Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Published: February 26, 2016 doi: 10.3791/53673
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Brain Structure and Function Group, Neuroscience Research Australia, 2School of Medical Sciences, The University of New South Wales

Abstract

סיבי יורד ארוך אל חוט השדרה חיוני תנועה, תפיסת כאב, והתנהגויות אחרות. דפוס סיום סיבים בחוט השדרה של רוב מערכות סיבים אלה לא נחקר ביסודיות בכל מינים. סיבי serotonergic, אשר פרויקט אל חוט השדרה, נחקרו בחולדות ואופוסומים על סעיפים היסטולוגית המשמעות התפקודית שלהם כבר להסיק על סמך דפוס סיום סיבים שלהם בחוט השדרה. עם התפתחות CLARITY וטכניקות מעוקב, אפשר לחקור מערכת סיבים זה והפצתו בחוט השדרה, אשר צפוי לחשוף תכונות שלא היו ידועים קודם של מסלולים supraspinal serotonergic. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט הדמיה הסיבים serotonergic בחוט השדרה העכבר באמצעות CLARITY בשילוב וטכניקות מעוקב. השיטה כרוכה זלוף של עכבר עם פתרון הידרוג'ל והבהרה של הרקמה עם COMBINation סליקת ריאגנטים. רקמת חוט שדרה נוקתה למשך קצת פחות משבועות, ואת מכתים immunofluorescent עוקב נגד סרוטונין הושלם בתוך פחות מעשרה ימים. עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון, הרקמה נסרקה תמונת 3D שוחזרה באמצעות תוכנת Osirix.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים לעקוב אחר ההנחיות של טיפול בבעלי חיים ועדת האתיקה (ACEC) מאוניברסיטת ניו סאות 'ויילס (מספר ACEC שאושרה הינה 14 / 94a).

