Abstract
Langabsteigenden Fasern auf das Rückenmark sind für die Fortbewegung, die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen. Die Faserabschlußmuster im Rückenmark der Mehrheit dieser Fasersysteme wurden nicht gründlich in einer beliebigen Spezies untersucht. Serotonergen Fasern, die an das Rückenmark projizieren, wurden in Ratten und opossums auf histologischen Schnitten und ihre funktionelle Bedeutung abgeleitet wurde im Rückenmark auf ihre Faserabschlußmuster untersucht basiert. Mit der Entwicklung der Klarheit und kubischem Techniken ist es möglich, dieses Fasersystem und seiner Verteilung in das Rückenmark zu untersuchen, die bisher unbekannte Eigenschaften von serotonergen supraspinal Wege aufzuzeigen wahrscheinlich ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus die kombinierte CLARITY und CUBIC Techniken. Das Verfahren beinhaltet die Perfusion einer Maus mit einem Hydrogel-Lösung und Klärung des Gewebes mit einer combination Reagenzien zu löschen. Rückenmarksgewebe wurde in knapp zwei Wochen und die anschließende Immunfluoreszenzanfärbung gegen Serotonin gelöscht wurde in weniger als zehn Tagen abgeschlossen. Mit einem Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskop wurde das Gewebe abgetastet und ein 3D-Bild rekonstruiert wurde Osirix Software.
Protocol
Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) an der University of New South Wales (die zugelassene ACEC Nummer 14 / 94A).
1. Herstellung des Transparent-Maus Spinal Cord
- Herstellung von Ice Cold Hydrogellösung
- Herstellung von 16% Paraformaldehyd-Lösung (PFA)
- In 16 g Paraformaldehydpulver in 70 ml vorgewärmten destilliertem Wasser (50-55 ° C) und unter Rühren auf einem beheizten Magnetrührer bis Paraformaldehyd gelöst ist. Hinweis: Nicht in die Lösung über 55 ° C zu erwärmen und sich bewusst sein, dass Paraformaldehyd toxisch ist.
- Übertragen Sie die Paraformaldehydlösung zu einem Zylinder und mit destilliertem Wasser auf 100 ml. Kühlen Sie die Paraformaldehydlösung eine 4 ° C Kühlschrank mit.
- Man löst 125 mg VA-044-Initiator in 26,25 ml destilliertem Wasser und kühlt die Lösung in einem 4° C Kühlschrank.
- Cool 5 ml Acrylamidlösung (40%), 1,25 ml Bis-Lösung (2%) (ACHTUNG: Bis und Acrylamid-Lösungen sind giftig, können genetische Defekte oder Krebs verursachen), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA-Lösung und die VA-044 Initiatorlösung auf Eis.
- Mischen Sie die oben genannten Lösungen auf Eis.
Bemerkung: das Gesamtvolumen 50 ml beträgt.
- Herstellung von 16% Paraformaldehyd-Lösung (PFA)
- Perfusions und Sammlung der Maus Spinal Cord
- Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und xyzaline (5 mg / kg) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Die Dosierung für die Maus kann für Ratten als niedriger sein.
- Auf einem geeigneten Kunststoffoberfläche in einer Abzugshaube, befestigen Sie die Schenkel der Maus vom Körper weg (Klebeband ist wirksam), sobald die Maus auf eine Prise seiner Haut des Fußes reagiert nicht.
- Schneiden Sie die Maus Haut über der Brust und dann die Knochen Brust das Herz mit einer Schere zu belichten.
- Mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit einer 25 G Nadel befestigt Atee Ende des Schlauchs, legen Sie die Nadel in den linken Ventrikel des Herzens, schnippeln in den rechten Vorhof ein Ausgangspunkt für das Blut zu schaffen und dann mit 40 ml 0,9% physiologischer Kochsalzlösung mit einer Rate von etwa 10 ml / min beginnen Waschen.
- Wenn Sie fertig sind, perfuse die Maus mit 35 ml eiskaltem Hydrogel-Lösung.
Anmerkung: mit einer Geschwindigkeit von 10 ml perfundieren / min Quellung des Nervengewebes zu vermeiden. - Inzision in die Haut über den Rücken mit einem Messer und dann die Muskeln entfernen neben dem wirbel. der Wirbelbögen, auf der einen Seite nach dem Schneiden und sie auf die andere Seite, nehmen Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule mit einer feinen Schere Spiegeln.
- Löschen der Maus Spinal Cord
- Legen Sie das Rückenmark in 15 ml Hydrogel-Lösung über Nacht bei 4 ° C.
- Entfernen Sie 10 ml des Hydrogels Lösung und gießen Sie den Rest der Lösung mit den Rückenmarksegmente zu einem 5-ml-Tube. Füllen Sie das 5-ml-Röhrchen mit dem Hydrogel-Lösung, bis er vollständig gefüllt ist.
- Strecken Sie ein kleines Stück Parafilm über den oberen Teil der 5-ml-Tube und dann wickeln Parafilm um den Hals des Rohres. Hinweis: Achten Sie darauf, die Kontakte Parafilm das Hydrogel-Lösung und es gibt keine Blasen zwischen dem Hydrogel-Lösung und der Parafilm.
- Setzen Sie die 5-ml-Röhrchen in einem 37 Ofen über Nacht ° C. Beachten Sie die Hydrogel-Lösung, bis es ein Gel wird.
- Nehmen Sie die 5-ml-Röhrchen aus dem Ofen heraus und entfernen Sie das Gel aus der Tube mit einem Schraubenschlüssel (wie ein geschaufelt 1 ml Pipettenspitze). Entfernen Sie das Gel aus dem Rückenmarksgewebe durch das grobe Gewebe auf das Gel kleben und dann die groben Gewebe entfernt (das Gel mit dem Gewebe haften und wird daher von dem Gewebe entfernt werden).
- das Gel aus dem Rückenmarksgewebe, waschen das Rückenmark 4-mal mit 1x PBS (pH 7,4) für 24 Stunden auf einem Schüttler Nach dem Entfernen.
- Bereiten Sie die CUBIC Clearing-Lösung durch Auflösen von 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N ', N'-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml destilliertem Wasser.
Hinweis: Ein heißer Rührer verwendet wird. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und kühlt auf Raumtemperatur.
Hinweis: 10 g dieser drei Chemikalien sind für eine Maus. - Schneiden Sie das Rückenmark der Maus koronalen in 2-3 mm lange Segmente mit einer Rasierklinge und steckte sie in 5 ml der obigen CUBIC Clearing-Lösung. Platzieren auf einem Schüttler in dem Ofen bei 37 ° C für 3 Tage.
- Drei Tage später, ändern Sie die Clearing-Lösung auf ein frisches. Anmerkung: Die obige Lösung wird vor der Verwendung hergestellt.
- Zwei bis drei Tage später nach der CUBIC Clearing-Lösung erfrischend, überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes gegen ein Papier mit Schrift 8 Buchstaben. Wenn es transparent ist, können die Buchstaben durch die gelöscht Gewebe zu sehen. Entfernen Sie die Clearing-Lösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) das Gewebe 4-mal pro Tag (alle 6 Stunden) zu waschen.
- Inkubieren der Rückenmarksegmente in der primären Antikörperlösung (anti-Serotonin, in rabbit angehoben, verdünnt 1: 100 in PBST) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C.
- Entfernen Sie die Antikörperlösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), um die Rückenmarksegmente 4 mal pro Tag (alle 6 Stunden) in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen.
- Entfernen Sie die PBST-Lösung und fügen Sie den sekundären Antikörper-Lösung (594 konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, 1: 100 verdünnt in PBST), um das Gewebe für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C Ofen inkubiert.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und 4 ml PBST Rückenmark Segmente 4-mal täglich zu waschen (alle 6 Stunden) auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. Am nächsten Tag ist das Gewebe für die Bildgebung bereit.
3. Imaging
- Entfernen Sie die PBST-Lösung und 4 ml 85% Glycerin auch den Brechungsindex des Gewebes zu machen.
- Ein paar Tropfen von 85% Glycerin neben dem Rückenmarksgewebe und das Deckglas mit einem 22 x 50 mm 2 Deckglas.
Hinweis: Die Ausrichtung des Rückenmarks entscheidet, wie das Bild aussieht. - Setzen Sie den Glasobjektträger auf den Halterahmen des Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskop und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen.
- Wählen Sie den Helium-Neon-Laser-Linie 594 nm und stellen Sie die Intensität des Lasers auf das optimale Niveau, indem die Helligkeit des positiven Signals im Livebild zu überprüfen.
- Wählen Sie den Scanbereich des Rückenmarksgewebe das 20x-Objektiv mit (in Wasser, NA 0,7) und bereiten Sie einen Z-Stapel zu schaffen, und die Tiefe jeder Schritt auf 3 & mgr; m.
- Scannen Sie das Gewebe von oben nach unten in der z-Stapel unter dem 20X objective und 63X Ziel dann (in Öl, NA 1,4) (Schrittweite betrug 1 & mgr; m) sind. Rekonstruieren von 3D - Videos mit einer 3D - Software - 28.
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Representative Results
Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse von Serotonin-Antikörper-Färbung in der transparenten Rückenmark der Maus eine Kombination aus der CLARITY und CUBIC-Protokolle. Wir zeigen , dass serotonerge Fasern in allen Schichten des Rückenmarks vorhanden sind , mit einer Vorherrschaft im ventralen Teil des ventralen Horn (Abbildung 1, siehe auch Video 1). Das Kontrollgewebe hatte keine positive Fasern (Ergebnis nicht gezeigt). Im ventralen Horn, dicht gepackte serotonergen Fasern im ventromedialen Teil des Vorderhorn vorhanden sind , und sie erstrecken sich in Richtung des seitlichen Teils des Vorderhorn (2, siehe auch Video 2). Einige immunopositive Fasern erstrecken sich auch von der ventralen Horn in Richtung des Hinterhorn oder den zentralen Kanal. Immunopositiv Fasern sind in allen Schichten des dorsal horn aber es gibt eine kleine Lücke zwischen positiven Fasern in Lamina 2 und 4, insbesondere in lateralerTeil des Hinterhorns. Die Mehrzahl der serotonergen Fasern im dorsalen Horn sind von kleinem Durchmesser und nur eine geringe Anzahl von ihnen sind von großem Durchmesser (Video 1). In einem Horizontalschnitt, dicht gepackten serotonergen Fasern in der ventralen Horn wurden entlang der Längsachse des Rückenmarks und bilden eine große Faserbündel zu reisen beobachtet. Die interessanteste Ergebnis ist, dass diese große Faserbündel ausgibt Zweige regelmäßig entlang der Längsachse, die auf das Faserbündel senkrecht sind. Diese Zweige weiter entlang ihrer Bahn zu den seitlichen Teil des Ventralhorn besichern. Verglichen mit diesen Zweigen, sind die , die in Richtung der Mittellinie erstreckende unregelmäßig und geringer (Abbildung 2). Unter dem 63X Ziel wurden die serotonerge Fasern in den dorsalen Horn an verschiedenen Punkten entlang der Bahn des Trakts entlang der Achse des Rückenmarks und enden zu reisen beobachtet. Die dicken Fasern sind unter der dünnen f sporadisch verteilt Ibers (Abbildung 3, siehe auch Video 3).
Abb . 1: Serotonerge Fasern in einem koronalen Abschnitt der Lendenwirbel bei 200 - facher Vergrößerung links ist das Vorderhorn, rechts ist das Hinterhorn, dorsalen medialen Teil des Rückenmarks ist, und ventralen ist der seitliche Teil des Rückenmarks. Der Maßstab beträgt 100 & mgr; m. Serotonergen Fasern sind in allen Schichten, insbesondere im ventromedialen Teil des ventralen Horn, wo die Faserdichte hoch ist. Diese Fasern erstrecken sich in Richtung sowohl der lateralen Teil des Vorderhorn und dem zentralen Kanal oder Hinterhorn. Die Dichte der Fasern in anderen Schichten ist gering. Die Mehrheit der serotonergen Fasern sind dünn. Nur eine kleine Anzahl von Fasern sind dick, und sie sind sowohl in der dorsalen Horn und der ventralen Horn gesehen (> siehe Video 1 (Rechtsklick zum Download) auch).
Fig . 2: Serotonerge Fasern im ventralen Teil des ventralen Horns bei 200facher Vergrößerung links und rechts sind die seitlichen Seiten des Rückenmarks, dorsal ist die rostral Teil des Rückenmarks und ventral ist der kaudalen Teil des Rückenmarks. Der Maßstab beträgt 100 & mgr; m. Serotonergen Fasern gezeigt entlang der Längsachse des Rückenmarks zu reisen und in dem mittleren Abschnitt des ventralen Horn gepackt, wo sie eine dicke Faserbündel bilden. Aus diesem Bündel sind einige Zweige in regelmäßigen Abständen in Richtung der seitlichen Teil des ventralen Horn erweitert, während andere, die in Richtung der Mittellinie erstrecken sind unregelmäßig und kürzer. Diese Fasern an vielen Punkten entlang des Pfads des Traktes beenden ( siehe auch Video 2(Rechtsklick zum Herunterladen)).
Abbildung 3: Serotonerge Fasern im dorsalen Horn unter bei 630X Vergrßerung Links ist das Seitenteil des Rückenmarks, richtig die mediale Teil des Rückenmarks ist, dorsalen und ventralen zur dorsalen beziehen und ventralen Teil des dorsal horn, respectively. . Der Maßstab ist 7 um. Serotonergen Fasern entlang der Längsachse des Rückenmarks auf Reisen sind und entlang dem Weg des Traktes beenden. Diese Fasern sind hauptsächlich mit kleinem Durchmesser mit einer kleinen Anzahl von dicken Fasern verwirbelt. Diese Fasern selten einander überlappen ( siehe auch Video 3 (Rechtsklick zum Herunterladen) ).
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Discussion
Das Protokoll beschrieben zeigt, wie auf Bild serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus mit dem kombinierten CLARITY und CUBIC Techniken. Es wird ein schneller Clearing - Prozess im Vergleich zum passiven Clearing - Protokoll von Cheung et al. Entwickelte 14 und Tomer et al. 15 und ermöglicht es dem Rückenmarksgewebe gut durch das Hydrogel während Clearing unterstützt werden.
Ein wichtiger Schritt bei der Fixierung der Rückenmark der Maus, wie von Cheung et al. 14 und Tomer et al. 15, ist um die Lösungen auf Eis kühl zu halten, die die Polymerisation der Chemikalien verhindert. Der andere kritische Schritt ist die Maus langsam mit der Hydrogel-Lösung zu perfundieren Quellung des Nervengewebes zu vermeiden. Für das Hydrogel-Lösung ein Gel zu werden, wird die Entgasung erforderlich. Als Alternative dazu haben wir Parafilm die Oberseite des Rohrs zu bedecken und links keine Luftblasen zwischen dem hydrogel Lösung und die Parafilm. Das funktionierte sehr gut und das Hydrogel-Lösung wurde zu einem Gel nach ein paar Stunden. Obwohl einige Blasen in dem Gel gefunden wurden, haben sie mit den folgenden Experimenten nicht stören, die durch das Fehlen von Blasen in dem Rückenmarksgewebe nachgewiesen. Clearing ist der kritischste Schritt und erfordert eine Kombination von Reagenzien. Die Klärlösung, Aminoalkohol enthält, entfernt das Lipid der Rückenmarksgewebe viel schneller als die SDS / Borsäure basierend Klärlösung im ursprünglichen Klarheit Protokoll 16.
Der Vorteil der Klarheit und kubischem gegenüber herkömmlichen immunhistochemischen Techniken ist, dass die gesamte Gewebeblock ohne Schneiden in das Gewebe abgebildet werden kann, als Ergebnis, die Kontinuität der serotonergen Fasern beibehalten wird, und es ist möglich, die gleiche Faser für eine lange Strecke zu folgen, innerhalb des Z-Stapel. Mit diesem Vorteil kann die Besicherung sicher mit den 3D-Bildern identifiziert werden, einnd Roman Schlussfolgerungen können daher über die Natur der serotonergen Bahnen hergestellt werden. Das Protokoll beschrieben ist ein praktisches Werkzeug für die Untersuchung von Fasersystemen sowie Kerne durch einfaches Markieren des Gewebes mit spezifischen Antikörpern. Diese Technik ist auch eine ideale Wahl für verschiedene Systeme im gleichen Gehirn der Maus Abfrage durch doppelte oder dreifache Kennzeichnung verwendet wird. In unserem Labor Einstellung eine Multi-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskop war mit einem Arbeitsabstand von etwa 300 & mgr; m zur Verfügung. Dies begrenzt unser Bild auf ein Maximum von 600 & mgr; m, wenn beide Seiten des Gewebes abgetastet werden. Jedoch kann ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop, können Bild die gesamte Maus Gehirn und Rückenmark durch ihre volle Breite, Länge und Tiefe. Der andere Vorteil dieser Technik ist, dass die Antikörper eluiert werden können und dann noch verschiedene Antikörper oder Antikörper angewendet wieder auf dasselbe Gewebe. Dies reduziert Tierversuchen erheblich sowie die mit der Vorbereitung von neuen Hirngewebe verbundenen Kostenfür jedes Experiment. Aus dem gleichen Grund kann diese Technik auf andere Gewebe angewendet werden. Es wurden bereits Untersuchungen über die Lunge, Niere durchgeführt wurden, Herz, Darm und Tumorgewebe 26,27.
Es gibt auch Beschränkungen dieser Technik beispielsweise enthält der Raphe-Kerne in der Maus hindbrain viele Typen von Neuronen, einschließlich GABAerge Neuronen. Obwohl CLARITY und CUBIC wird für die Untersuchung der Verteilung der verschiedenen Arten von raphespinal Fasern in einem einzigen Maus Gehirn und Rückenmark zu ermöglichen. Diese Neuronen, die nicht speziell identifiziert werden durch ihre Neurotransmitter oder Proteinmarker kann nicht in dieser Einstellung identifiziert werden. Eine Alternative ist die spezifische Neuronen oder Fasersysteme mit Nukleinsäuresonden , wie in in - situ - Hybridisierung zu etikettieren. Dies ist, andererseits durch die Kennzeichnungssystem und den zur Verfügung stehenden Filter für Fluoreszenz-Bildgebung beschränkt. Imaging alle raphespinal Fasern bleibt daher eine Herausforderung.Wenn diese Techniken mit einer intrakranialen Injektion eines anterograde Tracer (wie Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L) wurden vereinigt, könnte es möglich sein serotonergen Fasern, GABAergen Fasern zu sehen, und andere.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
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