Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53672
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

Introduction

Hästdjur herpesvirus-2 (EHV-2) är inblandad i en respiratorisk sjukdom, med potentiella kliniska manifestationer, såsom nästäppa, faryngit och svullna lymfkörtlar 1-3. Detta virus är också misstänks vara associerad med dålig prestanda av hästar, vilket kan resultera i en betydande och negativa ekonomiska konsekvenser för hästnäringen 2.

Fram till nu, den gyllene standarden för gamma-EHV (γ-EHV) upptäckt var cellodlingsmetoden. Den första olägenheten med detta förfarande var frånvaron av diskriminering mellan EHV-2 och andra γ-EHV s (t.ex. EHV-5). Den andra besvär var den långsamma utvecklingen av den cytopatiska process, som tar från 12 till 28 dagar för att manifestera 4,5.

Att en validerad och normaliserad kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) metoden hjälper att snabbt upptäcka viruset, för att diskriminera mellan EHV-2 och EHV-5 och för att studera förhållandet mellan det virala genomet belastningen och sjukdoms tack vare kvantifieringen aspekten.

Polymeraskedjereaktion (PCR) beskrevs för första gången 1986 av Mullis 6 och är på väg att bli den nya guldstandarden i de flesta av områdena biologisk diagnos (human, miljö och veterinärmedicinska). Denna metod, som är baserad på amplifiering av en del av genomet av patogener, presenterar många fördelar: specificitet, känslighet och snabbhet. Dessutom är risken för kontaminering amplikon receded sedan tillkomsten av QRT-PCR och kvalitetssäkring 7. Ändå krävde ett erkännande av PCR som en ny guldstandardmetod mer än bara förbättrad prestanda data, men också demonstration av kontrollen av utvecklings- och validerings stegen i hela metoden utan försämring av prestanda över tiden.

Den första molekyls verktyg som används för detektion av EHV-2 var tids consuming och inblandade icke-specifik amplifiering med innesluten PCR, följt av sekvensering 8. De riktade generna för herpesvirus var deoxiribonukleinsyra (DNA) polymeras och DNA-förpackning 9. Men kapslad PCR utgör en stor risk för kontaminering av amplikoner. Sedan dess har konventionella PCR-test tagits fram för att förstärka interleukin 10-liknande gen eller glykoprotein B-genen, ses över 2009 2. På senare tid har realtids-PCR egenskaper beskrivs för kvantifiering av EHV-2 10 men inga uppgifter fanns tillgängliga om validering av hela förfarandet innefattar extraktionsprocessen.

I detta protokoll är utvecklings- och valideringsförfaranden beskrivs för en kvantitativ PCR-metod för detektion och kvantifiering av EHV-2 DNA i hästdjur andnings vätskor enligt Association française de norma (AFNOR) norm NF U47-600 3,11,12, vilket är den franska representant iden internationella normalisering kommitté. Denna norm detaljerna "Krav och rekommendationer för genomförande, utveckling och validering av veterinär PCR i djurhälsa analysmetod" 11,12, enligt NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 och OIE (Världsorganisationen för djurhälsa) . rekommendationer, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR validerings innebär ett tredelat förfarande: (a) utveckling av QRT-PCR-analys, (b) karakterisering av QRT-PCR-analys ensam och (c) karakterisering av hela analysmetod (från extraktion av nukleinsyror från det biologiska provet till PCR-analys).

Karakterisering av QRT-PCR-analys och hela analysmetoden innefattar definitionen av två gränser: detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ). LOD 95% PCR representerar det lägsta antalet nukleinsyra kopior per volymenhet som kan detekteras i 95% av alla cases. LOQ 95% PCR representerar den lägsta mängden nukleinsyra kopior som kan bestämmas med hänsyn till osäkerheterna.

Detta QRT-PCR-metoden gör det möjligt att exakt upptäcka och snabb kvantifiering av EHV-2 i vätskor i andningsorganen. Dessutom skulle metoden kunna tillämpas i andra laboratorier för att säkerställa ett standardiserat förfarande och som allmän mall för utveckling av andra nya QRT-PCR-analyser.

Protocol

Obs: Se alla de olika stegen som illustreras i figur 1.

1. Extraktion av nukleinsyror

Obs: Utför extraktion under ett dragskåp för att begränsa föroreningar luftvägarna med nukleinsyror. Inkludera en extraktion negativ kontroll med DEPC-behandlat vatten för att säkerställa att ingen av de reagens är kontaminerade med oönskad DNA.

  1. Extrahera nukleinsyror från det biologiska provet i enlighet med en tidigare beskriven protokoll 15 och tillverkarens protokoll.
    1. Tillsätt sedan 140 | il av biologiskt prov till 560 pl av lyseringslösning (AVL-buffert) och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur. Lägg 560 ul etanol. Tillämpa de första 630 pl av denna lösning (prov + lys lösning + etanol) till en silikakolonn och centrifug.
    2. Tillämpa de återstående 630 ul av denna lösning på samma kiseldioxidkolonn och centrifugera. Skölj därefter kolonnen med 500 mikroliter2 olika tvättbuffertar (AW1 och AW2).
  2. Eluera nukleinsyra med 50 pl elueringsbuffert (AVE buffert) och jämvikt vid rumstemperatur. Stäng locket och inkubera vid rumstemperatur i 1 min. Centrifugera vid 6000 g under 1 min.

2. amplifieringsförfarande

  1. Förbered 22,5 pl reaktionsblandning för varje reaktion. Lägga 12,5 | il av PCR-huvudblandning, x ^ il av 20 ^ iM framåtriktad primer, x ^ il av 20 | iM bakåtriktad primer, y ^ il av 10 ^ M sond och z il ultrarent vatten som krävs för att nå 22,5 ^ il (x, y och z volymer erhålles efter titrering, se avsnitt 3.2.3 och 3.2.6).
  2. Alikvot 22,5 pl av den lämpliga reaktionsblandning till varje reaktionsbrunn i en 96-brunnsplatta.
    Obs: Inkludera negativa kontroller för extraktion och för PCR för att säkerställa att ingen av de reagens är kontaminerade med oönskad DNA.
  3. Tillsätt 2,5 pl av provet, 2,5 pl utvinning negative kontroll, 2,5 pl PCR negativ kontroll och 2,5 pl positivt prov (referensstam eller plasmid) till motsvarande reaktion väl. Efter distribution, täcka plattan med en vidhäftande platta tätning. Centrifugera plattan i 10 sek vid 6000 g.
  4. Placera plattan i en realtids-PCR-system. Välj mallen för analysen layout och starta körningen. Använda programmet inställningen PCR: 10 min vid 95 ° C följt av 45 cykler av 15 sek vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C (tabell 1).
  5. Överför rådata från realtids-PCR-system till ett kalkylblad. Ställa in tröskeln i amplifierings tomter ovanför baslinjen och inom den exponentiella tillväxtregion för att erhålla tröskelcykeln för varje prov. Rita varje punkt standard inställd som en standardkurva för att erhålla linearitet. Beräkna kopieantalet för de olika proverna baserat på standardkurvan.

3. Utveckling av kvantitativ RT-PCR

Obs: Utvecklingen av en QRT-PCR-test kräver referensstammar, en specifik titreras plasmid, och olika kontroller och innebär titrering av primers och sond.

  1. preliminär test
    1. Design primers och prober med särskild programvara enligt tidigare rekommendationer 16.
    2. Utdrag referensstammar som beskrivs i avsnitt 1.
    3. Förstärk som beskrivs i avsnitt 2 med 900 nM för den slutliga koncentrationen av primers och 250 nM för den slutliga koncentrationen av sonden. Analysera signalen som beskrivs i avsnitt 2.5.
    4. Samtidigt utför förstärkning av referensstammar DNA (som beskrivs i avsnitt 3.1.3) utan sonder. Sekvens erhållna amplikoner av Sånger-metoden 17,18. Analysera sekvenserna genom att köra en nukleotid BLAST 19.
  2. Titrering av Primers och prob
    1. Förbereda 3 olika blandningar med 250 nM slutlig koncentration av sond och med olika slutliga concentrningar av den framåtriktade och omvända primrar (50 nM / 50 nM, 300 nM / 300 nM, 900 nM / 900 nM) för de 3 replikat av positivt prov och en negativ kontroll. För varje blandning, tillsätt samma lämplig volym av 20 ^ M framåtprimer och 20 | iM bakåtriktad primer (0,25 | il för att erhålla den 50 nM slutlig koncentration, 1,5 | il för att erhålla de 300 nM slutlig koncentration eller 4,5 | j, l för att erhålla den 900 nM slutkoncentration) , 50 pl PCR-huvudblandning, 2,5 pl 10 nM sond och ultrarent vatten som krävs för att nå 90 pl.
    2. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
    3. Välj bästa skick för att få den högsta nivån av förstärkning, tidigaste cykel tröskel (CT) och bästa repeterbarhet mellan de 3 förutsättningar. Bestämma den bästa koncentrationen och motsvarande volym x l av de framåtriktade och bakåtriktade primrar.
    4. Förbered 5 olika blandningar för 4 prover (3 replikat av positivt prov och en negativ kontroll)med 5 olika slutliga koncentrationer av prob (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). För varje blandning, tillsätt x pl 20 pM framåt primer och x il 20 iM omvänd primer (tidigare bestämts i avsnitt 3.2.3), 50 pl PCR Master Mix, lämplig volym av 10 ^ M sond (0,5 l för att erhålla 50 nM koncentration, 1 | j, l för att erhålla den 100 nM koncentration, 1,5 | il för att erhålla den 150 nM koncentration, 2 | j, l för att erhålla 200 nM koncentration eller 2,5 ^ för att erhålla den 250 nM koncentration) och ultrarent vatten som krävs för att nå 90 pl.
    5. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
    6. Välj bästa skick för att få den högsta nivån av förstärkning, tidigaste cykel tröskel (CT) och bästa repeterbarhet mellan de 5 förhållanden. Bestämma den bästa koncentrationen och motsvarande volym y l för sonden.

4. Karakterisering av kvantitativa Real-time PCR (QRT-PCR)

Obs: Efter framkallningssteget och fastställandet av de bästa förutsättningarna för att använda, karakterisering steget i PCR inkluderar specificitet, detektionsgränsen, linjäritet räckvidd och gränsen för kvantifiering av QRT-PCR.

  1. Upprättande och titrering av plasmid
    1. Beställ kommersiell plasmid innehåller relevant fragment av DNA målgenen valts för PCR (i detta protokoll, nukleotider 2081-2381 av EHV-2 glykoprotein-genen, se tabell 1).
      OBS: För att begränsa risken för luftvägskontaminering med syntetisk DNA, utföra serieutspädningar av plasmider enligt ett dragskåp i ett separat rum och arbeta med utspädd DNA under alla steg av utveckling och godkännandeförfarande.
    2. Återsuspendera plasmiden med ultrarent vatten för att framställa en stamlösning på 50 ng / ml. Vortex och centrifugera kort plasmiden stamlösning.
      Obs: Bestäm den verkliga koncentrationen av plasmid stock lösning efter återsuspension för att beräkna kopieantalet av plasmiden.
    3. Tillsätt 1 pl plasmid till spektrofotometer. Läs av den optiska densiteten (OD) vid 230 nm, 260 nm och 280 nm. Läs av DNA-koncentrationen på spektrofotometer programvara (OD, 260 nm).
    4. Beräkna kopieantalet av plasmiden med användning av Avogadros tal (N A) och med formeln:
      Kopieantal / l = (N A [plasmid i ng / l]) / (plasmid längd x 10 9 x genomsnittlig vikt av ett baspar) = (6,022 x 10 23 x [plasmid]) / (plasmid längd x 10 9 x 660)
  2. Testa specificitet (integrering och exklusivitet) av QRT-PCR
    1. Testa integrering av PCR-systemet. Välj EHV-2 positiva DNA-prover, som tidigare kännetecknas av sekvensering (etablerad positiv status).
    2. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
    3. analyseraPCR data för varje prov som beskrivs i avsnitt 2.5. Kontrollera förekomsten av en exponentiell kurva för alla prover som väljs i avsnitt 4.2.1 och bekräfta integrering av PCR.
    4. Testa exklusivitet av PCR-system med hjälp av DNA-extrakt från patogener med genetiska likheter med målet (i detta fall, andra hästdjur herpesvirus såsom EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 och åsnor herpesvirus-5 som beskrivs i tabell 2) och andra patogener som är involverade i sjukdomar i värdandnings (i detta fall, häst arterit virus, hästinfluensavirus, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus och Klebsiella pneumoniae, se tabell 2).
    5. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
    6. Analysera PCR data för varje prov som beskrivs i avsnitt 2.5. Kontrollera för frånvaron av en exponentiell kurva för samtliga prover som valts iavsnitt 4.2.4 för att bekräfta exklusivitet av PCR.
  3. Detektionsgräns QRT-PCR
    1. Dispensera 90 pl av ultrarent vatten i 6 rör.
    2. Utföra 6 tio-faldiga serieutspädningar av plasmiden för att rikta reningszonen (förlust av Ct-detektering). Transfer 10 pl från plasmiden arbetar utspädning till röret med 90 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 4.3.2 till sista röret i seriespädning har fått plasmiden.
    3. Utföra amplifieringen av de 6 tio-faldiga seriespädningar av plasmiden som beskrivs i avsnitt 2.
    4. Bestäm minskning zon: zonen mellan den sista utspädningen av plasmid presentera en positiv signal och den första spädningen utan upptäckt (se figur 2).
    5. Att starta 6 tvåfaldiga serieutspädningar väljer den sista utspädningen av plasmid som ger en positiv signal (se avsnitt 4.3.4).
      Obs: Utför tre oberoende trials för att bestämma gränsen för detektering av QRT-PCR (LOD 95% PCR)
    6. Dispensera 25 | il av ultrarent vatten i 6 rör.
    7. Utföra 6 två-faldiga seriespädningar av plasmiden. Överföring 25 ^ från plasmiden arbetsutspädning, bestämd enligt punkt 4.3.5, till röret med 25 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 4.3.7 till sista röret i seriespädning har fått plasmiden.
    8. Utföra amplifieringen av de 6 två-faldiga seriespädningar av plasmiden som beskrivs i avsnitt 2. Upprepa steg 4.3.7 till 4.3.8 två gånger, för att erhålla 3-prövningar med 8 replikat (24 replikat) av var och en av sex tio-faldigt serieutspädningar av plasmiden.
      Notera: Detektionsgränsen av QRT-PCR (LOD 95% PCR) definieras som den lägsta DNA-kopior nummer genom volymenhet som detekteras i 95% av fallen.
    9. Beräkna antalet positiva replikat av 24 replikat för varje nivå av plasmid koncention.
    10. Bestämma LOD 95% PCR. LOD 95% PCR är den nivå som resulterar i upptäckten av 23 positiva replikat av 24 replikat.
  4. Linjäritet Range och kvantifieringsgränsen för QRT-PCR
    Obs: Utför 4 oberoende studier med 6 tiofaldiga serieutspädningar av plasmiden för att säkerställa att den lägsta koncentrationen som används i intervallet motsvarar LOD 95% PCR bestämdes tidigare i 4.3.10.
    1. Dispensera 45 pl av ultrarent vatten i 6 rör.
    2. Starta 6 tiofaldiga serieutspädningar med koncentrationen av plasmid arbetar utspädning motsvarande 10 7 LOD 95% PCR.
    3. Utföra 6 tio-faldiga seriespädningar av plasmiden. Transfer 5 pl från plasmiden arbetsutspädning (bestämd enligt punkt 4.4.2) till röret med 45 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 4.4.3 till sista röret i seriespädning har fått plasmid.
    4. Förstärker de 6 tiofaldiga serieutspädningar av plasmiden som beskrivs i avsnitt 2.
    5. Spåra den linjära regressionen y = ax + b med en för lutningen och b för interceptet (Figur 3).
    6. Beräkna förstärkningseffektiviteten (E) från lutningen av standardkurva (se 4.4.5) med hjälp av ekvationen:
      4.4.6 .
      Upprepa steg 4.4.1 till 4.4.6 tre gånger.
      Notera: Amplifiering effektivitet representerar den mängd av PCR-produkt ökning efter varje cykel. En idealisk reaktion når effektivitet nära 100%. I praktiken, E (%) var mellan 75% och 125%. Högre E kan indikera förstärkning av icke-specifika produkter eller en pipett fel i serieutspädning. Lägre E kan också indikera en pipett fel i seriespäd, dålig primer design eller icke-optimala reaktionsbetingelser.
    7. Beräkna bias (tabell3). Kontrollera för varje plasmid nivå att det absoluta förspänningen värdet är mindre än det kritiska snedhetsvärde (0,25 log 10). Bestäm medelvärdet partiskhet och linearitet osäkerheter (U Lini) för varje plasmid nivå (tabell 3) att utvärdera linjär regression för EHV-2 qPCR (Figur 4). U Lini är linearitet osäkerhet som fastställs för varje i plasmid nivå som beräknas från standardavvikelse (SD'i) och betyder partiskhet. Bestäm kombinerade linjäritet osäkerhet (U LIN) av EHV-2 qPCR ges av formeln:
      4.4.7
      Obs: Godkännande av partiskhet anges av laboratoriet (i allmänhet absolut partiskhet 0,25 log 10) och motsvarar skillnaden mellan det lägsta värdet och det högsta värdet på 0,5 log 10 (uppmätta mängden i log 10 antal kopior). U LIN
    8. Bestämma gränsen för kvantifiering av QRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR är den lägsta koncentrationen med en bias 0,25 log 10 används för linjäritet området (tabell 3).

5. Karakterisering av hela Analysmetod (från DNA-extraktion till QRT-PCR-resultat)

Obs! Karakterisering av hela metoden är valideringen av alla nödvändiga åtgärder för att få QRT-PCR-data (dvs, från utvinning av DNA från luftprovet (se avsnitt 1) till förstärkning och kvantifiering av målet (se avsnitt 2 )).

  1. Fastställa en överensstämmelse mellan det kopior numret i PCR-reaktionen och kopior antalet närvarande i det biologiska provet med formeln:
    5,1-1 .
    De 5,1-2 är volymen av provet sattes till PCR-blandning för amplifiering, 5,1-4 är volymen av buffert AVE användes för att eluera nukleinsyror och 5,1-5 är volymen av det extraherade provet.
  2. Testa känslighet och specificitet av hela analysmetod
    Obs: Endast kända EHV-2 positiva (eller negativa) prover används i det här avsnittet.
    1. Testa "känslighet" av QRT-PCR-metoden genom att analysera positiva prov för målet (EHV-2).
      1. Välj EHV-2 positiva DNA-prover, som tidigare kännetecknas (positiv status).
      2. Extrahera nukleinsyra som beskrivs i avsnitt 1. Utför ett amplifieringsförfarande som beskrivs i avsnitt 2.
      3. Bestäm antalet verkliga positiva (positiva provsom är positiva med denna RT-PCR) och antalet falskt negativa (känd positiva prover som är negativa med denna RT-PCR).
    2. Testa "specificitet" av QRT-PCR-metoden genom att analysera negativa prover
      1. Välj EHV-2 negativa DNA-prover (negativ status).
      2. Extrahera nukleinsyra som beskrivs i avsnitt 1. Utför ett amplifieringsförfarande som beskrivs i avsnitt 2.
      3. Bestäm antalet verkliga negativ (negativa prover som är kända för att vara negativ med denna RT-PCR) och antalet falska positiva (kända negativa prover som är positiva med denna RT-PCR).
    3. Beräkna "diagnostisk känslighet" (SE) och "diagnostisk specificitet" (Sp) av hela metoden (tabell 4) enligt följande: Se = antal verkliga positiva / (antal verkliga positiva + falskt negativ) och Sp = antal verkliga negativ / (antal verkliga negativas + falska positiva) (se tabell 4).
    4. Beräkna 95% konfidensintervall för sensitivitet och specificitet av hela metoden med formeln Greiner och Gardner förhållande 12,20:
      5.2.4
      där e är den beräknade fel, är θ det Se (eller Sp) och n antalet prov som analyserats.
      Obs: För ett litet antal prover, använder Schwartz tabellen enligt AFNOR norm 12 för att beräkna 95% konfidensintervall för sensitivitet och specificitet av hela metoden.
  3. Framställning av negativ resursmaterial för karakterisering av hela analysmetod
    VARNING: För att bestämma gränserna för detektion och kvantifiering av hela metoden (LOD Metod och LOQ Method), tillsätt kända koncentrationer av plasmid till de biologiska prover som är kända för att vara fripå målet (EHV-2 i detta fall). Dessa prover, tillsammans med kvantifierade plasmid utgör positiva normer som man kan bestämma LOD Metod och LOQ metoden.
    1. Bekräfta frånvaron av målet (EHV-2) i biologiska prover som används för att konstruera positiva normer.
      1. Välj olika kända negativa biologiska prover.
      2. Utdrag biologiska prover som beskrivs i avsnitt 1. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
      3. Bekräfta frånvaron av målet genom frånvaron av PCR-signal i dessa prover.
        Obs! Använd samma negativa resursmaterial för alla steg mellan 5,4 och 5,5.
    2. Pool olika negativa prover för att erhålla 15 ml negativ resursmaterial (en volym som behövs för en fullständig validering). Fördela 135 pl av denna negativa resursmaterial i 100 rör. Hålla rören vid 4 ° C eller vid -80 ° C under lång lagring.
  4. Limit detektions hela analysmetod
    1. Bestäm minskning zon av hela metoden.
      1. Dispensera 45 pl av ultrarent vatten i 6 rör.
      2. Utföra 6 tio-faldiga seriespädningar av plasmiden. Transfer 5 pl från plasmiden arbetar utspädning motsvarande 10 7 LOD 95% PCR (bestämd enligt punkt 4.3.10) till röret med 45 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 5.4.1.2 till sista röret i seriespädning har erhållit plasmid.
      3. Transfer 5 pl från varje utspädning av plasmid till 2 rör med 135 pl av negativa resursmaterial för att erhålla två replikerar för 6 positiva normer. Vortex och kort centrifug.
      4. Utför extraktion av 2 replikat för 6 positiva normer som beskrivs i avsnitt 1. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
      5. Bestäm minskning zon: zonen mellan den sista koncentration av plasmid ger en positiv signal och den första koncentrationen som inte visar någon signal.
    2. Detektionsgräns Method (LOD Method) Bestäms av 2 oberoende studier
      Obs: Utför 2 oberoende försök för att bestämma detektionsgränsen av hela metoden (LOD Method).
      1. Starta 6 tvåfaldiga serieutspädningar med plasmiden arbetsutspädning som är 4 gånger mer koncentrerad att den sista koncentrationen av plasmiden som gav en positiv signal (se avsnitt 5.4.1.5).
