Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Abstract

Aflopend lange vezels aan het ruggenmerg essentieel voor vervoer, pijnperceptie en andere gedragingen. De vezelafwerking patroon in het ruggenmerg van de meerderheid van deze vezels systemen niet grondig onderzocht bij soorten. Serotonerge vezels, die uitsteken in het ruggenmerg, zijn onderzocht bij ratten en buidelratten op histologische secties en hun functionele betekenis is afgeleid op basis van hun vezelafwerking patroon in het ruggenmerg. Met de ontwikkeling van de duidelijkheid en vierkante technieken is het mogelijk dit vezelsysteem en de verdeling ervan in het ruggenmerg, die waarschijnlijk eerder onbekende eigenschappen van serotonerge supraspinale wegen onthullen onderzoeken. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het afbeelden van de serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met behulp van de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Bij deze methode wordt perfusie van een muis met een hydrogel oplossing en verduidelijking van het weefsel met een combinatie van clearing reagentia. Ruggenmerg werd ontruimd in iets minder dan twee weken, en de daaropvolgende immunofluorescentiekleuring tegen serotonine werd in minder dan tien dagen afgerond. Met een multi-foton fluorescentiemicroscoop, werd het weefsel afgetast en een 3D beeld gereconstrueerd met behulp Osirix software.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures waarbij proefdieren volgen de richtlijnen van de Animal Care en Ethische Commissie (ACEC) aan de Universiteit van New South Wales (de goedgekeurde ACEC nummer 14 / 94A).

1. Voorbereiding van de Transparent Mouse Spinal Cord

1. Bereiding van Ice Cold Hydrogel Solution
   1. Bereiding van 16% paraformaldehyde oplossing (PFA)
      1. Voeg 16 g paraformaldehyde poeder in 70 ml voorverwarmd gedistilleerd water (50-55 ° C) en roeren op een verhitte magnetische roerder totdat paraformaldehyd opgelost. Opmerking: Zorg ervoor dat de oplossing tot meer dan 55 ° C te verwarmen en te beseffen dat paraformaldehyde is giftig.
      2. Breng de paraformaldehyde oplossing voor een cilinder en gedestilleerd water tot 100 ml. Koel het paraformaldehyde oplossing met een 4 ° C koelkast.
   2. Oplossen 125 mg VA-044 initiator in 26,25 ml gedestilleerd water en laat de oplossing in een 4° C koelkast.
   3. Koel 5 ml acrylamide-oplossing (40%), 1,25 ml Bis-oplossing (2%) (NB: Bis en acrylamide oplossingen toxisch, kan genetische schade veroorzaken of kanker), 5 ml 10 x PBS, 12,5 ml 16% PFA oplossing en de VA-044 initiator oplossing op het ijs.
   4. Meng de bovenstaande oplossingen op ijs.
      Let op: het totale volume is 50 ml.
2. Perfusie en Collectie van de Muis Spinal Cord
   1. Verdoven een muis met een intraperitoneale injectie van ketamine (80 mg / kg) en xyzaline (5 mg / kg) verdund in 0,9% fysiologische zoutoplossing. De dosering voor muis lager dan die van ratten.
   2. Op een geschikte kunststof oppervlak in een zuurkast, bevestig de ledematen van de muis van het lichaam (plakband voldoende) zodra de muis niet reageert op een snuifje haar huid van de voet.
   3. Snijd de muis huid over de borst en vervolgens het bot borstkas naar het hart bloot te leggen met een schaar.
   4. Met behulp van een peristaltische pomp, met een 25 G naald bevestigd aan The uiteinde van de buis, steek de naald in de linker ventrikel van het hart, knip de rechter atrium om een ​​uitgang voor het bloed te maken en dan beginnen wassen met 40 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing een snelheid van ongeveer 10 ml / min.
   5. Als het klaar is, perfuseren de muis met 35 ml ijskoude hydrogel oplossing.
      Opmerking: perfuseren met een snelheid van 10 ml / min tot zwelling van het zenuwweefsel te voorkomen.
   6. Incise de huid over de rug met een mes en verwijder vervolgens de spieren naast de gewervelde. Na het snijden van de wervelbogen enerzijds en hen flipping aan de andere kant, neem het ruggenmerg van de wervelkolom met een fijne schaar.
3. Wissen van de muis Spinal Cord
   1. Plaats het ruggenmerg in 15 ml hydrogel oplossing overnacht bij 4 ° C.
   2. Verwijder 10 ml van de hydrogel oplossing en giet de rest van de oplossing met de ruggenmergsegmenten een 5 ml buisje. Vul het 5 ml buis met de hydrogel oplossing tot het volledig vol.
   3. Stretch een klein stukje parafilm over de bovenkant van de 5 ml buis en wikkel parafilm rond de hals van de buis. Let op: Zorg ervoor dat de parafilm contact op met de hydrogel oplossing en er zijn geen luchtbellen tussen de hydrogel oplossing en de parafilm.
   4. Zet de buis 5 ml in een 37   ° C oven gedurende de nacht. Let op de hydrogel oplossing totdat het wordt een gel.
   5. Neem de 5 ml buis uit de oven en verwijder de gel uit de buis met een sleutel (zoals een geschept 1 ml pipet tip). Verwijder de gel uit het ruggenmerg weefsel door het steken van de grove weefsel aan de gel en neem dan de grove weefsel weg (de gel zal vasthouden aan het weefsel en zal daarom worden verwijderd door het weefsel).
   6. Na het verwijderen van de gel uit het ruggenmerg weefsel, was het ruggenmerg 4 maal met 1 x PBS (pH 7,4) gedurende 24 uur op een schudapparaat.
   7. Bereid de CUBIC clearingoplossing door het oplossen van 3,85 g ureum en 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml gedestilleerd water.
      Opmerking: Een hete roerder wordt gebruikt. Voeg 2,31 g polyethyleenglycol-mono-p-isooctylfenylether / Triton X-100 aan de oplossing zodra duidelijk is en afkoelt tot kamertemperatuur.
      Opmerking: 10 g van deze drie stoffen zijn voor één muis.
   8. Snijd de muis ruggenmerg coronaal in 2-3 mm lange segmenten met een scheermesje en ze in 5 ml van de bovenstaande CUBIC clearingoplossing. Plaats op een schudder in de oven op 37   ° C gedurende 3 dagen.
   9. Drie dagen later, verander de clearing oplossing voor een nieuwe. Noot: de bovenstaande oplossing wordt vóór gebruik bereid.
   10. Twee tot drie dagen later na het vernieuwen van de CUBIC clearing oplossing, controleert u de transparantie van het weefsel tegen een papier met lettertype 8 letters. Als het transparant, kan de brieven worden gezien door het gewiste weefsel. Verwijder de clearingoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) om het weefsel 4 maal per dag (om de 6 uur) was.

