Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Abstract

Lange synkende fibrene til ryggmargen er avgjørende for bevegelse, smerteopplevelse og annen atferd. The fiber oppsigelse mønster i ryggmargen til de fleste av disse fiber systemer har ikke blitt grundig undersøkt i noen arter. Serotonerge fiber, som stikker til ryggmargen, har blitt studert i rotter og opossums på histologiske snitt og deres funksjonelle betydning har blitt utledet basert på deres fiber oppsigelse mønster i ryggmargen. Med utviklingen av CLARITY og CUBIC teknikker, er det mulig å undersøke dette fiber system og sin distribusjon i ryggmargen, noe som er sannsynlig å avdekke tidligere ukjente funksjonene i serotonerge supraspinal trasé. Her gir vi en detaljert protokoll for å avbilde de serotonerge fibrene i mus ryggmargen ved hjelp av den kombinerte CLARITY og CUBIC teknikker. Metoden innebærer perfusjon av en mus med en hydrogel løsning og avklaring av vevet med en koasjon av clearing reagenser. Ryggmargs vev ble ryddet i underkant av to uker, og den påfølgende immunfluorescens farging mot serotonin ble gjennomført i mindre enn ti dager. Med en multi-foton fluorescerende mikroskop, ble vevet skannet og et 3D-bilde ble rekonstruert ved hjelp av Osirix programvare.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle prosedyrer som involverer dyr fag følge retningslinjene i Animal Care og etisk komité (ACEC) ved The University of New South Wales (godkjent ACEC tallet er 14 / 94A).

1. Klargjøring av Transparent Mouse Spinal Cord

1. Utarbeidelse av iskald Hydrogel Solution
   1. Utarbeidelse av 16% paraformaldehyde løsning (PFA)
      1. Legg 16 g paraformaldehyd-pulver i 70 ml forvarmet destillert vann (50-55 ° C) og omrør på en oppvarmet magnetrører inntil paraformaldehyd oppløses. Merk: Ikke la løsningen for varme over 55 ° C, og være klar over at paraformaldehyde er giftig.
      2. Overfør løsningen paraformaldehyd til en sylinder og tilsett destillert vann til 100 ml. Avkjøl paraformaldehyd oppløsning ved bruk av et 4 ° C kjøleskap.
   2. Oppløs 125 mg VA-044 pådriver i 26,25 ml destillert vann og avkjøl løsningen i en 4° C kjøleskap.
   3. Avkjøl 5 ml akrylamid-løsning (40%), 1,25 ml bis-oppløsning (2%) (FORSIKTIG: Bis og akrylamid-oppløsninger er giftige, kan føre til genetiske defekter eller kreft), 5 ml 10 x PBS, 12,5 ml 16% PFA-løsning, og den VA-044 initiator løsning på is.
   4. Bland løsningene over på is.
      Merk: det totale volumet er 50 ml.
2. Perfusjon og innkreving av Mouse Spinal Cord
   1. Bedøver en mus med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (80 mg / kg) og xyzaline (5 mg / kg) fortynnet i 0,9% normalt saltvann. Doseringen for mus kan være lavere enn det for rotter.
   2. På en egnet plastoverflate i en avtrekkshette, fikse lemmer musen bort fra kroppen (tape er effektiv) når musen ikke reagerer på en klype til sin hud på foten.
   3. Skjær musen huden over brystet og deretter bein brystet å avsløre hjertet med en saks.
   4. Ved hjelp av en peristaltisk pumpe, med en 25 G nål festet til the enden av slangen, stikk nålen inn i venstre ventrikkel i hjertet, avklipt høyre atrium å skape en utgang for blod og deretter begynne å vaske med 40 ml 0,9% fysiologisk saltvann en hastighet på ca. 10 ml / min.
   5. Når du er ferdig, perfuse musen med 35 ml iskald hydrogel løsning.
      Merk: perfuse med en hastighet på 10 ml / min for å unngå svelling av nervevev.
   6. Incise huden over ryggen med en kniv og fjern deretter musklene ved siden av virveldyr. Etter å kutte ryggvirvel buene på den ene siden og snu dem til den andre siden, ta ryggmargen ut av ryggraden med en fin saks.
3. Tømme Mouse Spinal Cord
   1. Plasser ryggmargen i 15 ml hydrogel løsning over natten ved 4 ° C.
   2. Fjern 10 ml av hydrogel-løsning og helle resten av løsningen med ryggmargssegmenter til et 5 ml rør. Fyll 5 ml rør med hydrogelen oppløsningen inntil den er helt full.
   3. Strekke seg et lite stykke parafilm over toppen av 5 ml rør og deretter vikle parafilm rundt halsen av røret. Merk: Påse parafilmen i kontakt med den hydrogel-løsning, og det ikke er noen bobler mellom hydrogel oppløsningen og Parafilm.
   4. Sett 5 ml tube i en 37   ° C ovn over natten. Observer hydrogel løsning til det blir en gel.
   5. Ta 5 ml tube ut av ovnen og fjern gel fra røret med en skiftenøkkel (for eksempel en måket en ml pipette tips). Fjern gel fra ryggmargen vev ved å stikke den grovvevet til gel og deretter ta grovvevet unna (gelen vil holde seg til vev og derfor vil bli fjernet av vev).
   6. Etter fjerning av gelen fra ryggmargen vev, vaskes ryggmargen 4 ganger med 1 x PBS (pH 7,4) i 24 timer på en rister.
   7. Klargjør CUBIC clearing løsning ved å løse 3,85 g urea og 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroksypropyl) ethylenediamine i 5.38 ml destillert vann.
      Merk: En varm rører benyttes. Legg 2,31 g polyetylenglykol mono-p-isooktylfenyleter / Triton X-100 til løsningen når den er klar og kjøles ned til romtemperatur.
      Merk: 10 g av disse tre kjemikaliene er for en mus.
   8. Kutt mus ryggmargen coronally inn 2-3 mm lange segmenter med et barberblad og sette dem inn i 5 ml av ovennevnte CUBIC clearing løsning. Plasser på en shaker i ovnen ved 37   ° C i 3 dager.
   9. Tre dager senere, endre clearing løsning til en ny en. Merk: de ovennevnte oppløsning fremstilles før bruk.
   10. To til tre dager senere etter å oppdatere CUBIC clearing løsning, sjekk gjennomsiktigheten vevet mot et papir med skrift 8 bokstaver. Hvis det er gjennomsiktig, kan bokstavene ses gjennom ryddet vev. Fjern clearing løsning og tilsett 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) for å vaske vevet 4 ganger daglig (hver 6. time).

1. Inkuber ryggmargssegmenter i den primære antistoffoppløsning (anti-serotonin, hevet i kanin, fortynnet 1: 100 i PBST) i 3 dager på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
2. Fjern det antistoffløsning og tilsett 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) for å vaske ryggmargssegmenter 4 ganger daglig (hver 6. time) i en 37 ° C ovn.
3. Fjern det PBST løsning og tilsett den sekundære antistoffoppløsning (594 konjugert geite-anti-kanin IgG, fortynnet 1: 100 i PBST) inkuberes vevet i 3 dager på en ristemaskin i en 37 ° C ovn.
4. Fjern det sekundære antistoff løsning og tilsett 4 ml PBST å vaske ryggmargssegmenter 4 ganger daglig (hver 6. time) på en ristemaskin i en 37 ° C ovn. Den neste dag vevet er klar for avbilding.

3. Imaging

1. Fjern det PBST løsning og tilsett 4 ml 85% glyserol for å danne en brytningsindeks av vevet selv.
2. Satt noen få dråper av 85% glycerol ved siden av ryggmargen vev og dekk det med en 22 x 50 mm ² dekkglass.
   Merk: Retningen på ryggmargen bestemmer hvordan bildet ser ut.
3. Sette glass-slide på holderammen av multi-foton fluorescerende mikroskop og bevege vevet inn i lysbanen.
4. Velge den Helium Neon laserlinjen 594 nm og justere intensiteten av laser til et optimalt nivå ved å kontrollere lysstyrken av det positive signal i det levende bildet.
5. Velge skanneområdet i ryggmargen vev ved hjelp av den 20X objektiv (i vann, NA 0,7), og utarbeide for å skape en z-stabel, og dybden av hvert trinn satt til 3 um.
6. Skanne vev fra toppen til bunnen av z-stabelen under 20 X målsettingertive og deretter 63X objektiv (i olje, 1,4 NA) (trinnstørrelse var 1 um), henholdsvis. Rekonstruere 3D-videoer ved hjelp av en 3D-programvare ^28.

Representative Results

Denne seksjonen viser resultatene fra serotonin antistoffarging i den transparente mus ryggmargen ved hjelp av en kombinasjon av klarhet og CUBIC protokoller. Vi viser at serotonerge fibre er til stede i alle lameller i ryggmargen med en overvekt i den ventrale del av den ventrale horn (figur 1, se også Video 1). Kontrollen vev ikke har positive fibere (resultat var ikke vist). I den ventrale horn, tettpakkede serotonergiske fibre er til stede i den ventromediale parti av den ventrale horn og de ​​strekker seg langs den laterale delen av den ventrale horn (figur 2, se også Video 2). Noen immunopositive fiber også strekke seg fra ventral horn mot dorsal horn eller den sentrale kanalen. Immunopositive fibre er til stede i alle lameller av dorsal horn, men det er et lite gap mellom positive fibre i arket 2 og 4, særlig i sidedel av dorsal horn. Flertallet av serotonerge fibre i dorsal horn er av liten diameter, og bare et lite antall av dem er av stor diameter (Video 1). I et horisontalsnitt, det tettpakkede serotonerge fibre i den ventrale horn observert å bevege seg langs den langsgående aksen av ryggmargen og danne en stor fiberbunt. Det mest interessante funn er at denne store fiberbunt avgir grener regelmessig langs den langsgående akse, som er vinkelrett på fiberbunten. Disse grenene ytterligere collateralize langs sine baner til den laterale delen av den ventrale horn. Sammenlignet med disse grenene, de strekker seg langs midtlinjen er uregelmessige og mindre (figur 2). Under 63X objektiv, ble serotonergiske fibrene i dorsalhornet observert å bevege seg langs aksen av ryggmargen og avsluttes på ulike steder langs banen til tarmkanalen. De tykke fibrene er sporadisk fordelt blant tynne f ibers (Figur 3, også se video 3).

Figur 1:. Serotonerge fibre i en koronale delen av korsryggen ledningen ved 200X forstørrelse Venstre er ventral horn, høyre er dorsal horn, rygg er den mediale delen av ryggmargen, og ventral er den laterale delen av ryggmargen. Målestokken er 100 mikrometer. Serotonerge fibre er til stede i alle lameller, spesielt i ventromediale del av den ventrale horn hvor fibertettheten er høy. Disse fibrene strekker seg mot både den laterale delen av ventral horn og den sentrale kanalen eller dorsal horn. Tettheten av fibrene i andre lameller er lav. De fleste av serotonerge fibre er tynne. Bare et lite antall fibre er tykke og de ses i både dorsale horn og den ventrale horn (> se også Video 1 (Høyreklikk for å laste ned)).

Fig. 2: Serotonerge fibre i den ventrale del av den ventrale horn ved 200X forstørrelse Venstre og høyre er de laterale sidene av ryggmargen, er dorsale den rostrale del av ryggmargen, og ventral er hale del av ryggmargen. Målestokken er 100 mikrometer. Serotonerge fibre er vist som beveger seg langs den langsgående aksen av ryggmargen og pakket i det mediale del av den ventrale horn hvor de danner en tykk fiberbunt. Ut fra denne gruppen, er noen grener forlenget med jevne mellomrom mot den laterale delen av den ventrale horn, mens andre som strekker seg langs midtlinjen er uregelmessige og kortere. Disse fibrene avslutte på mange punkter langs banen til veiene ( se også video 2(Høyreklikk for å laste ned)).

Figur 3: Serotonerge fibrene i dorsal horn i henhold til 630x forstørrelse Venstre er den laterale delen av ryggmargen, høyre er den mediale delen av ryggmargen, dorsal og ventral refererer til dorsal og ventral del av dorsal horn, henholdsvis. . Målestokken er 7 mikrometer. Serotonerge fibrene som beveger seg langs den langsgående aksen av ryggmargen og avslutte langs banen til tarmkanalen. Disse fibrene er i hovedsak av liten diameter med et lite antall tykke fibre intermingled. Disse fibrene sjelden overlapper med hverandre ( se også video 3 (Høyreklikk for å laste ned) ).

Discussion

Protokollen er beskrevet viser hvordan bildet serotonerge fibre i mus ryggmargen med den kombinerte CLARITY og CUBIC teknikker. Den introduserer en hurtigere lysning prosess i forhold til den passive lysning protokoll som er utviklet av Cheung et al. ¹⁴ og Tomer et al., ¹⁵ og gjør det mulig for ryggmargen vevet for å være godt støttet av hydrogelen i løpet av clearing.

Et viktig skritt i løpet av fikseringen av mus ryggmargen, som rapportert av Cheung et al. ¹⁴ og Tomer et al. ^15, er å holde alle løsningene avkjøles på is, som hindrer polymeriseringen av kjemikaliene. Den andre kritiske trinnet er å perfuse musen langsomt med hydrogelen løsning for å unngå svelling av nervevev. For hydrogel løsningen til å bli en gel, er avgassing nødvendig. Som et alternativ til dette, brukte vi Parafilm til å dekke toppen av røret og lagt igjen luftbobler mellom hydRogel løsning og Parafilm. Dette fungerte veldig bra og hydrogel løsningen ble en gel etter noen timer. Selv om noen bobler ble funnet i gelen, de ikke forstyrrer de følgende forsøk, som ble demonstrert ved fravær av bobler i ryggmargen vev. Clearing er den mest kritiske trinnet, og krever en kombinasjon av reagenser. Clearing løsning, som inneholder amino-alkohol, fjerner lipid i ryggmargen vev mye raskere enn SDS / borsyre basert clearing løsning som brukes i den opprinnelige CLARITY protokoll ^16.

Fordelen med KLARHET og kubiske over tradisjonelle immunhistokjemiske teknikker er at hele vevet blokken kan avbildes uten å seksjonere vev, som et resultat, blir kontinuiteten i serotonerge fibrene beholdes, og det er mulig å følge den samme fiber for en lang avstand i z-stabelen. Med denne fordelen, kan collateralization være trygt identifisert med 3D-bilder, ennd nye konklusjoner kan derfor gjøres om innholdet av serotonerge veier. Protokollen er beskrevet er et praktisk redskap for undersøkelse av fibersystemer, såvel som kjerner ved ganske enkelt merking av vev med spesifikke antistoffer. Denne teknikken er også et ideelt valg for avhør ulike systemer i samme mus hjernen ved hjelp av dobbel eller trippel merking. I vårt laboratorium, et multi-foton fluorescerende mikroskop var tilgjengelig med en arbeidsavstand på omtrent 300 um. Dette begrenser vår bilde til et maksimum på 600 um hvis begge sider av vevet er skannet. Men en lys ark fluorescerende mikroskop, kan bildet hele mus hjernen og ryggmargen gjennom sin fulle bredde, lengde og dybde. Den andre fordelen med denne teknikken er at antistoffer kan elueres, og deretter en annen forskjellig antistoff eller antistoffer påført på nytt til det samme vev. Dette reduserer dyr bruken betraktelig samt kostnader forbundet med å utarbeide ny hjernevevfor hvert forsøk. Av samme grunn, kan denne teknikken bli anvendt til andre vev. Det har allerede vært studier utført på lunger, nyrer, hjerte, tarm, og svulstvev ^26,27.

Det finnes også begrensninger i denne teknikk, for eksempel rafe kjernene i mus hindbrain inneholder mange typer av nerveceller, inkludert GABAergiske neuroner. Selv om KLARHET og kubiske vil muliggjøre studier av fordelingen av de forskjellige typer av raphespinal fibre i en enkelt mus hjerne og ryggmarg. Disse nevroner, som ikke er identifisert spesifikt av sine nevrotransmittere eller proteinmarkører, kan ikke identifiseres i denne innstillingen. Et alternativ er å merke de spesifikke nervecellene eller fibersystemer med nukleinsyre-prober som for eksempel i in situ hybridisering. Dette er, på den annen side begrenset av merkesystemet, og de tilgjengelige filtre for fluoriserende billeddannelse. Imaging alle raphespinal fibrene forblir derfor en utfordring.Hvis disse teknikkene ble kombinert med en intrakranial injeksjon av en anterosporstoff (for eksempel Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), kan det være mulig å se serotonerge fibre, GABAergiske fibre, og andre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/