      2. Dispensera 25 | il av ultrarent vatten i 6 rör.
      3. Utföra 5 två-faldiga seriespädningar av plasmiden. Överföring 25 ^ från plasmiden arbetsutspädning (bestämd enligt punkt 5.4.2.1) till röret med 25 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 5.4.2.3 till sista röret i seriespädning har fått plasmid.
      4. Överföring 5 pl från varje spädning av plasmid till 4 rör med 135 pl av negativa resursmaterial för att erhålla 4 kopior av de 5 positiva normer. Virvel och kortfattat centrifugera rören.
      5. Utför extraktion av 4 replikat för de 5 positiva normer som beskrivs i avsnitt 1. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
      6. Upprepa steg 5.4.2.1 till 5.4.2.5 en gång för att erhålla 8 replikat för varje nivå av plasmid koncentration.
      7. Räkna antalet positiva replikat av 8 replikat för varje nivå av plasmid koncentration.
      8. Bestäm LOD metoden. LOD metoden är den sista nivån vid vilken åtta replikat av 8 replikat är positiva (som beskrivs i avsnitt 5.4.2.7).
  5. Linjäritet Range och kvantifieringsgränsen för det hela analysmetod
    Obs: För att bestämma gränsen för kvantifiering av hela metoden (LOQ Method), tillsätt kända koncentrationer av plasmiden biologiskprover som är kända att vara fria från målet (EHV-2 i detta fall). Dessa prover utgör positiva standarder för att fastställa LOQ metoden.
    1. Dispensera 45 pl av ultrarent vatten i 6 rör.
    2. Utföra 6 tio-faldiga seriespädningar av plasmiden. Transfer 5 pl från plasmiden arbetar utspädning motsvarande 10 7 LOD Method (bestämd enligt punkt 5.4.2.8) till röret med 45 pl ultrarent vatten. Vortex och centrifugera kort röret. Upprepa steg 5.5.2 till sista röret i seriespädning har fått plasmiden.
    3. Transfer 5 pl från varje utspädning av plasmiden till 2 rör med 135 pl negativa biologiska resursmaterial för att erhålla 2 kopior av de 6 positiva normer. Vortex och kort centrifug.
    4. Utför extraktion av 2 replikat för 6 positiva normer som beskrivs i avsnitt 1. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2. Upprepa steg 5.5.1till 5.5.4 tre gånger.
    5. Definiera en noggrannhet profil för att kunna bedöma och värdera de kvantitativa resultat av metoden.
      1. Definiera gränserna för godkännande av hela metoden för laboratoriet. I detta protokoll, är gränserna för godkännande definieras som ± 0,75 Log 10 av Labeo Frank Duncombe.
      2. För ett försök, spåra en första linjära regressionen y = ax + b (a är lutningen och b är interceptet) med en kopia av Ct-värden motsvarande varje beräknat värde av standardkurvan. Med denna första linjär regression, beräkna det experimentella värdet av kopietalet för replikat av Ct-värden som används för detta första standardkurva. Upprepa steg 5.5.5.2 med de andra replikat av Ct-värden för att erhållna en andra linjär regression och beräkna det experimentella värdet av kopieantalet för den andra replikat av Ct-värden som används för den andra standardkurvan.
      3. Beräkna precision, riktighet och precision som för varje plasmid nivå enligt NF U47-600-2 12.
      4. Skapa ett kalkylblad för att sammanställa information om alla standardpoäng (5.5.5.4) och skapa en noggrannhet profil med de tidigare definierade acceptansgränser i 5.5.5.1 och riktigheten av data tillsammans med nedre och övre noggrannhetsgränser som beräknas i 5,5 .5.4 (Figur 5).
    6. Bestäm LOQ Metod: detta motsvarar den lägsta koncentrationen av en standardkurva med riktighet 0,75 log 10 som används för linjäritet intervall beräknas i 5.5.5.5.
  6. Utvärdering av repeterbarhet och reproducerbarhet
    Obs: Kontrollera repeterbarhet och reproducerbarhet med hjälp av förhållandet mellan standardavvikelsen och medelvärdet för upprepade mätningar (variationskoefficient, eller CV = standardavvikelse /betyda).
    1. Utvärdera repeterbarhet hela metoden med ett Analytiker:
      1. Välj 3 biologiska prover med 3 olika virala genomet laster (tidigare testats i PCR till exempel).
      2. Utdrag 8 replikat av 3 prov som beskrivs i avsnitt 1. Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2.
      3. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för Ct-värdet samlas in för varje prov.
      4. Beräkna den intra-assay CV användning av formeln CV = standardavvikelse / medelvärde.
    2. Utvärdera Reproducerbarhet av hela metoden med 3 Analytiker:
      1. Välj 3 biologiska prover med 3 olika virala genomet laster (tidigare testats i PCR till exempel)
      2. Utdrag 2 replikat av 3 prov som valts i 5.6.2.1 (som beskrivs i avsnitt 1). Utför amplifieringsförfarandet som beskrivs i avsnitt 2. Upprepa steg 5.6.2.2 med 2 oberoende analytiker.
      3. Beräkna medelvärdet och standardavvikelseav Ct-värdet samlas in för varje prov.
      4. Beräkna den inter-assay CV användning av formeln CV = standardavvikelse / medelvärde.