1. Incubeer het ruggemerg segmenten in de primaire antilichaamoplossing (anti-serotonine, opgewekt in konijnen, verdund 1: 100 in PBST) gedurende 3 dagen op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
2. Verwijder de antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) bij de ruggenmergsegmenten 4 maal per dag (om de 6 uur) in een 37 ° C oven te wassen.
3. Verwijder de PBST-oplossing en voeg de secundaire antilichaamoplossing (594 geconjugeerd geit anti-konijn IgG, verdund 1: 100 in PBST) om het weefsel gedurende 3 dagen geïncubeerd op een schudinrichting in een 37 ° C oven.
4. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en voeg 4 ml PBST de ruggenmergsegmenten 4 keer wassen per dag (om de 6 uur) op een schudinrichting in een 37 ° C oven. De volgende dag het weefsel gereed voor beeldvorming.

3. Imaging

1. Verwijder de PBST-oplossing en voeg 4 ml 85% glycerol aan de brekingsindex van het weefsel zelfs.
2. Doe een paar druppels 85% glycerol naast het ruggenmerg weefsel en dekglaasje met een 22 x 50 mm glazen dekglaasje ^2.
   Opmerking: De oriëntatie van het ruggenmerg bepaalt hoe het beeld eruit ziet.
3. Zet het glaasje op het bedrijf kader van de multi-foton fluorescentie microscoop en verplaatsen het weefsel in het licht pad.
4. Kies het Helium Neon laser lijn 594 nm en de intensiteit van de laser om het optimale niveau van de helderheid van het positieve signaal in het live-beeld te controleren.
5. Selecteer het scangebied van het ruggenmerg weefsel met de 20X objectief (in water, NA 0,7) en zet een z-stack maken, en de diepte van elke ingesteld op 3 pm stap.
6. Scan het weefsel van de bovenkant naar de onderkant van de z-stack onder 20X bezwaartieve en dan 63x objectief (in olie, NA 1.4) (stap grootte was 1 micrometer), respectievelijk. Reconstrueren 3D-video's met behulp van een 3D-software ^28.

Representative Results

Dit gedeelte toont de resultaten van serotonine antilichaam kleuring in de transparante muis ruggenmerg met behulp van een combinatie van duidelijkheid en CUBIC protocollen. We tonen aan dat serotonerge vezels in alle lagen van het ruggenmerg met een overwicht in het ventrale gedeelte van de ventrale hoorn zijn (figuur 1, zie ook Video 1). De controleweefsel geen positieve vezels (resultaat niet getoond). In de ventrale hoorn, dicht op elkaar gepakte serotonerge vezels aanwezig in het ventromedial deel van het ventrale hoorn zijn en ze uit te breiden in de richting van het laterale deel van het ventrale hoorn (figuur 2, kunt u eveneens Video 2). Sommige immunopositive vezels ook uitstrekken van de ventrale hoorn naar de dorsale hoorn of het centrale kanaal. Immunopositive vezels in alle lagen van de dorsale hoorn maar er is een kleine ruimte tussen positieve vezels in laminaat 2 en 4, met name in de lateraleeen deel van de dorsale hoorn. De meerderheid van serotonerge vezels in de dorsale hoorn van geringe diameter en slechts een klein aantal van hen zijn grote diameter (Video 1). In een horizontale doorsnede, werden dichtgepakte serotonerge vezels in de ventrale hoorn waargenomen langs de lengteas van het ruggenmerg en vormen een grote vezelbundel. De meest interessante bevinding is dat dit grote vezelbundel afgeeft takken regelmatig langs de longitudinale as, die loodrecht op de vezelbundel zijn. Deze takken verder collateralize langs hun paden naar het laterale deel van het ventrale hoorn. Vergeleken met deze takken, degenen uitstrekt naar de middellijn onregelmatig en kleinere (figuur 2). Onder het 63x objectief werden de serotonerge vezels in de dorsale hoorn waargenomen langs de as van het ruggenmerg en eindigen op verschillende punten langs het pad van de luchtwegen. De dikke vezels worden sporadisch verdeeld over de dunne f IBERS (figuur 3, kunt u eveneens Video 3).

Figuur 1:. Serotonerge vezels in een coronale deel van de lendewervelkolom bij 200X vergroting Links is de ventrale hoorn, rechts de dorsale hoorn, dorsaal is het mediale deel van het ruggenmerg en ventrale is het laterale deel van het ruggenmerg. De schaal bar is 100 micrometer. Serotonerge vezels in alle lagen, vooral in de ventromediale deel van de ventrale hoorn, waar de vezel dichtheid hoog. Deze vezels uit te breiden in de richting van zowel de laterale deel van het ventrale hoorn en het centrale kanaal of de dorsale hoorn. De dichtheid van vezels in laminae andere laag. De meeste serotonerge vezels dun. Slechts een klein aantal vezels dik en ze worden gezien zowel in de dorsale hoorn en de ventrale hoorn (> zie ook Video 1 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden)).

Figuur 2:. Serotonerge vezels in het ventrale gedeelte van de ventrale hoorn bij 200X vergroting Links en rechts zijn de zijkanten van het ruggenmerg, dorsale het rostrale deel van het ruggenmerg en ventrale is het caudale deel van het ruggenmerg. De schaal bar is 100 micrometer. Serotonerge vezels getoond die langs de lengteas van het ruggenmerg en verpakt in het middengedeelte van de ventrale hoorn vormen daar een dikke vezelbundel. Uit deze bundel, zijn sommige takken uitgebreid met regelmatige tussenpozen in de richting van het laterale deel van de ventrale hoorn, terwijl anderen die zich uitstrekken in de richting van de middellijn zijn onregelmatig en korter. Deze vezels te beëindigen op veel punten langs het pad van de luchtwegen ( zie ook Video 2(Klik met de rechtermuisknop om te downloaden)).

Figuur 3: Serotonerge vezels in de dorsale hoorn onder ten 630X vergroting Links is de zijkant van het ruggenmerg, rechts het mediale deel van het ruggenmerg, dorsale en ventrale betrekking op de dorsale en ventrale deel van de dorsale hoorn, respectievelijk. . De schaal bar is 7 micrometer. Serotonerge vezels reist langs de lengteas van het ruggenmerg en eindigen langs het pad van de luchtwegen. Deze vezels zijn hoofdzakelijk van kleine diameter met een klein aantal dikke vezels vermengd. Deze vezels zelden overlappen elkaar ( zie ook Video 3 (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) ).

Discussion

Het protocol beschreven laat zien hoe je het serotonerge vezels in de muis ruggenmerg met de gecombineerde DUIDELIJKHEID en CUBIC technieken. Er wordt een snellere zuiveringsproces ten opzichte van de passieve clearing protocol ontwikkeld door Cheung et al. ¹⁴ en Tomer et al. ¹⁵ en maakt het ruggenmerg weefsel goed worden ondersteund door de hydrogel tijdens het wissen.

Een belangrijke stap bij vastlegging van de muis ruggenmerg, zoals gerapporteerd door Cheung et al. ¹⁴ en Tomer et al. ^15, moet blijven alle oplossingen afkoelen op ijs, dat de polymerisatie van de chemische stoffen voorkomt. De andere belangrijke stap is de muis langzaam perfuseren met de hydrogel oplossing om zwelling van het zenuwweefsel te voorkomen. Voor de hydrogel oplossing een gel is geworden, ontgassing vereist. Als alternatief voor deze, gebruikten we parafilm naar de top van de buis bedekken en lieten geen luchtbellen tussen de hydRogel oplossing en de parafilm. Dit werkte goed en de hydrogel oplossing werd een gel na enkele uren. Hoewel sommige luchtbellen werden gevonden in het gel, hebben ze geen invloed op de volgende experimenten, waarin werd aangetoond door het ontbreken van bellen in het ruggenmerg weefsel. Clearing is de meest kritische stap, en vereist een combinatie van reagentia. De clearing-oplossing, die amino-alcohol, verwijdert het lipide van het ruggenmerg weefsel veel sneller dan de SDS / boorzuur gebaseerd clearing oplossing die wordt gebruikt in de originele DUIDELIJKHEID protocol ^16.

Het voordeel van de duidelijkheid en Cubic opzichte van traditionele immunohistochemische technieken is dat het gehele weefsel blok worden afgebeeld zonder snijden van het weefsel, als gevolg, wordt de continuïteit van de serotonerge vezels behouden, en het is mogelijk om dezelfde vezel te volgen over een lange afstand in de z-stack. Met dit voordeel, kan collateralization vertrouwen worden geïdentificeerd met de 3D-beelden, eennd nieuwe conclusies kunnen derhalve worden gemaakt over de aard van serotonerge trajecten. De beschreven protocol is een handig hulpmiddel voor het onderzoek van vezelsystemen, alsmede kernen door eenvoudig de weefsel specifieke antilichamen labelen. Deze techniek is ook een ideale keuze voor het ondervragen van verschillende systemen in dezelfde hersenen van muizen met behulp van dubbele of drievoudige labeling. In ons laboratorium omgeving, een multi-foton fluorescentiemicroscoop werd aangeboden met een werkafstand van ongeveer 300 urn. Dit beperkt ons beeld ten hoogste 600 urn als beide zijden van het weefsel worden gescand. Echter, een lichte blad fluorescentiemicroscoop, kan het imago van de hele muis hersenen en het ruggenmerg door middel van hun volledige breedte, lengte en diepte. Het andere voordeel van deze techniek is dat de antilichamen kunnen worden geëlueerd en vervolgens nog eens verschillende antilichaam of antilichamen opnieuw tot hetzelfde weefsel. Dit vermindert aanzienlijk dierlijk gebruik en de kosten voor het bereiden nieuwe hersenweefselvoor elk experiment. Om dezelfde reden kan deze techniek worden toegepast op andere weefsels. Er zijn reeds onderzoeken uitgevoerd naar de longen, nieren, hart, darm en tumorweefsel ^26,27.

Er zijn ook beperkingen aan deze techniek, bijvoorbeeld de raphe nuclei in de muis achterhersenen bevat vele soorten neuronen, inclusief GABAerge neuronen. Hoewel CLARITY en Cubic zal voor de studie van de distributie van de verschillende soorten raphespinal vezels in een enkele muis hersenen en het ruggenmerg. Die neuronen, die niet specifiek worden geïdentificeerd door hun neurotransmitters of eiwit markers kunnen niet worden geïdentificeerd daarin. Een alternatief is de specifieke neuronen of vezel systemen nucleïnezuurprobes label zoals in situ hybridisatie. Dit is anderzijds beperkt door de etikettering en de beschikbare filters voor fluorescentie beeldvorming. Beeldvorming alle raphespinal vezels blijft dus een uitdaging.Als deze technieken werden gecombineerd met een intracraniële injectie van een anterograde tracer (zoals Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), is het misschien mogelijk om serotonerge vezels, GABAergic vezels, en anderen te zien.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/