1. הכנה של חוט השדרה עכבר שקוף

  1. הכנת פתרון הידרוג'ל קר קרח
    1. הכנת פתרון paraformaldehyde 16% (PFA)
      1. להוסיף 16 גרם אבקת paraformaldehyde לתוך 70 מ"ל מים מזוקקים מחומם מראש (50-55 מעלות צלזיוס) ומערבבים על בוחש מגנטי מחוממת עד paraformaldehyde נמס. הערה: אל תאפשר הפתרון לחמם מעל 55 מעלות צלזיוס ולהיות מודעים לכך paraformaldehyde הוא רעיל.
      2. מעבירים את הפתרון paraformaldehyde כדי גליל ולהוסיף מים מזוקקים עד 100 מ"ל. מצננים את הפתרון paraformaldehyde באמצעות מקרר 4 ° C..
    2. ממיסים 125 מ"ג יוזם VA-044 ב 26.25 מ"ל מים מזוקקים ו לקרר את הפתרון בתוך 4° מקרר C.
    3. פתרון acrylamide מגניב 5 מ"ל (40%), 1.25 מ"ל פתרון Bis (2%) (זהירות: Bis ופתרונות acrylamide רעילים, עלול לגרום למומים גנטיים או סרטן), 5 מ"ל 10x PBS, 12.5 מ"ל 16% פתרון PFA, ואת פתרון יוזם VA-044 על הקרח.
    4. מערבבים את כל הפתרונות שהוצעו על הקרח.
      הערה: הנפח הכולל הוא 50 מ"ל.
  2. זלוף וגבייה של קורד עכבר השדרה
    1. לטשטש עכבר עם זריקה intraperitoneal של קטמין (80 מ"ג / ק"ג) ו xyzaline (5 מ"ג / ק"ג) מדולל מלוחים 0.9% נורמלי. המינון לעכבר יכול להיות נמוך מזה של חולדות.
    2. על משטח פלסטיק מתאים במנדף, לתקן את הגפיים של העכבר מהגוף (סרט דביק יעיל) פעם העכבר אינו מגיב קמצוץ כדי עורו של כף הרגל.
    3. חותכים את העור העכבר מעל החזה ואחר כך בחזה העצם כדי לחשוף את הלב עם מספריים.
    4. באמצעות משאבת peristaltic, עם מחט 25 G מצורף thסוף הדואר של צינורות, הכנס את המחט לתוך החדר השמאלי של הלב, לגזור אטריום הזכות ליצור נקודת יציאה בדם ולאחר מכן להתחיל כביסה עם 40 מ"ל 0.9% מלח רגיל בשיעור של כ -10 מ"ל / דקה.
    5. כשיושלם, perfuse את העכבר עם 35 פתרון הידרוג'ל קר מ"ל קרח.
      הערה: perfuse במהירות של 10 מ"ל / דקה, כדי למנוע נפיחות של רקמת העצבים.
    6. לחתוך את העור על הגב עם להב ולאחר מכן להסיר את השרירים ליד החוליות. לאחר חיתוך קשתות בחוליות בצד אחד מרפרף אותם לצד השני, לקחת חוט השדרה מתוך עמוד השדרה עם מספריים בסדר.
  3. ניקוי חוט השדרה עכבר
    1. מניחים את חוט השדרה 15 מ"ל של תמיסת הידרוג'ל לילה ב 4 ° C..
    2. הסר 10 מ"ל של פתרון הידרוג'ל ויוצקים את שאר הפתרון עם מגזרים חוט השדרה אל צינור 5 מ"ל. מלאו את צינור 5 מ"ל עם הפתרון הידרוג'ל עד שהוא לגמרי מלא.
    3. למתוח חתיכה קטנה של parafilm על גבי הצינור 5 מ"ל ולאחר מכן לעטוף parafilm סביב הצוואר של הצינור. הערה: ודא המגעים parafilm הפתרון הידרוג'ל ואין בועות בין פתרון הידרוג'ל ואת parafilm.
    4. שים את הצינור 5 מ"ל ב 37   מעלות צלזיוס בתנור למשך הלילה. שימו הפתרון הידרוג'ל עד שזה הופך ג'ל.
    5. קח את הצינור 5 מ"ל מהתנור ולהסיר את הג'ל מהצינור עם ברגים (כגון קצה פיפטה גרפו 1 מ"ל). הסר את הג'ל רקמה חוט השדרה על ידי דבק הרקמות הגסות הג'ל ולאחר מכן לקחת את הרקמה הגסה משם (הג'ל ידבק הרקמה ולכן יוסר על ידי הרקמה).
    6. לאחר הסרת הג'ל רקמת חוט השדרה, לשטוף את חוט השדרה 4 פעמים עם PBS 1x (pH 7.4) במשך 24 שעות על שייקר.
    7. הכן את הפתרון סליקה מעוקב ידי המסת אוריאה 3.85 גרם ו 3.85 גרם N, N, N ', N'-tetrakis (2-Hydroxypropyl) ethylenediam ine ב 5.38 מ"ל מים מזוקקים.
      הערה: בוחש חם משמש. להוסיף פוליאתילן גליקול 2.31 גרם האתר מונו-p-isooctylphenyl / טריטון X-100 הפתרון פעם ברור מתקרר לטמפרטורת החדר.
      הערה: 10 גרם של שלושה כימיקלים אלה הם לעכבר אחד.
    8. חותכים את חוט השדרה עכבר coronally לתוך 2-3 מקטעים ארוכים מ"מ עם סכין גילוח ולשים אותם לתוך 5 מ"ל של הפתרון סליקה מעוקב לעיל. מניחים על שייקר בתנור ב 37   ° צלזיוס במשך 3 ימים.
    9. שלושה ימים לאחר מכן, לשנות את הפתרון וסליקה אחד טרי. הערה: הפתרון מעל מוכן לפני השימוש.
    10. שניים עד שלושה ימים לאחר מכן לאחר רענון פתרון הסליקה מעוקב, לבדוק את השקיפות של הרקמה כנגד נייר עם גופן 8 אותיות. אם הוא שקוף, האותיות ניתן לראות דרך רקמת פינה. הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף 4 מיליליטר של PBST (0.1% Triton-X100) כדי לשטוף את הרקמה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות).

ילדה = "jove_title"> 2. immunofluorescence מכתים

  1. דגירת מגזרי חוט שדרת פתרון הנוגדן הראשוני (-סרוטונין אנטי, וגדל ארנב, מדולל 1: 100 ב PBST) במשך 3 ימים על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
  2. הסר את הפתרון נוגדן ולהוסיף 4 מ"ל של PBST (0.1% Triton-X100) לשטוף את פלחי חוט השדרה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות) בתנור 37 מעלות צלזיוס.
  3. הסר את הפתרון PBST ולהוסיף הפתרון נוגדנים משני (594 IgG מצומדות עז נגד ארנב, מדולל 1: 100 ב PBST) כדי לדגור הרקמה במשך 3 ימים על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את פתרון נוגדנים משני ולהוסיף 4 מיליליטר של PBST לשטוף מגזרי חוט השדרה 4 פעמים ביום (כל 6 שעות) על שייקר בתנור 37 מעלות צלזיוס. למחרת הרקמה מוכנה הדמיה.

הדמיה 3.

  1. הסר את הפתרון PBST ולהוסיף 4 מ"ל של גליצרול 85% על מנת להפוך את מקדם השבירה של הרקמה אפילו.
  2. לשים כמה טיפות של גליצרול 85% ליד רקמת חוט השדרה ו coverslip אותו עם כוס coverslip 22 x 50 מ"מ 2.
    הערה: הכיוון של חוט השדרה מחליט כיצד התמונה נראית.
  3. שים את השקופית זכוכית על מסגרת ההחזקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון ולהעביר את הרקמה לתוך מסלול האור.
  4. בחר את ננומטר לייזר נאון הליום קו 594 ולהתאים את עוצמת הלייזר לרמה אופטימלית על ידי בדיקת הבהירות של איתות חיובי בתמונה חיה.
  5. בחר את אזור הסריקה של רקמת חוט השדרה באמצעות המטרה 20X (במים, NA 0.7) ולהכין ליצור Z- מחסנית, ואת העומק של כל שלב מוגדר 3 מיקרומטר.
  6. סרוק את הרקמה מלמעלה לתחתית הערימה-z תחת objec 20Xמגני אוזניים ואז המטרה 63X (בשמן, NA 1.4) (גודל הצעד היה 1 מיקרומטר), בהתאמה. לשחזר קטעי וידאו 3D באמצעות תוכנת 3D 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סעיף זה מציג תוצאות מכתים נוגדן סרוטונין במוח שדרת העכבר השקוף באמצעות שילוב של CLARITY ופרוטוקולים מעוקבים. אנו מראים כי סיבי serotonergic נוכח בכל הרבדים של חוט השדרה עם דומיננטיות בחלק הגחוני של צופר הגחון (איור 1, ראו גם וידאו 1). רקמת הביקורת לא צריך סיבים חיוביים (תוצאה הייתה לא מוצגת). בקרן הגחון, סיבים serotonergic צפופים נמצאים בחלק הוונטרומדיאלי של צופר הגחון והם להאריך לכיוון החלק הלטרלי של צופר הגחון (איור 2, גם לראות וידאו 2). סיבי immunopositive חלק גם להאריך מן צופר הגחון כלפי הקרן הגבית או התעלה המרכזית. סיבי immunopositive נוכח בכל הרבדים של הקרן הגבה אך קיים פער קטן בין סיבי חיובי lamina 2 ו -4, במיוחד לרוחבחלק בקרן הגבית. רוב סיבי serotonergic בקרן הגבית הם בעלי קוטר קטן ורק מספר קטן מהם הם בעלי קוטר גדול (וידאו 1). בשנת קטע אופקי, סיבי serotonergic בצפיפות צופר הגחון נצפו לנסוע לאורך ציר האורך של חוט השדרה ויוצרים צרור סיבים גדול. הממצא המעניין ביותר הוא צרור סיבים גדול זה בעיות סניפים באופן קבוע לאורך ציר האורך, אשר הם בניצב צרור הסיבים. סניפים אלה נוספים ישעבדו בשעבוד בשבילים שלהם לחלק לרוחב של צופר הגחון. לעומת ענפים אלה, אלה האריכו לכיוון קו האמצע הם לא סדיר קטן (איור 2). תחת מטרת 63X, סיבי serotonergic בקרן הגבתה נצפו לנסוע לאורך הציר של חוט השדרה ומסתיימים בנקודות שונות לאורך הנתיב של הדרך. הסיבים העבים מופצים באופן ספוראדי בין f הדק ibers (איור 3, גם לראות וידאו 3).

איור 1
איור 1:. סיבים serotonergic ב קטע העטרה של חוט המותני בהגדלה 200X השמאל הוא צופר הגחון, נכון הוא בקרן הגבית, הגב הוא החלק המדיאלי של חוט השדרה, ועל הגחון הוא החלק לרוחב של חוט השדרה. סרגל הסולם הוא 100 מיקרומטר. סיבי serotonergic נוכח בכל הרבדים, במיוחד בחלק הוונטרומדיאלי של צופר הגחון שבו צפיפות הסיבים גבוהה. סיבים אלו להאריך הן כלפי החלק לרוחב של צופר הגחון וצופר תעלה או הגבי המרכזי. צפיפות סיבי רבדים אחרים היא נמוכה. רוב סיב serotonergic הם דקים. רק מספר קטן של סיבים עבים והם נתפסים בשני בקרן הגבית והצופר הגחון (> גם לראות 1 וידאו (קליק ימני להוריד)).

איור 2
איור 2:. סיבי serotonergic בחלק הגחוני של צופר הגחון בהגדלת 200X שמאל וימין הם הצדדים לרוחב של חוט השדרה, גב הוא החלק המקורי של חוט השדרה, ועל הגחון הוא חלק הזנב של חוט השדרה. סרגל הסולם הוא 100 מיקרומטר. סיבי serotonergic מוצגים נסיעה לאורך ציר האורך של חוט השדרה וארוזים החלק המדיאלי של צופר הגחון שם הם יוצרים צרור סיבים עבה. מתוך צרור זה, כמה סניפים מורחבות במרווחי זמן קבועים לכיוון החלק הלטרלי של קרן הגחון, בעוד שאחרים, המשתפלים לעבר קו האמצע הם לא סדירים וקצרים. סיבים אלו לסיים בנקודות רבות לאורך השביל של דרכי ( גם לראות וידאו 2(קליק ימני להוריד)).

איור 3
איור 3: סיבים serotonergic בקרן הגבית תחת בהגדלה 630X השמאל הוא החלק לרוחב של חוט השדרה, נכון הוא החלק המדיאלי של חוט השדרה, הגב ועל הגחון מתייחסים הגבי וחלק הגחון של הקרן הגבית, בהתאמה. . סרגל הסולם הוא 7 מיקרומטר. סיבי serotonergic הנסיעה לאורך ציר האורך של חוט השדרה ולסיים לאורך השביל של הדרך. סיבים אלו הם בעיקר בעלי קוטר קטן עם מספר קטן של סיבים עבים התערבבו. סיבים אלו לעתים נדירות חופפים זה לזה ( ראה גם 3 וידאו (קליק ימני להוריד) ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר מראה כיצד סיבי serotonergic תמונה בחוט השדרה עכבר עם CLARITY בשילוב וטכניקות מעוקב. הוא מציג תהליך סליקה מהר לעומת פרוטוקול הסליקה הפסיבי שפותח על ידי Cheung et al. 14 והתומר et al. 15 ומאפשר רקמת חוט השדרה כדי להיות נתמך היטב על ידי הידרוג'ל במהלך סליקה.

צעד חשוב במהלך קיבעון של חוט השדרה עכבר, כפי שדווח על ידי Cheung et al. 14 ותומר et al. 15, היא לשמור את כל הפתרונות לצנן על קרח, אשר מונע פילמור של כימיקלים. השלב הקריטי השני הוא perfuse העכבר לאט עם הפתרון הידרוג'ל על מנת למנוע נפיחות של רקמת העצבים. לקבלת הפתרון הידרוג'ל להפוך ג'ל, סילוק גזים נדרש. כחלופה זה, השתמשנו parafilm כדי לכסות את החלק העליון של הצינור השאירו בועות אוויר בין hydפתרון רוגל ואת parafilm. זה עבד טוב מאוד והפתרון הידרוג'ל הפך ג'ל לאחר כמה שעות. למרות שחלק בועות נמצאו בתוך הג'ל, הם לא התערבו עם הניסויים הבאים, אשר באה לידי ביטוי על ידי היעדר בועות רקמת חוט השדרה. סליקה היא השלב הקריטי ביותר, ומחייבת שילוב של חומרים כימיים. פתרון הסליקה, המכיל אמינו-אלכוהול, מסיר את השומנים של רקמת חוט השדרה הרבה יותר מהר מאשר פתרון סליקת SDS / הבור מבוסס חומצה בשימוש בפרוטוקול CLARITY המקורי 16.

היתרון של בהירות מעוקבת לעומת טכניקות immunohistochemical מסורתיות הוא כי גוש הרקמה כולה ניתן הדמיה ללא חתך את הרקמה, וכתוצאה מכך, את ההמשכיות של סיבי serotonergic נשמרת, וזה ניתן להתחקות אחר אותו סיבים עבור למרחקים ארוכים בתוך Z- המחסנית. עם יתרון זה, ניתן לזהות collateralization בביטחון עם תמונות 3D,nd מסקנות רומן ולכן יכולים להתבצע על אופי מסלולי serotonergic. הפרוטוקול המתואר הוא כלי נוח לחקירה של מערכות סיבים, כמו גם גרעינים פשוט על ידי תיוג הרקמות עם נוגדנים ספציפיים. טכניקה זו היא גם בחירה אידיאלית עבור חוקר מערכות שונות במוח העכבר אותו באמצעות תיוג כפול או משולש. בהגדרה במעבדה שלנו, מיקרוסקופ פלואורסצנטי רב פוטון היה זמין עם מרחק עבודה של כ 300 מיקרומטר. זה מגביל את תדמיתנו עד למקסימום של 600 מיקרומטר אם שני הצדדים של הרקמה נסרקים. עם זאת, מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליון, יכול תמונה במוח העכבר כולו וחוט שדרה דרך הרוחב, האורך והעומק המלא שלהם. היתרון השני של שיטה זו הוא כי הנוגדנים ניתן eluted ואז עוד נוגדן או נוגדנים שונים להחיל שוב לאותה רקמה. פעולה זו מפחיתה את השימוש בבעלי חיים באופן משמעותי כמו גם את העלויות הכרוכות בהכנת רקמות מוח חדשיםעבור כל ניסוי. מאותה הסיבה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות. כבר היו מחקרים שנערכו על הריאות, הכליות, הלב, המעי, ואת רקמת הגידול 26,27.

ישנן גם מגבלות על הטכניקה הזו, למשל, את הגרעינים raphe ב למוח האחורי העכבר מכיל סוגים רבים של נוירונים, כולל נוירונים GABAergic. למרות בהירות מעוקב תאפשר לחקר התפלגות הסוגים השונים של סיבי raphespinal בתוך מוח עכבר אחת וחוט שדרה. אלה נוירונים, אשר אינם מזוהים באופן ספציפי על ידי נוירוטרנסמיטורים או סמנים חלבוניים שלהם, לא ניתן לזהות בעת השימוש בהגדרה זו. חלופה אחת היא לתייג את נוירונים ספציפיים או מערכות סיבים עם בדיקות חומצות גרעין כמו הכלאה באתרו. זהו, ומצד שני, מוגבל על ידי מערכת תיוג במסננים הזמינים עבור דימות פלואורסצנטי. הדמיה כל סיבי raphespinal ולכן עדיין מהווה אתגר.אם טכניקות אלה אוחדו עם זריקה תוך-גולגולתי של נותב האנטרוגרד (כגון leucoagglutinin שעועית מצוי - PHA-L), אפשר יהיה לראות סיבי serotonergic, סיבי GABAergic, ואחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Photoinitiator VA044 Wako va-044/225-02111 http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution Bio Rad 161-0140 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution Bio Rad 161-0142 http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31-
879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde Sigma 158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea Merck Millipore 66612 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine Merck Millipore 821940 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100 Merck Millipore 648462 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose Sigma S0389 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody Merck Millipore AB938 http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate Life Technologies  A-11012 https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope Leica Leica TCS SP5 MP STED http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
  2. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  3. Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
  4. Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
  5. Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
  6. Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
  7. Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
  8. Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
  9. Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
  10. Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
  11. Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
  12. Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
  13. Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  15. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  16. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  17. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  18. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  19. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  21. Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
  22. Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
  23. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
  24. Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
  25. Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  26. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).

Tags

Neuroscience גיליון 108 Neuroscience חוט השדרה עכבר CLARITY מעוקב raphespinal סיום סיבים הנוירוטרנסמיטר
הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liang, H., Schofield, E., Paxinos,… More

Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J. Vis. Exp. (108), e53673, doi:10.3791/53673 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter