ-EHV) de detección fue el método de cultivo celular. El primer inconveniente de este procedimiento fue la ausencia de discriminación entre EHV-2 y otra γ-EHV (por ejemplo, EHV-5). El segundo inconveniente fue el lento desarrollo del proceso citopático, lo que lleva de 12 a 28 días para manifestar 4,5.

Desarrollo de una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real validado y normalizado (QRT-PCR) método ayudará a detectar rápidamente el virus, para discriminar entre EHV-2 y EHV-5 y para estudiar la relación entre la carga genoma viral y la enfermedad gracias al aspecto cuantificación.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue descrito por primera vez en 1986 por Mullis 6 y está a punto de convertirse en el nuevo estándar de oro en la mayor parte de los campos de diagnóstico biológico (humana, el medio ambiente y veterinaria). Este método, que se basa en la amplificación de una parte del genoma de agentes patógenos, presenta muchas ventajas: especificidad, sensibilidad y rapidez. Por otra parte, el riesgo de contaminación amplicón retrocedió desde el advenimiento de QRT-PCR y control de calidad 7. Sin embargo, el reconocimiento de la PCR como un nuevo método estándar de oro necesaria más que la mejora de los datos de rendimiento, sino también la demostración del control de desarrollo y validación pasos de todo el método sin degradación del rendimiento con el tiempo.

Las primeras herramientas moleculares utilizados para la detección de EHV-2 fueron el tiempo cla amplificación no específica onsuming e involucrado con la PCR anidada seguido por 8 de secuencia. Los genes específicos de los virus del herpes fueron el ácido desoxirribonucleico (ADN) polimerasa y DNA embalaje 9. Sin embargo, la PCR anidada presenta un alto riesgo de contaminación por amplicones. Desde entonces, las pruebas de PCR convencionales han sido diseñados para amplificar la interleucina gen 10 o de tipo B gen de la glicoproteína, revisado en 2009 2. Más recientemente, se han descrito las características de PCR en tiempo real para la cuantificación de EHV-2 10, pero no hubo datos disponibles en relación con la validación de todo el método que incluye el proceso de extracción.

En este protocolo, se describen los procedimientos de desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para la detección y cuantificación de ADN de EHV-2 en los fluidos respiratorios equino de acuerdo con la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) norma NF U47-600 3,11,12, que es el representante francés enla comisión de normalización internacional. Esta norma detalla los "Requisitos y recomendaciones para la implementación, desarrollo y validación de PCR veterinaria en el método de análisis de la salud animal" 11,12, según la norma NF EN ISO / CEI 17025 de 2005 y 13 de la OIE (Organización Mundial de Sanidad Animal) . recomendaciones de 2010 14 el protocolo de validación de QRT-PCR EHV-2 implica un procedimiento de tres partes: (a) el desarrollo de la QRT-PCR ensayo, (b) la caracterización de QRT-PCR ensayo solo y (c) la caracterización de la totalidad método analítico (de extracción de ácidos nucleicos de la muestra biológica para el análisis de PCR).

La caracterización de la QRT-PCR ensayo y del método de análisis conjunto incluye la definición de dos límites: el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). El LOD 95% PCR representa el menor número de copias de ácido nucleico por unidad de volumen que se pueden detectar en el 95% de todos los casES. El límite de cuantificación del 95% de PCR representa la menor cantidad de copias de ácidos nucleicos que pueden determinarse teniendo en cuenta las incertidumbres.

Este método QRT-PCR permite la detección precisa y rápida cuantificación de EHV-2 en los fluidos respiratorios. Además, el método se podría aplicar en otros laboratorios para garantizar un procedimiento estandarizado y plantilla como general para el desarrollo de otros nuevos ensayos de QRT-PCR.

Protocol

Nota: Consulte todos los diferentes pasos que se ilustran en la Figura 1.

1. Extracción de ácidos nucleicos

Nota: Realizar la extracción bajo una campana de extracción para limitar la contaminación de las vías respiratorias con ácidos nucleicos. Incluir un control negativo de la extracción con agua tratada con DEPC para asegurar que ninguno de los reactivos están contaminados con ADN no deseado.

  1. Extracto de ácidos nucleicos de la muestra biológica de acuerdo con un protocolo de protocolo 15 y el fabricante del anteriormente descrito.
    1. Añadir 140 l de muestra biológica a 560 l de solución de lisis (tampón AVL) y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Añadir 560 l de etanol. Aplicar los primeros 630 l de esta solución (solución de muestra + lisis + etanol) a una columna de sílice y se centrifuga.
    2. Aplicar los 630 l restantes de esta solución a la misma columna y centrifugar la sílice. A continuación, lavar la columna con 500 lde 2 tampones de lavado diferentes (AW1 y AW2).
  2. Eluir ácido nucleico con 50 l de tampón de elución (tampón AVE) y equilibrar a temperatura ambiente. Cerrar el tapón e incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Se centrifuga a 6.000 g durante 1 min.