Representative Results

Den kvantitativa RT-PCR-metoden, som beskrivits ovan, genomfördes för att upptäcka och kvantifiera hästdjur herpesvirus-2 i vätskor andnings. Figur 1 visar en schematisk arbetsflöde diagram för utveckling och validering av en kvantitativ RT-PCR-metoden enligt AFNOR normen NF U47-600. Specificiteten för primrarna och prober validerades under steg-för-steg-utveckling av PCR. Endast EHV-2 stammar förstärks i detta system. Därefter hade utförandet av QRT-PCR som skall karakteriseras.

För det första, att uppskatta LOD PCR, en 6 tiofaldig serieutspädning utfördes för att fastställa reningszonen (Figur 2). I detta exempel 6 tiofaldiga serieutspädningar gjordes mellan 10 -5 och 10 -10 (mellan 26.000 och 0,26 kopior / 2,5 l prov) för att uppskatta LOD PCR. Reningszonen ltalet mellan utspädningar av 10 -9 och 10 -10 (mellan 2,6 och 0,26 kopior / 2,5 pl prov). För att bestämma LOD PCR värdet i detta fall var 6 tvåfaldiga serieutspädningar av plasmiden som gjorts i denna minskning zon mellan 5,2 och 0,16 kopior / 2,5 l prov. LOD PCR värdet var 2,6 kopior / 2,5 pl prov.

För att bestämma lineariteten intervallet och LOQ PCR var LOD PCR värde som används för att starta intervallet 6 tio-faldiga seriespädningar, mellan 2,6 (LOD PCR) och 260.000 kopior / 2,5 pl prov. Figur 3 illustrerar en linjär regression för EHV2 QRT-PCR från ett prov. Prestanda linjär regression (Figur 4) valideras i fyra exemplar med hjälp av beräkningar som beskrivs i tabell 3. Beräkningarna görs för att definiera linjäritet intervallet enligt kriterierna absolut Bias i value ≤0.25 log 10, oavsett nivå i plasmid belastning. I det här fallet, range linjäritet låg mellan 2,6 och 260.000 kopior / 2,5 pl prov. LOQ PCR är den lägsta koncentrationen i linjäritet intervallet (dvs 2,6 kopior / 2,5 pl prov i det här fallet). U LIN bestämdes vara 0,12 log 10 i intervallet 2.6-260,000 kopior / 2,5 pl av DNA.

Efter utveckling (Figur 1, blå) och karakterisering av QRT-PCR (figur 1, gul), rekommenderar AFNOR NF U47-600 norm karakterisering av hela analysmetoden från DNA-extraktion till QRT-PCR (figur 1, orange). Det diagnostiska sensitivitet och specificitet beräknades såsom beskrivits i tabell 4. De kvantitativa prestanda QRT-PCR hela analysmetoden utvärderades och valideras med en noggrannhet profil (

Detta protokoll, som använder state-of-the-art molekylär teknik, tillät oss att detektera och kvantifiera EHV-2 virusgenom belastning i 172 nasala pinnprover från hästar med andningsbesvär och / eller klinisk misstanke om infektion. Förekomsten av EHV-2 från fält (biologiska) prover var 50% (86/172) i denna population. De kvantitativa analyser visade att virusgenom massor av EHV-2 var signifikant högre hos unga hästar och fördelningen av virala genomet laster minskade med åldern (figur 6). I den aktuella studien var den högsta EHV-2 virala genomet last (1,9 x 10 11 kopior / ml) påvisades i föl (Figur 6).

Figur 1
Figur 1: Workflow diagram för utveckling (blå), karakterisering av den kvantitativa RT-PCR(gul) och karakterisering av hela analysmetoden från DNA-extraktion till QRT-PCR (orange) enligt AFNOR normen NF U47-600-2. Arbetsflödet diagram återupptar de olika stegen för utveckling, karakterisering av kvantitativ RT -PCR och karakterisering av hela analysmetoden från DNA-extraktion till QRT-PCR. För varje steg, visar arbetsflödet diagrammet antalet nödvändiga körningar, för späd att utföra och antalet erforderliga analytiker. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Fastställande av reningszonen med representativa resultat från realtids-PCR kurvor erhållna med 6 tiofaldiga serieutspädningar av plasmid. För att uppskatta reningszonen, 6 tiofaldig seriespädningar görs mellan 10 -5 (26.000 kopior / 2,5 pl prov) och 10 -10 (0,26 kopior / 2,5 pl prov). Reningszonen ligger mellan utspädningar av 10 -9 (2,6 kopior / 2,5 pl prov) och 10 -10 (0,26 kopior / 2,5 pl prov). I detta fall var 6 tvåfaldiga serieutspädningar av plasmiden som gjorts i detta reningszonen för att bestämma LOD 95% PCR, mellan 5,2 och 0,16 kopior / 2,5 l prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. Linjär regression för EHV2 QRT-PCR Linjäriteten hos kvantitativ testning är förmågan att generera resultat som är proportionell mot koncentrationen av målet närvarande i ett specifikt område. Detta kan modelleras genomlinjär regression (y = ax + b) mellan instrumentutslag (cykel tröskel eller CT) och logaritmen av mängden mål (antalet mål kopior / 2,5 pl prov). Klicka här för att se en större version av denna siffra .

figur 4
Figur 4:. Utförande av linjär regression av EHV-2 qPCR Mean förspänning representerar medelvärdet skillnaden mellan den uppmätta plasmiden kvantitet ( fig4-1 ) Och den teoretiska plasmiden kvantitet (x 'i) för varje plasmid nivå. Vertikala streck representerar linjäritet osäkerhet (U Lini) ges av formeln
fig4-2
där SD'i är standardavvikelsen o f uppmätt plasmid kvantitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5:. Noggrannhet profiler baserade på validerings resultaten av EHV-2 QRT-PCR-metoden Den gröna linjen (cirklar) representerar riktigheten av data (systematiska fel, eller bias). Gränserna för godkännande definieras på ± 0,75 Log 10 av laboratoriet (streckade linjer). De nedre och övre precision som bestämdes för varje plasmid belastningsnivå från medel partiskhet ± två gånger standardavvikelsen för tillförlitlighetsdata (röda linjer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1 "> figur 6
Figur 6:. Kvantifiering av virusgenom massor av EHV-2 enligt ålder virala genomet lastfördelning av EHV-2 detekteras i nasala pinnprover representeras för de olika åldersgrupperna. De horisontella linjerna representerar medianvärden inom standardavvikelsen (m = månader). * Signifikant skillnad med ANOVA med Newman-Keuls post hoc test (p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

målgenen Primrar, prob och plasmide sekvenser (5'-3 ') nukleotidposition Produktstorlek (nukleotider) referenser
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		Framåt: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11
Omvänd: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 sek 45 cykler
Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min
plasmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

Tabell 1:. Sekvenser av primers, prober och positiva syntetiska DNA-kontroller som används i detta protokoll Sekvensen av plasmid (positiv syntetiskt DNA) motsvarar nukleotid positioner 2081-2381 av EHV2gB sekvens (HQ247755.1). Utformningen av primrar och prober som används i detta protokoll erhölls genom användning specifik programvara.

patogener Referens (ursprung) Antal stammar RESULTAT
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) Positiv
20 prover (FDL samling)
EHV-5 KD05 (GERC) 20 Negativ
20 prover (FDL samling)
EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativ
T934 WSV (GERC)
EHV-1 Kentucky-stam Ky A (ATCC) 3 Negativ
2 prover (FDL samling)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativ
Asinine herpesvirus AHV5 FDL Collection 1 Negativ
HästInfluensavirus A / häst / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativ
(Accessionsnummer JX091752)
Hästarteritvirus VR796 (ATCC) 2 Negativ
Rhodococcus equi FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. equi FDL Collection 1 Negativ
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativ
Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativ
Klebsiella pneumoniae FDL Collection 1 Negativ

Tabell 2: Analytisk specificitet QRT-PCR för EHV-2.

tabell 3
Tabell 3: Beräkning av partiskhet och linjäritet osäkerhet (anpassad från NF U47-600-2 12). För varje försök, som gjorts av linjär regression (y = ax + b) valideras med hjälp av tabellen där y är cykeln tröskelvärde erhålles; a är lutningen erhålles;. X är plasmiden nivå och b är interceptet i är den plasmid nivå (i varierar från 1 till k nivåer); k är antalet av plasmid nivåer används (t.ex., k = 6 i thans bord); j är försöket (j varierar från en till I-studier), jag är antalet försök, som ligger mellan 3 och 6 försök (t.ex. I = 4 i denna tabell) Xi är den uppskattade plasmiden kvantiteten för varje. Jag plasmid nivå. x 'i är den teoretiska plasmiden mängd som erhålls med ekvationen x' i = log 10 (xi) för varje i plasmid nivå. Under varje j rättegång, tröskelcykeln erhålls för varje i plasmid nivå beräknas med linjär regression y i, j = a j x i, j + b j. table3-1 är den uppmätta plasmiden mängden under försöks j. Bias i sub> är skillnaden observeras mellan den uppmätta plasmiden kvantitet och den teoretiska plasmiden kvantitet för varje försök och varje plasmid nivå. table3-2 är medelvärdet av table3-3 av varje i plasmid nivå; SD 'i är standardavvikelsen för uppmätt kvantitet table3-4 för varje i plasmid nivå; Mean partiskhet är medelvärdet av Bias i; U Lini är linearitet osäkerhet som fastställs för varje i plasmid nivå som beräknas från SD'i och betyder partiskhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

En "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-med-next.within-page =" always "> Real status prov Positiv Negativ Resultaten erhållna med hela metoden Positiv RP (verkligt positivt) FP (falskt positiva) Negativ FN (falskt negativa) RN (verkliga negativa) Total RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Tabell 4:. Beräkning av diagnostisk känslighet (Se) och specificitet (Sp) av hela metod A Schwartz tabellen användes för att beräkna den confidrensintervall på 95% sensitivitet och specificitet av hela metoden som beskrivs i NF U47-600-2.

Discussion

Sedan 2000-talet har realtids-PCR har ersätta guld standardtekniker (cellodling och bakterier odlingsmetoder) i ett ökande antal laboratorier. Genomförande av tekniken är relativt lätt. Men validering av laboratoriemetoder är avgörande för molekylär detektion och kvantifiering av patogener för att säkerställa korrekt, repeterbara och tillförlitliga uppgifter.

Eftersom extraktionssteget är den primära källan för förlust av biologiskt material, kan det anses vara den främsta källan till oriktig kvantifiering mellan ett protokoll och en annan. Som sådan, skapandet av en standardkurva för DNA-plasmid under QRT-PCR, främst rapporterats i litteraturen, anger det virala genomet belastningen men tar inte hänsyn till extraktionssteget.

Beskrivning av en de novo strategi för en hel metod valideringsprocess i AFNOR normen NF U47-600-2 utgör en betydande framsteg på detta område. Såsom illustreras idetta papper för EHV-2 hos hästar, eller av andra i bin 21 nödvändiggör detta tydlig differentiering mellan framkallningssteget och valideringen steg med karakterisering av PCR och karakterisering av hela metoden. En begränsning i detta intressant metod är att någon förändring i protokollet kommer att resultera i skyldighet att förlänga hela processen som kan vara mycket kostsamt. Denna begränsning uppmärksammades också av det faktum att gränserna för kvantifiering beroende på källan från vilken viruset utvinns (t.ex. vätskor andnings, organ, blod eller urin). I själva verket presenterar varje matris olika specificiteter i sina fysikalisk-kemiska egenskaper och det är viktigt att definiera oberoende vid varje annan matris som används för viral detektion och kvantifiering av QRT-PCR. Således kan det virala genomet belastning av varje biologiskt prov kvantifieras mer exakt från utvinning. Karakteriseringen tar också hänsyn till termo model och när användning av en tidigare väldefinierad metod (t.ex. EHV-2 qPCR metod som beskrivs i detta dokument) kräver en ny typ av maskin i moder laboratorium eller annat laboratorium, måste man bekräfta resultatet av detta instrument. Bekräftelsen av hur en qPCR analys är en förutsättning för alla tester sätta i ett laboratorium. Detta uppnås normalt genom att analysera ett referensprov med kända egenskaper. En sådan kontroll är en förutsättning och betraktas som obligatoriska som begärts av NF 47-600-1 AFNOR norm för att validera prestanda qPCR (LOD, LOQ effektivitet) och robustheten i hela metoden (LOD, LOQ). Inte bara under utveckling och karakterisering steg men även när de används i forskning eller för diagnostiska ändamål, kan riskfaktorer identifieras och kontrolleras väl för att säkerställa standardiseringen av protokollet. Särskilt oroande är tillräcklig personalutbildning, högkvalificerad personal, kvalitetskontroll av förbrukningsbegagnade och lagring, kontroll av de omedelbara miljöförhållanden och medvetenhet om metrologiska förhållanden som kan påverka utförandet av vetenskapliga instrument som är involverade i analysen. Användning av referensprover för mellan laboratorier jämförelser kan också hjälpa till att kontrollera de osäkerheter. På detta sätt kan jämförelse av data mellan laboratorier underlättas. I själva verket mellan laboratorier kompetenstest är viktigt att utvärdera och bekräfta metodens reproducerbarhet.

Virala genomet last resultat som uttrycks i internationella enheter (IE) av det analyserade biologiska matrisen (IU: kopior / ml för vätskor eller kopior / g för vävnader) är lättare att använda för att jämföra resultat mellan olika laboratorier. Alla resultaten ovan LOQ uttrycks som kopior / ml och ett resultat mellan LOD och LOQ tas som en icke-kvantifierbar positivt resultat. Presenter kvantifieringsdistributionen uppgifter av genomet på detta sätt överensstämmer mer exakt till de process analyser (amplifiering av genomet). I själva verket, i cellodlingsexperiment, uttryck av den virala belastningen genom TCID50 (median vävnadskultur smittsam dos) är beroende på beskaffenheten av cellerna och virusstammar. Varje stam linje besitter unika infektion kinetik och vissa virus som EHV-2 kan ta flera dagar innan den första cytopatogena effekten är uppenbar.

Sammanfattningsvis bör denna nya metod för karakterisering av QRT-PCR underlätta harmoniseringen av datapresentation och tolkning mellan laboratorier. Detta kommer att vara mycket användbar för potentiella nya tillämpningar av QRT-PCR i framtiden som inrättandet av en cut-off-värdet för förklaring av sjukdomsstatus i stället för att bara närvaron eller frånvaron av patogen.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film qPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232 (2012).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Tags

Immunologi Kvantitativ RT-PCR PCR norm titrering detektionsgräns kvantifieringsgränserna linjäritet känslighet specificitet validering hästdjur herpesvirus-2 häst
Utveckling och validering av en kvantitativ PCR-metod för hästdjur Herpesvirus-2 Diagnostik i Andnings Vätskor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, … More

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter