Abstract
脊髄への長い下降繊維が移動、疼痛知覚、およびその他の動作のために不可欠です。これらのファイバシステムの大部分の脊髄における繊維の終端パターンを徹底的に任意の種に調べられていません。脊髄に突出セロトニン作動性線維は、組織切片のラットおよびオポッサムに研究されており、それらの機能的意義は、脊髄でのファイバ終端パターンに推定基づいています。 CLARITY立方技術の発展に伴い、このファイバシステムとセロトニン脊柱上の経路の未知の機能を明らかにする可能性がある脊髄におけるその分布を調べることが可能です。ここでは、合成CLARITY立方技術を使用して、マウスの脊髄におけるセロトニン線維を撮像するための詳細なプロトコルを提供します。この方法は、COMBINと組織のヒドロゲル溶液と明確化とマウスの灌流を伴います試薬をクリアするエーション。脊髄組織は、すぐ下に2週間でクリアされた、およびセロトニンに対するその後の免疫染色は、10日以内に完了しました。多光子蛍光顕微鏡を用いて、組織を走査し、3次元画像は、OsiriXのソフトウェアを使用して再構築しました。
Protocol
倫理文：動物を対象とするすべての手順は、ニューサウスウェールズ大学の動物管理及び倫理委員会（ACEC）（承認ACEC番号は14 / 94Aである）のガイドラインに従ってください。
透明なマウス脊髄の調製
- アイスコールドヒドロゲル溶液の調製
- 16％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）の調製
- 70ミリリットル予め温めておいた蒸留水（50〜55℃）でに16グラムのパラホルムアルデヒド粉末を追加し、パラホルムアルデヒドが溶解するまで加熱された磁気撹拌機で撹拌します。注：ソリューションがオーバー55°Cを加熱し、パラホルムアルデヒドは有毒であることに注意することがないようにしてください。
- シリンダーにパラホルムアルデヒド溶液を移し、100mlに蒸留水を追加します。 4℃の冷蔵庫を使用して、パラホルムアルデヒド溶液を冷却します。
- 蒸留水26.25ミリリットル中に125mgのVA-044開始剤を溶解させ、4溶液を冷却Cの冷蔵庫を°。
- クール5ミリリットルアクリルアミド溶液（40％）、1.25ミリリットルビス溶液（2％）（注意：ビスアクリルアミド溶液は毒性があり、遺伝的欠陥や癌を引き起こす可能性がある）、5ミリリットル10×PBS、12.5ミリリットル16％PFA溶液、および氷上のVA-044の開始剤溶液。
- 氷の上に上記の溶液を混合。
注：総容量は50ミリリットルです。
- 16％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）の調製
- マウス脊髄の灌流およびコレクション
- 0.9％生理食塩水で希釈したケタミン（80mg / kg）およびxyzaline（5mg / kg）の腹腔内注射でマウスをAnaesthetize。マウスのための用量は、ラットのそれよりも低くすることができます。
- マウスは、足の皮にピンチに応答しません一度ヒュームフード内で適切なプラスチック表面に、（粘着テープが効果的である）身体から離し、マウスの四肢を固定します。
- 胸の上にマウスの皮膚をカットした後、骨の胸は、はさみで心臓を露出します。
- 25 G針が番目に取り付けると、蠕動ポンプを使用してチューブの電子端部は、心臓の左心室に針を挿入し、約10ミリリットル/分の速度を血液のための出口点を作成し、40ミリリットルの0.9％生理食塩水での洗浄を開始するために右心房を切り取ります。
- 完了したら、35ミリリットルの氷冷ヒドロゲル溶液でマウスを灌流。
注：神経組織の膨張を回避するために、10ml /分の速度で灌流。 - ブレードバックの上に皮膚を切開して、次の脊椎動物に筋肉を削除します。一方の側で椎弓を切断し、反対側にフリップした後、細かいハサミで脊柱から脊髄を取ります。
- マウスの脊髄をクリア
- 4℃で一晩ヒドロゲル溶液の15ミリリットルで脊髄を置きます。
- ヒドロゲル溶液の10ミリリットルを削除し、5ミリリットルチューブに脊髄セグメントを有する液の残りを注ぎます。それは完全に一杯になるまでヒドロゲル溶液で5 mlのチューブを埋めます。
- 5ミリリットルチューブの上にパラフィルムの小片をストレッチした後、チューブの首にパラフィルム包みます。注：パラフィルムの接点ヒドロゲル溶液を確認し、ヒドロゲル溶液と、パラフィルムの間に気泡が存在しません。
- 37で5ミリリットルチューブを入れて °Cのオーブンで一晩。それがゲルになるまでヒドロゲル溶液を観察します。
- オーブンから5ミリリットルチューブを取り、（そのようなシャベル1ミリリットルピペットチップなど）スパナでチューブからゲルを削除します。ゲルに粗い組織を貼り付けることにより、脊髄組織からゲルを外し、（ゲルは組織に固執するため、組織によって削除されます）離れ粗い組織を取ります。
- 脊髄組織からゲルを除去した後、シェーカー上で24時間、1×PBS（pH7.4）で脊髄を4回洗浄します。
- 3.85グラムの尿素3.85グラムのN、N、N '、N'-テトラキス（2-ヒドロキシプロピル）ethylenediamを溶解することによりキュービック透明溶液を調製します5.38ミリリットルの蒸留水にINE。
注：ホットスターラーが使用されています。それは明確であり、室温にまで冷却後に溶液に、2.31グラムのポリエチレングリコールモノ-P-イソオクチルフェニルエーテル/トリトンX-100を追加します。
注：これらの3化学物質の10グラムは1マウス用です。 - かみそりの刃で2〜3ミリメートル長いセグメントに冠状にマウスの脊髄を切り取り、上記CUBICクリア溶液5mlに入れて。 37のオーブンでシェーカー上に置き 3日間Cを°。
- 3日後、新鮮なものに決済ソリューションを変更します。注：上記溶液は使用前に調製されます。
- 2〜3日後にCUBIC決済ソリューションをリフレッシュした後、フォント8文字で紙に対する組織の透明性を確認してください。それが透明である場合、文字がクリア組織を通して見ることができます。 （0.1％のTriton-X100）は、組織を1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにクリア溶液を除去し、PBSTで4ミリリットルを追加します。
- 37℃のオーブンでシェーカー上で3日間：一次抗体溶液中の脊髄セグメントをインキュベート（PBSTで100抗セロトニンは、ウサギで育った、1に希釈しました）。
- 抗体溶液を除去し、37℃のオーブンで脊髄セグメントを1日4回（各6時間）を洗浄するためにPBST（0.1％のTriton-X100）の4ミリリットルを追加します。
- PBST溶液を除去し、二次抗体溶液を加える（594結合ヤギ抗ウサギIgG、1希釈：PBSTで100）を37℃のオーブン中でシェーカー上で3日間組織をインキュベートします。
- 二次抗体溶液を除去し、37℃のオーブンでシェーカー上脊髄セグメントを1日4回（6時間ごと）を洗浄するためにPBSTの4ミリリットルを追加します。翌日、組織は、イメージングのための準備ができています。
3.イメージング
- PBST溶液を除去し、さらには組織の屈折率を作るために85％グリセロールの4ミリリットルを追加します。
- 次の脊髄組織に85％グリセロールの数滴を入れて、22×50mmの2カバースリップガラスでそれをカバースリップ。
注意：脊髄の向きは、画像がどのように見えるかを決定します。 - 多光子蛍光顕微鏡の保持枠の上にスライドガラスを入れて、光経路に組織を動かします。
- ヘリウムネオンレーザライン594 nmのを選択して、ライブ画像に正の信号の輝度をチェックして、最適なレベルにレーザーの強度を調整します。
- （水中、NA 0.7）20Xの対物レンズを用いて脊髄組織の走査領域を選択し、zスタックを作成するための準備、および3μmと各ステップの深さ。
- 20XのOBJEC下zスタックの上から下に組織をスキャン的と（油中、NA 1.4）を63Xの対物レンズをそれぞれ、（ステップサイズは1μmでした）。 3Dソフトウェア28を使用して3D映像を再構成します。
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Representative Results
このセクションでは、CLARITY立方プロトコルの組み合わせを使用して、透明なマウスの脊髄におけるセロトニン抗体染色の結果を示します。私たちは、セロトニン作動性繊維は（もビデオ1参照、 図1）前角の腹の部分で優勢で脊髄の全ての薄層に存在していることを示しています。対照組織は陽性線維（結果は表示されませんでした）を持っていませんでした。前角では、高密度に充填されたセロトニン作動性繊維は前角の腹内側部分に存在していると、彼らは前角の外側部に向かって延びている（ 図2、またビデオ2を参照）。いくつかの免疫陽性繊維はまた、背角または中心管に向かって前角から延びています。免疫陽性繊維は、後角の全ての薄層中に存在しているが、正の薄層2中の繊維と4の間に小さな隙間があり、特に横で脊髄後角の一部。後角におけるセロトニン線維の大部分は小さい直径のものであり、それらのほんの数が大径（ ビデオ1）です。水平断面において、前角における密集セロトニン作動性線維は、脊髄の長手方向軸に沿って移動し、大きな繊維束を形成することが観察されました。最も興味深い発見は、この大規模な繊維束は、繊維束に対して垂直であり、定期的に縦軸に沿った枝を、発行していることです。これらの分岐は、さらに前角の外側部分にそのパスに沿って担保します。これらのブランチと比較し、正中線に向かって延在するものが不規則小さい（ 図2）です。 63X対物レンズの下に、後角におけるセロトニン線維は、脊髄の軸に沿って移動し、管の経路に沿った様々な点で終端することが観察されました。太い繊維が散発的に薄いFの間に分散されています ibers（ 図3、またビデオ3を参照してください）。
図1：200X倍率左の腰のコードの冠状断面におけるセロトニン作動性繊維は、右後角は、背側脊髄の内側部分であり、および腹側脊髄の横方向の一部であり、前角です。スケールバーは100μmです。セロトニン作動性繊維、特に繊維密度が高い前角の腹内側部に、すべての薄層中に存在します。これらの繊維は、前角の外側部と中央運河や脊髄後角の両方に向かって延びています。他の薄層内の繊維の密度は低いです。セロトニン作動性線維の大部分は薄いです。繊維のみの小さな数が厚くであり、彼らは脊髄後角および前角（両方で見られます>また、ビデオ1参照）（右クリックしてダウンロード）。
図2：腹200X倍率左で前角の部分と右側にあるセロトニン線維は、脊髄の側面であり、背側は、脊髄の吻側一部であり、腹側脊髄の尾の部分です。スケールバーは100μmです。セロトニン作動性線維は、脊髄の縦軸に沿って移動する図示し、それらが厚い繊維束を形成する前角の中央部に充填されています。正中線に向かって延びている他の人が不規則と短いのに対し、このバンドルのうち、いくつかの枝は、前角の側部に向けて定期的に拡張されています。これらの繊維は、（管の経路に沿った多くのポイントで終端もビデオ2を参照してください。）（右クリックしてダウンロード）。
図3：630Xの倍率で下の脊髄後角におけるセロトニン作動性線維左、右、脊髄、背側と腹側のそれぞれ、背側と後角の腹の部分を指すの内側部分があり、脊髄の横方向の一部です。 。スケールバーは7μmです。セロトニン作動性線維は、脊髄の長手方向軸に沿って移動し、管の経路に沿って終端しています。これらの繊維は、混在太い繊維数の少ない主に小径のです。これらの繊維はほとんど重なっていない（ また、ビデオ3（右クリックしてダウンロード）を参照してください ）。
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Discussion
プロトコルを組み合わせCLARITYとCUBIC技術を用いてマウスの脊髄における画像セロトニン作動性繊維にどのようにショーを説明しました。これは、チャンら 14およびさまら 15によって開発された受動的な決済プロトコルに比べて速くクリア処理を紹介し、脊髄組織が うまくクリア時にヒドロゲルによってサポートすることができます。
チャンら 14およびさまらによって報告されているように、マウスの脊髄の固定、中に重要なステップ。15は 、化学物質の重合を防止する、すべての溶液を氷上で冷静さを保つことです。他の重要なステップは、神経組織の膨潤を回避するために、ヒドロゲル溶液でゆっくりとマウスを灌流することです。ヒドロゲル溶液がゲルになるためには、脱気が必要とされます。これに代わるものとして、我々は、チューブの上部をカバーするためにパラフィルムを使用し、HYDとの間に気泡が残っていませんrogelソリューションとパラフィルム。これは非常によく働いたとヒドロゲル溶液は、数時間後にゲルになりました。いくつかの気泡がゲル中に見出されたが、それらは、脊髄組織中の気泡が存在しないことによって証明された以下の実験を妨害しませんでした。クリアは、最も重要なステップであり、および試薬の組み合わせを必要とします。アミノアルコールを含む決済ソリューションは、元CLARITYプロトコル16で使用されるSDS /ホウ酸系決済ソリューションよりもはるかに高速脊髄組織の脂質を除去します。
伝統的な免疫組織化学技術上CLARITY立方の利点は、全体の組織ブロックは、セロトニン作動性線維の連続性が保持され、その結果、組織を切片化することなく画像化することができ、長い距離を同じファイバに追従することが可能であることですzスタック内。この利点により、担保は自信を持って3D画像で識別することができ、ND新規な結論は、したがってセロトニン経路の性質について行うことができます。記載されているプロトコルは、単純に特異的な抗体で組織を標識することにより、ファイバシステム、ならびに核の調査のための便利なツールです。この技術は、二重または三重標識を使用して、同じマウス脳内の異なるシステムを問い合わせるための理想的な選択肢です。我々の研究室の設定では、多光子蛍光顕微鏡は、300μm程度の作動距離で使用可能でした。組織の両面をスキャンしている場合、これは600ミクロンの最大値に私たちの画像を制限します。しかし、光シート蛍光顕微鏡、その全幅、長さと深さを介して、画像全体マウス脳と脊髄をすることができます。この技術の他の利点は、抗体が溶出することができるし、別の異なる抗体または抗体が同じ組織に再び適用されるということです。これは動物に使用かなりだけでなく、新たな脳組織の準備に関連するコストを削減し各実験について。同じ理由で、この技術は、他の組織にも適用することができます。すでに肺、腎臓、心臓、腸、および腫瘍組織26,27に実施された研究が行われています。
また、この手法には限界があり、例えば、マウス後脳内縫線核は、GABA作動性ニューロンを含むニューロンの多くの種類が含まれています。 CLARITYとCUBICは、単一のマウス脳と脊髄でraphespinal繊維の多様な種類の分布の研究を可能にしますが。彼らの神経伝達物質またはタンパク質マーカーにより具体的に特定されていないこれらのニューロンは、この設定では識別できません。代替は、in situハイブリダイゼーションのような核酸プローブと特定のニューロンまたはファイバシステムにラベルを付けることです。これは、一方で、ラベリングシステムと蛍光イメージングのために使用可能なフィルタによって制限されます。したがって、すべてのraphespinal繊維を画像化することは課題のまま。これらの技術は順行性トレーサーの頭蓋内注射と一緒にした場合（例えば、インゲンマメのleucoagglutininとして - PHA-L）は、セロトニン作動性繊維、GABA作動性繊維、および他の人を見ることは可能かもしれません。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| 40% acrylamide solution | Bio Rad | 161-0140 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution |
| 2% Bis Solution | Bio Rad | 161-0142 | http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU |
| urea | Merck Millipore | 66612 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612 |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940 |
| Triton-X 100 | Merck Millipore | 648462 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462 |
| sucrose | Sigma | S0389 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU |
| serotonin antibody | Merck Millipore | AB938 | http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938 |
| goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate | Life Technologies | A-11012 | https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| multi-photon microscope | Leica | Leica TCS SP5 MP STED | http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/ |
References
- Rivot, J. P., Chaouch, A., Besson, J. M. Nucleus raphe magnus modulation of response of rat dorsal horn neurons to unmyelinated fiber inputs: partial involvement of serotonergic pathways. J Neurophysiol. 44 (6), 1039-1057 (1980).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Struct Funct. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Sorkin, L. S., McAdoo, D. J., Willis, W. D. Raphe magnus stimulation-induced anti-nociception in the cat is associated with release of amino acids as well as serotonin in the lumbar dorsal horn. Brain Res. 618 (1), 95-108 (1993).
- Rivot, J. P., Chiang, C. Y., Besson, J. M. Increase of serotonin metabolism within the dorsal horn of the spinal cord during nucleus raphe magnus stimulation, as revealed by in vivo electrochemical detection. Brain Res. 238 (1), 117-126 (1982).
- Hentall, I. D., Pinzon, A., Noga, B. R. Spatial and temporal patterns of serotonin release in the rat's lumbar spinal cord following electrical stimulation of the nucleus raphe magnus. Neuroscience. 142 (3), 893-903 (2006).
- Bullitt, E., Light, A. R. Intraspinal course of descending serotoninergic pathways innervating the rodent dorsal horn and lamina X. J Comp Neurol. 286 (2), 231-242 (1989).
- Jones, S. L., Light, A. R. Termination patterns of serotoninergic medullary raphespinal fibers in the rat lumbar spinal cord: an anterograde immunohistochemical study. J Comp Neurol. 297 (2), 267-282 (1990).
- Marlier, L., Sandillon, F., Poulat, P., Rajaofetra, N., Geffard, M., Privat, A. Serotonergic innervation of the dorsal horn of rat spinal cord: light and electron microscopic immunocytochemical study. J Neurocytol. 20 (4), 310-322 (1991).
- Morrison, S. F., Gebber, G. L. Axonal branching patterns and funicular trajectories of raphespinal sympathoinhibitory neurons. J Neurophysiol. 53 (3), 759-772 (1985).
- Barman, S. M., Gebber, G. L. The axons of raphespinal sympathoinhibitory neurons branch in the cervical spinal cord. Brain Res. 441 (1-2), 371-376 (1988).
- Martin, G. F., Cabana, T., Ditirro, F. J., Ho, R. H., Humbertson, A. O. Jr Raphespinal projections in the North American opossum: evidence for connectional heterogeneity. J Comp Neurol. 208 (1), 67-84 (1982).
- Bowker, R. M., Westlund, K. N., Coulter, J. D. Origins of serotonergic projections to the lumbar spinal cord in the monkey using a combined retrograde transport and immunocytochemical technique. Brain Res Bull. 9 (1-6), 271-278 (1982).
- Watkins, L. R., Griffin, G., Leichnetz, G. R., Mayer, D. J. Identification and somatotopic organization of nuclei projecting via the dorsolateral funiculus in rats: a retrograde tracing study using HRP slow-release gels. Brain Res. 223 (2), 237-255 (1981).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
- Ertürk, A., Bradke, F. High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO). Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).
- Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. Trends Cogn Sci. 17 (12), 596-599 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. NeuroImage. 101, 625-632 (2014).
- Ando, K., et al. Inside Alzheimer brain with CLARITY: senile plaques, neurofibrillary tangles and axons in 3-D. Acta Neuropathol. 128 (3), 457-459 (2014).
- Zhang, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 781 (2015).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Rosset, A., Spadola, L., Ratib, O. OsiriX: an open-source software for navigating in multidimensional DICOM images. J Digit Imaging. 17, 205-216 (2004).