2. Procedimiento de amplificación

  1. Preparar 22,5 l de mezcla de reacción para cada reacción. Añadir 12,5 l de PCR Master Mix, x l de cebador directo 20 M, x l de 20 mM cebador inverso, y l de la sonda 10 M y Z l de agua ultrapura según sea necesario para llegar a 22,5 l (x, se obtienen volúmenes y, z después de la titulación, véanse las secciones 3.2.3 y 3.2.6).
  2. Alícuota de 22,5 l de la mezcla de reacción apropiado a cada pocillo de reacción en una placa de 96 pocillos.
    Nota: Incluir los controles negativos para la extracción y para la PCR para asegurarse de que ninguno de los reactivos están contaminados con ADN no deseado.
  3. Añadir 2,5 l de la muestra, 2,5 l de negativ extracciónel control e, 2,5 l de control negativo de PCR y 2,5 l de muestra positiva (cepa de referencia o plásmido) a la reacción correspondiente también. Después de la distribución, cubrir la placa con una lámina adhesiva placa. Se centrifuga la placa durante 10 segundos a 6.000 g.
  4. Colocar la placa en un sistema de PCR en tiempo real. Seleccione la plantilla para el diseño del ensayo y empezar la carrera. Utilice el ajuste de programa de PCR: 10 min a 95 ° C seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C (Tabla 1).
  5. La transferencia de los datos en bruto del sistema de PCR en tiempo real a una hoja de cálculo. Establecer el umbral en las gráficas de amplificación por encima de la línea de base y dentro de la región de crecimiento exponencial para obtener el ciclo umbral para cada muestra. Trazar cada estándar de punto de ajuste como una curva estándar para obtener la linealidad. Calcular el número de copias para las diferentes muestras en base a la curva estándar.

3. Desarrollo de la RT-PCR cuantitativa

Nota: El desarrollo de una prueba de QRT-PCR requiere cepas de referencia, un plásmido titulada específica, y diferentes controles e implica la valoración de los cebadores y la sonda.

  1. Prueba preliminar
    1. Diseño cebadores y sondas con software específico de acuerdo a las recomendaciones anteriores 16.
    2. Extracto de las cepas de referencia como se describe en la sección 1.
    3. Amplificar como se describe en la sección 2 con 900 nM para la concentración final de cebadores y 250 nM para la concentración final de la sonda. Analizar la señal como se describe en la sección 2.5.
    4. Al mismo tiempo, realizar la amplificación de las cepas de referencia de ADN (como se describe en la sección 3.1.3) sin sondas. Secuenciar los amplicones obtenidos por el método de Sanger 17,18. Analizar las secuencias mediante la ejecución de un nucleótido BLAST 19.
  2. La titulación de cebadores y la sonda
    1. Preparar 3 mezclas diferentes con 250 nM de concentración final de la sonda y con diferentes concentr definitivaciones de la cebadores directo e inverso (50 nm / 50 nm, 300 nm / 300 nm, 900 nm / 900 nm) durante las 3 repeticiones de la muestra positivo y un control negativo. Para cada mezcla, añadir el mismo volumen apropiado de cebador directo 20 M y 20 M cebador inverso (0,25 l para obtener la concentración final de 50 nM, 1,5 l para obtener los 300 nM de concentración final o de 4,5 l para obtener la concentración final 900 nM) , 50 l de PCR master mix, 2,5 l de sonda 10 M y agua ultrapura según sea necesario para llegar a 90 l.
    2. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
    3. Elige la mejor condición para obtener el más alto nivel de amplificación, primer ciclo umbral (Ct) y mejor repetibilidad entre las 3 condiciones. Determinar la mejor concentración y el correspondiente volumen x l de la adelante y atrás primers.
    4. Preparar 5 mezclas diferentes para las 4 muestras (3 réplicas de la muestra positiva y un control negativo)con 5 concentraciones finales diferentes de sonda (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). Para cada mezcla, agregar x l de 20 mM cebador directo y x l de 20 mM cebador inverso (determinado previamente, en la sección 3.2.3), 50 l de mezcla de PCR principal, el volumen apropiado de la sonda 10 M (0,5 l para obtener el 50 concentración nM, 1 l para obtener la concentración 100 nM, 1,5 l para obtener la concentración 150 nM, 2 l para obtener la concentración 200 nM o 2,5 l para obtener el 250 concentración nM) y agua ultrapura según se requiera para alcanzar los 90 l.
    5. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
    6. Elige la mejor condición para obtener el más alto nivel de amplificación, primer ciclo umbral (Ct) y mejor repetibilidad entre las 5 condiciones. Determinar la mejor concentración y el correspondiente volumen y l para la sonda.

4. Caracterización de Quantitative Real-PCR en tiempo (QRT-PCR)

Nota: Después de la etapa de desarrollo y la determinación de las mejores condiciones de uso, el paso de caracterización de la PCR incluye la especificidad, el límite de detección, el rango de linealidad y el límite de cuantificación de QRT-PCR.

  1. Preparación y titulación de plásmido
    1. Ordenar plásmido comercial que contiene el fragmento correspondiente del gen diana de ADN elegido para la PCR (en este protocolo, los nucleótidos 2081-2381 de EHV-2 gen de la glicoproteína B, véase la Tabla 1).
      Nota: Para limitar el riesgo de contaminación de las vías respiratorias con ADN sintético, realizar diluciones seriadas de plásmidos bajo una campana de extracción en una habitación separada y trabajar con ADN diluido durante todas las etapas de desarrollo y procedimiento de validación.
    2. Vuelva a suspender el plásmido con agua ultrapura para preparar una solución madre a 50 ng / ml. Vortex y centrifugar brevemente la solución de plásmido de valores.
      Nota: Determinar la concentración real de la sto plásmidosolución ck después de re-suspensión con el fin de calcular el número de copias del plásmido.
    3. Añadir 1 l de plásmido para el espectrofotómetro. Leer la densidad óptica (DO) a 230 nm, 260 nm y 280 nm. Leer el valor de la concentración de ADN en el software espectrofotómetro (OD, 260 nm).
    4. Calcular el número de copias del plásmido utilizando el número de Avogadro (N A) y la fórmula:
      El número de copias / l = (N A [plásmido en ng / l]) / (plásmido de longitud x 10 9 x peso medio de un par de bases) = (6,022 x 10 23 x [plásmido]) / (longitud plásmido x 10 9 x 660)
  2. Prueba de la especificidad (inclusividad y exclusividad) de QRT-PCR
    1. Prueba de la inclusión del sistema de PCR. Las muestras de ADN positivos seleccione 2-EHV, previamente caracterizado por secuenciación (establecido el estado positivo).
    2. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
    3. analizar lalos datos de PCR para cada muestra como se describe en la sección 2.5. Compruebe la presencia de una curva exponencial para todas las muestras elegidas en la sección 4.2.1 y confirmar la inclusión de la PCR.
    4. Prueba de la exclusividad del sistema de PCR utilizando extractos de ADN de los patógenos con similitudes genéticas al objetivo (en este caso, otros herpesvirus de équidos, tales como EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 y asnal herpesvirus-5 como se describe en la Tabla 2) y otros patógenos implicados en las enfermedades respiratorias del huésped (en este caso, el virus de la arteritis equina, virus de la gripe equina, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus y Klebsiella pneumoniae, véase la Tabla 2).
    5. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
    6. Analizar los datos de PCR para cada muestra como se describe en la sección 2.5. Comprobar la ausencia de una curva exponencial para todas las muestras elegidas enla sección 4.2.4 para confirmar la exclusividad de la PCR.
  3. Límite de Detección de QRT-PCR
    1. Prescindir de 90 l de agua ultrapura en 6 tubos.
    2. Realizar 6 diluciones en serie de diez veces del plásmido para dirigir la zona de reducción (pérdida de detección de Ct). Transferencia de 10 l de la dilución de trabajo plásmido al tubo con 90 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 4.3.2 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido el plásmido.
    3. Realizar la amplificación de las 6 diluciones seriadas de diez veces del plásmido como se describe en la sección 2.
    4. Determinar la zona de reducción: la zona entre la última dilución de plásmido que presenta una señal positiva y la primera dilución sin detección (véase la Figura 2).
    5. Para iniciar las diluciones seriadas de dos veces 6, seleccione la última dilución de plásmido que da una señal positiva (véase la sección 4.3.4).
      Nota: Realizar 3 tri independienteALS para determinar el límite de detección de QRT-PCR (LOD 95% PCR)
    6. Prescindir de 25 l de agua ultrapura en 6 tubos.
    7. Realizar 6 diluciones en serie de dos veces del plásmido. Transferencia de 25 l de la dilución de trabajo plásmido, como se indica en el punto 4.3.5, al tubo con 25 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 4.3.7 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido el plásmido.
    8. Realizar la amplificación de las 6 diluciones seriadas de dos veces del plásmido como se describe en la sección 2. Repita los pasos 4.3.7 a 4.3.8 en dos ocasiones, para obtener 3 ensayos con 8 repeticiones (24 repeticiones) de cada uno de los 6 diez veces diluciones en serie del plásmido.
      Nota: El límite de detección de QRT-PCR (LOD 95% PCR) se define como el número más bajo de copias de ADN por unidad de volumen que se detecta en 95% de los casos.
    9. Calcular el número de repeticiones positivas de 24 repeticiones para cada nivel de concentración plásmidoción.
    10. Determinar el límite de detección del 95% de PCR. El LOD 95% PCR es el nivel que da como resultado la detección de 23 repeticiones positivas de 24 repeticiones.
  4. Rango de linealidad y límite de cuantificación de QRT-PCR
    Nota: Realice 4 ensayos independientes con 6 diluciones en serie de diez veces del plásmido para asegurar que la concentración más baja utilizada en la gama corresponde a la LOD 95% PCR determinado previamente en 4.3.10.
    1. Prescindir de 45 l de agua ultrapura en 6 tubos.
    2. Iniciar los 6 diluciones en serie de diez veces con la concentración de la dilución de trabajo plásmido correspondiente a 10 7 95% LOD PCR.
    3. Realizar 6 diluciones en serie de diez veces del plásmido. Transferencia de 5 l de la dilución de trabajo plásmido (determinado en la sección 4.4.2) al tubo con 45 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 4.4.3 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido plasmid.
    4. Amplificar las 6 diluciones seriadas de diez veces del plásmido como se describe en la sección 2.
    5. Trazar la regresión lineal y = ax + b con a para la pendiente y b para la intersección (Figura 3).
    6. Calcular la eficiencia de amplificación (E) a partir de la pendiente de una curva estándar (véase 4.4.5) usando la ecuación:
      4.4.6 .
      Repita los pasos 4.4.1 a 4.4.6 tres veces.
      Nota: La amplificación de eficiencia representa la cantidad de aumento de producto de PCR después de cada ciclo. Una reacción ideales alcanza eficacia cercana al 100%. En la práctica, E (%) fue entre 75% y 125%. Superior E puede indicar la amplificación de productos no específicos o un error de pipeteado en la dilución en serie. E más baja también puede indicar un error de pipeteado en la dilución en serie, un mal diseño de cebadores o condiciones de reacción no óptimas.
    7. Calcular el sesgo (Tabla3). Verificar para cada nivel de plásmido que el valor de polarización absoluto es menor que el valor de polarización crítica (0,25 log 10). Determinar el sesgo de la media y las incertidumbres de linealidad (T lini) para cada nivel de plásmido (Tabla 3) para evaluar el desempeño de la regresión lineal para EHV-2 qPCR (Figura 4). T Lini es la incertidumbre linealidad determinado para cada i plásmido nivel calculado a partir de la desviación estándar (SD'i) y la media de sesgo. Determinar la incertidumbre linealidad combinada (U LIN) de EHV-2 qPCR dado por la fórmula:
      4.4.7
      Nota: La aceptación de sesgo se especifica por el laboratorio (en sesgo general absoluta de 0,25 log 10) y corresponde a la diferencia entre el valor inferior y el valor más alto de 0,5 log 10 (magnitud medida en log10 del número de copias). U LIN
    8. Determinar el límite de cuantificación de la qRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR es la concentración más baja con un sesgo 0,25 log 10 utilizado para el rango de linealidad (Tabla 3).

5. Caracterización del Método Analítico Total (desde Extracción de ADN al resultado QRT-PCR)

Nota: La caracterización de la totalidad del método es la validación de todas las medidas necesarias para obtener datos QRT-PCR (es decir, desde la extracción de ADN de la muestra respiratoria (ver sección 1) para la amplificación y cuantificación del objetivo (véase la sección 2 )).

  1. Establecer correspondencia entre el número de copias en la reacción de PCR y el número de copias presentes en la muestra biológica con la fórmula:
    5.1-1 .
    los 5.1-2 es el volumen de la muestra añadido a la mezcla de RCP para la amplificación, 5.1-4 es el volumen de tampón AVE para eluir los ácidos nucleicos y 5.1-5 es el volumen de la muestra extraída.
  2. Prueba de la sensibilidad y especificidad del método analítico Total
    Nota: Sólo las muestras conocidas de EHV-2 positivos (o negativos) se utilizan en esta sección.
    1. Prueba de la "sensibilidad" del método de QRT-PCR mediante el análisis de muestras positivas para el objetivo (EHV-2).
      1. Las muestras de ADN positivos seleccione 2-EHV, caracterizado previamente (estado positivo).
      2. Extraer el ácido nucleico como se describe en el apartado 1. Realizar un procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      3. Determinar el número de positivos verdaderos (muestras positivasque son positivos con esta RT-PCR) y el número de falsos negativos (conocido muestras positivas que son negativas con este RT-PCR).
    2. Prueba de la "especificidad" del método QRT-PCR mediante el análisis de las muestras negativas
      1. Las muestras de ADN negativas seleccione 2 EHV-(estado negativo).
      2. Extraer el ácido nucleico como se describe en el apartado 1. Realizar un procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      3. Determinar el número de negativos reales (muestras negativas que se sabe que son negativa con este RT-PCR) y el número de falsos positivos (muestras negativas conocidas que son positivos con esta RT-PCR).
    3. Se calcula la "sensibilidad diagnóstica" (Se) y "especificidad diagnóstica" (Sp) de la totalidad del método (Tabla 4) de la siguiente manera: Se = número de positivos verdaderos / (número de positivos verdaderos + falsos negativos) y Sp = número de bienes negativos / (número de aspecto negativos + falsos positivos) (ver Tabla 4).
    4. Calcular el intervalo de confianza del 95% para la sensibilidad y la especificidad de todo el método con la fórmula de Greiner y Gardner relación 12,20:
      5.2.4
      donde e es el error estimado, θ es el Se (o Sp) y n el número de muestras analizadas.
      Nota: Para un pequeño número de muestras, utilizar la tabla de Schwartz según la norma AFNOR 12 para calcular el intervalo de confianza del 95% para la sensibilidad y la especificidad de todo el método.
  3. Preparación del material negativo de los recursos para la caracterización del Método Analítico Total
    PRECAUCIÓN: Para determinar los límites de detección y cuantificación de todo el método (Método LOD y el Método LC), añadir concentraciones conocidas de plásmido de las muestras biológicas que se sabe que son libresdel objetivo (EHV-2 en este caso). Estas muestras, junto con el plásmido cuantificada, constituyen normas positivas con la que determinar el método de LOD y el Método LOQ.
    1. Confirmar la ausencia de diana (EHV-2) en las muestras biológicas utilizadas para construir estándares positivos.
      1. Elegir diferentes muestras biológicas negativas conocidas.
      2. Extraer muestras biológicas como se describe en la sección 1. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      3. Confirmar la ausencia de la diana por la ausencia de señal de PCR en estas muestras.
        Nota: Utilice el mismo material negativo de los recursos de todos los pasos entre 5.4 y 5.5.
    2. Se combinan las diferentes muestras negativas para obtener 15 ml de material de referencia negativo (un volumen necesario para la validación completa). Prescindir de 135 l de este material negativo de los recursos en 100 tubos. Mantenga los tubos a 4 ° C oa -80 ° C durante un almacenamiento prolongado.
  4. Limit de Detección del Método Analítico Total
    1. Determinar la zona de abatimiento de todo el método.
      1. Prescindir de 45 l de agua ultrapura en 6 tubos.
      2. Realizar 6 diluciones en serie de diez veces del plásmido. Transferencia de 5 l de la dilución de trabajo plásmido correspondiente a 10 7 95% LOD PCR (como se determina en el apartado 4.3.10) al tubo con 45 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 5.4.1.2 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido plásmido.
      3. Transferir 5 l de cada dilución de plásmido de 2 tubos con 135 l de material negativo de los recursos para obtener 2 replica para los 6 estándares positivos. Vortex y centrifugar brevemente.
      4. Realizar la extracción de los 2 repeticiones para los 6 estándares positivos como se describe en la sección 1. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      5. Determinar la zona de reducción: la zona entre la última concentration del plásmido dar una señal positiva y la primera concentración que no muestra ninguna señal.
    2. El límite de detección del método (Método LOD) Determinado por 2 ensayos independientes
      Nota: Realizar 2 ensayos independientes para determinar el límite de detección de todo el método (LOD Method).
      1. Iniciar las 6 diluciones seriadas de dos veces con la dilución de trabajo plásmido que es 4 veces más concentrada que la última concentración del plásmido que dio una señal positiva (véase la sección 5.4.1.5).
      2. Prescindir de 25 l de agua ultrapura en 6 tubos.
      3. Realizar 5 diluciones en serie de dos veces del plásmido. Transferencia de 25 l de la dilución de plásmido de trabajo (según lo determinado en el apartado 5.4.2.1) al tubo con 25 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 5.4.2.3 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido plásmido.
      4. Transferencia de 5 l de cada dilución de plasmid para 4 tubos con 135 l de material negativo de los recursos para obtener 4 réplicas de las 5 normas positivas. Vortex y centrifugar brevemente los tubos.
      5. Realizar la extracción de los 4 repeticiones para los 5 estándares positivos como se describe en la sección 1. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      6. Repita los pasos 5.4.2.1 a 5.4.2.5 una vez para obtener 8 repeticiones para cada nivel de concentración de plásmido.
      7. Contar el número de réplicas positivas de 8 repeticiones para cada nivel de concentración de plásmido.
      8. Determine el método LOD. El método LOD es el último nivel en el que 8 repeticiones de 8 repeticiones son positivos (como se describe en el apartado 5.4.2.7).
  5. Rango de linealidad y límite de cuantificación del método analítico Total
    Nota: Para determinar el límite de cuantificación de la totalidad del método (LOQ Método), añadir concentraciones conocidas del plásmido a biológicaLas muestras que se sabe que están libres del objetivo (EHV-2 en este caso). Estas muestras constituyen normas positivas para determinar el método LC.
    1. Prescindir de 45 l de agua ultrapura en 6 tubos.
    2. Realizar 6 diluciones en serie de diez veces del plásmido. Transferencia de 5 l de la dilución de trabajo plásmido correspondiente a 10 7 LOD Método (tal como se determina en el apartado 5.4.2.8) al tubo con 45 l de agua ultrapura. Vortex y centrifugar brevemente el tubo. Repita el paso 5.5.2 hasta el último tubo en la dilución en serie ha recibido el plásmido.
    3. Transferir 5 l de cada dilución del plásmido de 2 tubos con 135 l de material negativo recurso biológico para obtener 2 repeticiones de los 6 estándares positivos. Vortex y centrifugar brevemente.
    4. Realizar la extracción de los 2 repeticiones para los 6 estándares positivos como se describe en la sección 1. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2. Repita los pasos 5.5.1a 5.5.4 tres veces.
    5. Definir un perfil de precisión con el fin de evaluar y validar los resultados cuantitativos del método.
      1. Definir los límites de aceptabilidad de todo el método para el laboratorio. En este protocolo, los límites de aceptabilidad se definen como ± 0,75 log10 por el Labeo Frank Duncombe.
      2. Para un ensayo, trazar una primera regresión lineal y = ax + b (a es la pendiente y b es el intercepto) con una réplica de los valores de Ct correspondiente a cada valor estimado de la curva estándar. Con esta primera regresión lineal, calcular el valor experimental del número de copias de las repeticiones de los valores de Ct se utilizan para este primera curva estándar. Repita el paso 5.5.5.2 con las segundas repeticiones de los valores de Ct obtenido a una segunda regresión lineal y se calcula el valor experimental del número de copias de las segundas repeticiones de los valores de Ct se utilizan para la segunda curva estándar.
      3. Calcular los límites de precisión, veracidad y exactitud para cada nivel plásmido de acuerdo con NF U47-600-2 12.
      4. Crear una hoja de cálculo para recopilar la información para todos los puntos estándar (5.5.5.4) y crear un perfil con exactitud los límites de aceptabilidad previamente definidos en 5.5.5.1 y la veracidad de los datos, junto con la precisión de los límites inferior y superior como se calcula en 5.5 .5.4 (Figura 5).
    6. Determinar el Método LOQ: esto corresponde a la concentración más baja de una curva estándar con veracidad 0,75 log 10 tal como se utiliza para el rango de linealidad calculado en 5.5.5.5.
  6. Evaluación de la repetibilidad y la reproducibilidad
    Nota: Compruebe la repetibilidad y reproducibilidad utilizando el cociente entre la desviación estándar y la media de mediciones repetidas (coeficiente de variación, CV o = desviación estándar /media).
    1. Evaluar la repetibilidad del método entero por 1 Analista:
      1. Elija 3 muestras biológicas con 3 cargas genoma viral distintos (previamente probados en PCR, por ejemplo).
      2. Extraer 8 réplicas de las 3 muestras como se describe en la sección 1. Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2.
      3. Calcular la media y la desviación estándar del valor Ct recogida para cada muestra.
      4. Calcular la CV intra-ensayo usando la fórmula CV = desviación estándar / media.
    2. Evaluar la reproducibilidad del método entero mediante 3 Analistas:
      1. Elige 3 muestras biológicas con 3 cargas genoma viral distintas (probados anteriormente en la PCR, por ejemplo)
      2. Extraer 2 repeticiones de las 3 muestras elegidas en 5.6.2.1 (como se describe en la sección 1). Realizar el procedimiento de amplificación tal como se describe en la sección 2. Repita los pasos 2 5.6.2.2 por analistas independientes.
      3. Calcular la media y la desviación estándardel valor Ct recogida para cada muestra.
      4. Calcular la CV inter-ensayo usando la fórmula CV = desviación estándar / media.

Representative Results

El método RT-PCR cuantitativa, como se describe anteriormente, se llevó a cabo para detectar y cuantificar équido herpesvirus-2 en los fluidos respiratorios. Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de trabajo esquemático para el desarrollo y la validación de un método de RT-PCR cuantitativa según la norma AFNOR NF U47-600. La especificidad de los cebadores y sondas fueron validados durante el desarrollo paso a paso de la PCR. Sólo EHV-2 cepas se amplificaron en este sistema. Posteriormente, el rendimiento de la qRT-PCR tuvo que ser caracterizado.

En primer lugar, para estimar la LOD PCR, una dilución en serie de diez veces 6 se realizó para establecer la zona de reducción (Figura 2). En este ejemplo, se realizaron 6 diluciones en serie de diez veces entre 10 y 10 -5 -10 (entre 26.000 y 0,26 copias / 2,5 l de muestra) para estimar la PCR LOD. La zona de reducción de lIES entre diluciones de 10 -9 y 10 -10 (entre 2,6 y 0,26 copias / 2,5 l de muestra). Para determinar el valor LOD PCR en este caso, 6 diluciones en serie de dos veces del plásmido se hicieron en esta zona de reducción de entre 5,2 y 0,16 copias / 2,5 l de muestra. El valor de LOD PCR fue de 2,6 copias / 2,5 l de muestra.

Para determinar el rango de linealidad y LOQ PCR, se utilizó el valor LOD PCR para iniciar el intervalo de 6 diluciones en serie de diez veces, entre 2,6 (LOD PCR) y 260.000 copias / 2,5 de la muestra l. La figura 3 ilustra una regresión lineal para el EHV2 QRT-PCR a partir de un ensayo. Las actuaciones de regresión lineal (Figura 4) son validadas por cuadruplicado utilizando los cálculos descritos en la Tabla 3. Los cálculos se realizan para definir el rango de linealidad de acuerdo con los criterios de Bias absoluta i value ≤ 0,25 log 10, cualquiera que sea el nivel de carga i plásmido. En este caso, la linealidad range yacía entre 2.6 y 2.5 260.000 copias / l de la muestra. El límite de cuantificación de PCR es la concentración más baja en el rango de linealidad (es decir, 2,6 copias / 2,5 l de muestra en este caso). U LIN se determinó que era de 0,12 log 10 en el rango 2.6-260,000 copias / 2,5 l de ADN.

Después del desarrollo (Figura 1, azul) y la caracterización de la qRT-PCR (Figura 1, amarillo), la norma AFNOR NF U47-600 recomienda caracterización de todo el método de análisis de la extracción de ADN para QRT-PCR (Figura 1, naranja). La sensibilidad y especificidad diagnóstica se calcularon como se describe en la Tabla 4. Se evaluó Las representaciones cuantitativas del método analítico toda QRT-PCR y validados con un perfil de precisión (

Este protocolo, que utiliza tecnología molecular del estado de la técnica, nos permitió detectar y cuantificar la carga viral del genoma del VHE-2 en 172 muestras de frotis nasales obtenidos de caballos con problemas respiratorios y / o sospecha clínica de infección. La incidencia de EHV-2 a partir de muestras de campo (biológicos) fue del 50% (86/172) en esta población. Los análisis cuantitativos mostraron que las cargas virales del genoma de EHV-2 fueron significativamente mayores en los caballos jóvenes y el reparto de las cargas del genoma viral disminuyeron con la edad (Figura 6). En el presente estudio, se detectó la mayor carga viral EHV-2 genoma (1,9 x 10 11 copias / ml) en los potros (Figura 6).

Figura 1
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo para el desarrollo (azul), la caracterización de la RT-PCR cuantitativa(amarillo) y la caracterización de todo el método de análisis de la extracción de ADN para QRT-PCR (naranja) de acuerdo con la norma AFNOR NF U47-600-2. El diagrama de flujo de trabajo resume los distintos pasos para el desarrollo, la caracterización de la RT cuantitativa -PCR y la caracterización de todo el método de análisis de la extracción de ADN para QRT-PCR. Para cada paso, el gráfico de flujo de trabajo indica el número de pasadas requeridas, las diluciones que se llevan a cabo y el número de analistas requeridos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Determinación de la zona de reducción con resultados representativos de curvas en tiempo real de PCR obtenidos con 6 diluciones en serie de diez veces de plásmido. Para estimar la zona de reducción, serie 6 de diez vecesdiluciones se realizan entre 10 -5 (26.000 copias / 2,5 l de muestra) y 10 -10 (0,26 copias / 2,5 l de muestra). La zona de reducción se encuentra entre diluciones de 10 -9 (2,6 copias / 2,5 l) y la muestra 10 -10 (0,26 copias / 2,5 l de muestra). En este caso, 6 diluciones seriadas dobles de plásmido se hicieron en esta zona de reducción para determinar el límite de detección del 95% de PCR, entre 5,2 y 0,16 copias / 2,5 l de muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. La regresión lineal para EHV2 QRT-PCR La linealidad de los ensayos cuantitativos es la capacidad de generar resultados que son proporcionales a la concentración de la diana presente en un rango específico. Esto puede ser modelado porregresión lineal (y = ax + b) entre la respuesta instrumental (umbral de ciclo o Ct) y el logaritmo de la cantidad de la diana (número de copias diana / 2.5 de la muestra l). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .

Figura 4
Figura 4:. Rendimiento de la regresión lineal de EHV-2 qPCR La media de sesgo representan la diferencia media entre la cantidad de plásmido medido ( fig4-1 ) Y la cantidad teórica plásmido (x 'i) para cada nivel de plásmido. Las barras verticales representan la incertidumbre linealidad (T lini) dada por la fórmula
fig4-2
donde SD'i es la desviación estándar o f plásmido cantidad medida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. Perfiles de precisión en base a los resultados de la validación del método de EHV-2 QRT-PCR La línea verde (círculos) representa la veracidad de los datos (error sistemático o sesgo). Los límites de aceptabilidad se definen a ± 0,75 log10 por el laboratorio (líneas discontinuas). Se determinaron los límites de precisión inferior y la parte superior de cada nivel de carga de plásmido a partir del sesgo media ± dos veces la desviación estándar de los datos de fiabilidad (líneas rojas). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 "> Figura 6
Figura 6:. La cuantificación de la carga viral del genoma de EHV-2 de acuerdo con la edad La distribución de la carga viral del genoma del VHE-2 detectada en muestras de frotis nasales está representado por los diferentes grupos de edad. Las líneas horizontales representan los valores medios dentro de la desviación estándar (m = mes). * Significativamente diferente por ANOVA con la prueba post-hoc de Newman-Keuls (p <0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

gen diana Imprimaciones, secuencias de la sonda y plasmide (5'-3 ') la posición de nucleótido Tamaño del producto (nucleótidos) referencias
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		Adelante: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11
Reverso: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 seg 45 ciclos
Sonda: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min
plásmido:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

Tabla 1:. Las secuencias de los cebadores, sondas y controles positivos de ADN sintéticos utilizados en este protocolo La secuencia del plásmido (ADN sintético positivo) corresponde a las posiciones de nucleótidos 2081-2381 de la secuencia EHV2gB (HQ247755.1). El diseño de cebadores y sondas utilizadas en este protocolo se obtuvo mediante el uso de software específico.

PATÓGENOS Referencia (origen) Número de cepas RESULTADOS
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) Positivo
20 muestras (colección FDL)
EHV-5 KD05 (Gerc) 20 Negativo
20 muestras (colección FDL)
EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativo
T934 WSV (Gerc)
EHV-1 cepa Kentucky Ky A (ATCC) 3 Negativo
2 muestras (colección FDL)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativo
Asinine herpesvirus AHV5 FDL Colección 1 Negativo
EquinoVirus de la gripe A / equino / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativo
(Número de Acceso JX091752)
Virus de dicha enfermedad VR796 (ATCC) 2 Negativo
Rhodococcus equi FDL Colección 1 Negativo
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus FDL Colección 1 Negativo
Streptococcus equi subsp. equi FDL Colección 1 Negativo
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativo
Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativo
pneu Klebsiellamoniae FDL Colección 1 Negativo

Tabla 2: Especificidad analítica de QRT-PCR para EHV-2.

Tabla 3
Tabla 3: Cálculo del sesgo y la incertidumbre linealidad (adaptado de NF U47-600-2 12). Para cada ensayo, las actuaciones de regresión lineal (y = ax + b) se validan mediante la tabla donde y es el ciclo umbral obtenido; a es la pendiente obtenida;. X es el nivel de plásmido y b es la intersección i es el plásmido nivel (i varía de 1 a niveles K); k es el número de niveles de plásmido utilizado (por ejemplo, k = 6 en tsu mesa); j es el ensayo (j varía de 1 a I de los ensayos); I es el número de ensayos, comprendida entre los 3 y 6 ensayos (por ejemplo, I = 4 en esta tabla) x i es la cantidad de plásmido estimada para cada uno. i plásmido nivel. x 'i es la cantidad teórica plásmido obtenido con la ecuación x' i = log 10 (x i) para cada i plásmido nivel. Durante cada ensayo j, el ciclo umbral obtenido para cada i nivel plásmido se calcula con la regresión lineal y i, j = a j x i, j + b j. table3-1 es la cantidad de plásmido medida durante el ensayo j. i Bias sub> es la diferencia observada entre la cantidad de plásmido medido y la cantidad teórica plásmido para cada ensayo y cada nivel plásmido. table3-2 es el valor medio de table3-3 por cada i plásmido nivel; SD 'i es la desviación estándar de la cantidad medida table3-4 para cada i nivel plásmido; sesgo La media es la media de sesgo i; T Lini es la incertidumbre linealidad determinado para cada i plásmido nivel calculado de SD'i y decir sesgo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-con-next.within-page =" always "> el estado real de la muestra Positivo Negativo Los resultados obtenidos con el método de conjunto Positivo RP (real positiva) FP (falso positivo) Negativo FN (falso negativo) RN (real negativa) Total RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Tabla 4:. Cálculo de la sensibilidad diagnóstica (Se) y especificidad (Sp) de todo el método de una tabla de Schwartz se utilizó para calcular la confidintervalo de ENCE en 95% de sensibilidad y especificidad de todo el método como se describe en NF U47-600-2.

Discussion

Desde la década de 2000, PCR en tiempo real ha estado reemplazando las técnicas estándar de oro (cultivo celular y los métodos de cultivo de bacterias) en un número creciente de laboratorios. Aplicación de la técnica es relativamente fácil. Sin embargo validación de métodos de laboratorio es esencial para la detección y cuantificación molecular de patógenos para asegurar que los datos precisos, repetibles y fiables.

Desde la etapa de extracción es la fuente principal de pérdida de material biológico, se puede considerar la principal fuente de error de cuantificación entre un protocolo y otro. Como tal, la creación de una curva estándar de plásmido de ADN durante la qRT-PCR, informado principalmente en la literatura, indica la carga viral del genoma, pero no tiene en cuenta la etapa de extracción.

Descripción de una estrategia de novo para un proceso de validación del método en toda la norma AFNOR NF U47-600-2 representa un avance significativo en esta área. Como se ilustra eneste documento para EHV-2 en caballos, o por otras abejas 21, esto requiere una clara diferenciación entre la etapa de desarrollo y la etapa de validación de la caracterización de la PCR y caracterización de todo el método. Una limitación de este enfoque interesante es que cualquier cambio en el protocolo dará lugar a la obligación de revalidar el proceso completo que podría ser muy costosa. Esta limitación también se puso de relieve por el hecho de que los límites de cuantificación dependen de la fuente de la que el virus se extrae (por ejemplo, los fluidos respiratorios, órganos, sangre u orina). De hecho, cada matriz presenta diferentes especificidades en sus características físico-química, y es importante para definir independientemente cada matriz diferente utilizado para la detección y cuantificación viral mediante qRT-PCR. Por lo tanto, la carga viral del genoma de cada muestra biológica se puede cuantificar con mayor precisión de la extracción. La caracterización también tiene en cuenta el mod termocicladorEL y cuando el uso de un método previamente bien caracterizado (por ejemplo, el método de qPCR EHV-2 se describe en este documento) requiere un nuevo tipo de máquina en el laboratorio de los padres u otro laboratorio, hay que confirmar el funcionamiento de ese instrumento. La confirmación de los resultados de un ensayo de qPCR es un requisito previo para todas las pruebas poner en un laboratorio. Esto se consigue normalmente mediante el análisis de una muestra de referencia con propiedades conocidas. Esta comprobación es un requisito obligatorio y considerado conforme a lo solicitado por la norma NF 47-600-1 AFNOR con el fin de validar el funcionamiento de la (eficiencia LOD, LOQ) qPCR y la solidez de todo el método (LOD, LOQ). No sólo durante las etapas de desarrollo y la caracterización, sino también cuando se utilizan en investigación o con fines de diagnóstico, los factores de riesgo pueden ser identificados y bien controlados para asegurar la normalización del protocolo. De particular preocupación es la formación del personal adecuado, con personal altamente calificado, el control de calidad de los consumiblesutilizados y su almacenamiento, el control de las condiciones ambientales inmediatos y conocimiento de las condiciones metrológicas que pueden afectar el rendimiento de los instrumentos científicos que participan en el ensayo. El uso de muestras de referencia para las comparaciones entre laboratorios también podría ayudar a controlar las incertidumbres. De esta manera, la comparación de datos entre laboratorios puede ser facilitada. De hecho, las pruebas de competencia entre laboratorios son esenciales para evaluar y confirmar la reproducibilidad del método.

resultados de la carga viral del genoma que se expresan en unidades internacionales (UI) de la matriz biológica analizada (UI: copias / ml para líquidos o copias / g para los tejidos) son más fáciles de utilizar con el fin de comparar los resultados entre diferentes laboratorios. Todos los resultados anteriores el límite de cuantificación se expresan como copias / ml y el resultado entre el LD y LC se toma como un resultado positivo no cuantificables. La presentación de datos cuantificacionales del genoma de esta manera se ajusta con mayor precisión a los process de análisis (amplificación del genoma). De hecho, en experimentos de cultivo celular, la expresión de la carga viral por TCID 50 (tejido mediana cultura dosis infecciosa) depende de la naturaleza de las células y cepas de virus. Cada línea cepa posee su cinética de infección únicos y algunos virus como el EHV-2 puede tomar varios días antes de que el primer efecto citopatogénico es evidente.

En conclusión, este nuevo método de caracterización de QRT-PCR debe facilitar la armonización de la presentación e interpretación de datos entre laboratorios. Esto será muy útil para posibles nuevas aplicaciones de QRT-PCR en el futuro como el establecimiento de un valor de corte para la declaración del estado de la enfermedad en lugar de simplemente la presencia o ausencia del patógeno.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film qPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 

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References

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Desarrollo y validación de un método de PCR cuantitativa para Equid herpesvirus-2 Diagnóstico en los flujos respiratorios
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