Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

Abstract

Длинные нисходящих волокон к спинному мозгу необходимы для передвижения, восприятия боли, а также другие виды поведения. Схема заделки оптоволокна в спинном мозге большинства этих волоконных систем не были тщательно исследованы в любых видов. Серотонинергической волокна, которые выступают в спинной мозг, были изучены у крыс и опоссумов на гистологических срезов и их функциональное значение было выведено на основе их рисунка заделки оптоволокна в спинном мозге. С развитием четкостью и КУБИЧЕСКИХ методов, можно исследовать эту систему волокна и его распределение в спинном мозге, который, вероятно, выявить ранее неизвестные особенности серотонинергической супраспинальных путей. Здесь мы приводим подробный протокол для визуализации серотонинергической волокон в спинном мозге мыши с использованием комбинированного ЯСНОСТИ и кубические техники. Способ включает перфузию мыши с раствором гидрогеля и осветления ткани с Комбенвания очистки реагентов. Ткани спинного мозга был очищен в чуть менее двух недель, и последующее окрашивание иммунофлуоресцентного против серотонина было завершено менее чем за десять дней. С многофотонном флуоресцентного микроскопа, ткань была отсканирована и 3D-изображение было реконструировано с помощью программного обеспечения OsiriX.

Protocol

Этика Заявление: Все процедуры, связанные с предметов животного происхождения следуйте рекомендациям по уходу и комитетом по этике животных (ACEC) в Университете Нового Южного Уэльса (утвержденный номер ACEC на 14 / 94А).

1. Приготовление прозрачного спинного мозга мыши

1. Получение Ice Cold гидрогеля Solution
   1. Приготовление 16% раствора параформальдегида (PFA)
      1. Добавьте 16 г параформальдегида порошка в 70 мл предварительно подогретой дистиллированной воды (50-55 ° С) и перемешивают на магнитной мешалке с подогревом до параформальдегида не растворится. Примечание: Не допускайте раствор нагреть более 55 ° C и знать, что параформальдегид является токсичным.
      2. Переносят раствор параформальдегида в цилиндр и добавляют дистиллированную воду до 100 мл. Охлаждают раствор параформальдегида, используя 4 ° C холодильник.
   2. Растворите 125 мг VA-044 инициатора в 26,25 мл дистиллированной воды и охлаждают раствор в 4° C холодильник.
   3. Прохладный 5 мл раствора акриламида (40%), 1,25 мл раствора бис (2%) (ВНИМАНИЕ: Бис и акриламид растворы являются токсичными, могут вызывать генетические дефекты или рак), 5 мл 10х PBS, 12,5 мл 16% -ного раствора PFA, и тому раствор инициатора ВА-044 на льду.
   4. Смешайте вышеуказанные решения на льду.
      Примечание: общий объем составляет 50 мл.
2. Кровоснабжение и Коллекция шнура мыши Spinal
   1. Анестезировать мышь с внутрибрюшинного введения кетамина (80 мг / кг) и xyzaline (5 мг / кг), разведенного в 0,9% физиологического раствора. Дозировка для мыши может быть ниже, чем у крыс.
   2. На подходящей пластиковой поверхности в вытяжном шкафу, фиксируют конечности мыши далеко от тела (клейкая лента эффективна), как только мышь не реагирует на крайнем случае к его коже стопы.
   3. Разрежьте кожу мыши на груди, а затем кости грудной клетки, чтобы разоблачить сердце с ножницами.
   4. С помощью перистальтического насоса, с 25 G игла прилагается к йе конец трубки, вставьте иглу в левый желудочек сердца, надрез в правое предсердие, чтобы создать точку выхода для крови, а затем начать промывку с 40 мл 0,9% физиологического раствора со скоростью примерно 10 мл / мин.
   5. После завершения заливать мышь с 35 мл ледяного раствора холодной гидрогеля.
      Примечание: обрызгивать со скоростью 10 мл / мин, чтобы избежать отека нервной ткани.
   6. Надрезать кожу на спину с лезвием, а затем удалить мышцы рядом с позвоночным. После разрезания позвоночные дуги на одной стороне и листать их на другую сторону, возьмите спинной мозг из позвоночного столба с тонкой ножницами.
3. Очистка шнура мыши Spinal
   1. Поместите спинного мозга в 15 мл гидрогеля раствора в течение ночи при температуре 4 ° С.
   2. Удалить 10 мл раствора гидрогеля и вылить остальную часть раствора с сегментов спинного мозга в 5 мл пробирку. Заполните 5 мл пробирку с раствором гидрогеля, пока не будет полностью заполнен,
   3. Stretch небольшой кусочек парафином над верхней части 5 мл пробирку, а затем обернуть парафильмом вокруг шеи трубки. Примечание: Убедитесь, что парафильмом контактов решение гидрогеля и нет никаких пузырей между раствором гидрогеля и парафином.
   4. Поместите 5 мл трубку в 37   ° C печи в течение ночи. Обратите внимание на решение гидрогеля, пока она не станет гель.
   5. Возьмем 5 мл трубку из печи и удалите гель из трубки с помощью гаечного ключа (например, вливаются 1 мл пипетки). Удалите гель из ткани спинного мозга путем наклеивания грубой ткани в гель, а затем взять грубую ткань прочь (гель будет прилипать к ткани и, следовательно, будут удалены ткани).
   6. После удаления геля из ткани спинного мозга, моют спинного мозга 4 раза с помощью 1x PBS (рН 7,4) в течение 24 часов на шейкере.
   7. Готовят Кубическую клиринговую раствор путем растворения 3,85 г мочевины и 3,85 г N, N, N ', N'-тетракис (2-гидроксипропил) ethylenediamине в 5,38 мл дистиллированной воды.
      Примечание: используется горячий мешалка. Добавить 2,31 г Полиэтиленгликоль моно-п-isooctylphenyl эфир / тритона Х-100 к раствору сразу понятно и остывает до комнатной температуры.
      Примечание: 10 г этих трех химических веществ для одной мыши.
   8. Вырезать спинного мозга мыши коронковой на 2-3 мм длиной сегментов с лезвием бритвы и поместить их в 5 мл указанного выше раствора КУБИЧНОЙ клирингового. Место на шейкере в духовке при температуре 37   ° C в течение 3-х дней.
   9. Через три дня, изменить клиринговую решение свежую. Примечание: Вышеуказанный раствор готовят непосредственно перед использованием.
   10. Два-три дня спустя после того, как освежающий кубическая клиринговую решение, проверить прозрачность ткани против бумаги с шрифтом 8 букв. Если он прозрачен, то буквы можно увидеть через очищенную ткани. Удалите клиринговую раствор и добавляют 4 мл PBST (0,1% Triton-X100), чтобы вымыть ткани 4 раза в день (каждые 6 часов).

1. Инкубируйте сегментов спинного мозга в растворе первичного антитела (анти-серотонин, поднятый в кролика, разведенной 1: 100 в PBST) в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовке.
2. Удалите раствор антитела и добавляют 4 мл PBST (0,1% Тритон-Х100) для мойки сегментов спинного мозга 4 раза в день (каждые 6 ч) в 37 ° C духовке.
3. Удалить решение PBST и добавить вторичное раствор антитела (594 конъюгированный козий анти-кроличий IgG, разведенного 1: 100 в PBST), чтобы инкубировать ткани в течение 3-х дней на вибраторе в 37 ° C духовке.
4. Удалите раствор вторичного антитела и добавляют 4 мл PBST, чтобы вымыть сегментов спинного мозга 4 раза в день (каждые 6 часов) на шейкере в 37 ° C духовке. На следующий день ткань готова к визуализации.

3. обработки изображений

1. Удалите раствор PBST и добавляют 4 мл 85% глицерина, чтобы сделать показатель преломления ткани даже.
2. Положите несколько капель 85% глицерина рядом с ткани спинного мозга и покровное его с покровным стеклом 22 х 50 мм ^2.
   Примечание: Ориентация спинного мозга решает, как выглядит изображение.
3. Поместите предметное стекло на крепежной рамки формирующего многофотонном флуоресцентного микроскопа и перемещения ткани, в световом пути.
4. Выберите Гелий-неоновый лазер линии 594 нм и регулировать интенсивность лазера до оптимального уровня, проверяя яркость положительного сигнала на изображении.
5. Выберите область сканирования из ткани спинного мозга с использованием цели 20X (в воде, Н. А. 0,7) и подготовить для создания Z-стека, а глубина каждого шага устанавливается равным 3 мкм.
6. Сканирование ткань от верхней части к нижней части Z-стека под объективистские 20Хный, а затем цель 63X (в масле, Н. А. 1.4) (размер шага был 1 мкм), соответственно. Реконструировать 3D - видео с использованием 3D программного обеспечения ^28.

Representative Results

В этом разделе показаны результаты окрашивания серотонин антител в прозрачной мыши спинного мозга с использованием комбинации Четкость и кубические протоколов. Показано , что серотонинергические волокна присутствуют во всех пластинках спинного мозга с преобладанием в вентральной части вентральной рога (рис 1, а также смотрите видео 1). Контрольной ткани не имеют положительных волокон (результат не показан). В вентральном роге, плотно упакованные серотонинергические волокна присутствуют в вентрамедиального части вентральном роге , и они проходят в направлении боковой части вентральном роге (рисунок 2, также см Video 2). Некоторые иммунопозитивных волокна также простираются от вентральном роге в сторону дорсального рога или центрального канала. Иммунопозитивные волокна присутствуют во всех прослоек из дорсального рога, но есть небольшой зазор между положительными волокнами в листовых пластинок 2 и 4, особенно в боковомчасть дорсального рога. Большинство серотонинергических волокон в заднем роге , имеют малый диаметр и лишь небольшое число из них имеют большого диаметра (Video 1). В горизонтальном сечении, наблюдались плотно упакованные серотонинергические волокна в вентральном роге перемещаться по продольной оси спинного мозга и образуют большой пучок волокон. Самым интересным является то, что этот большой пучок волокон выпускает ветви регулярно вдоль продольной оси, которые перпендикулярны расслоения. Эти ветви далее вдоль их качестве обеспечения путей к боковой части вентральной рога. По сравнению с этими ветвями, те , простирающиеся по направлению к средней линии нерегулярны и меньше (рисунок 2). В соответствии с целью 63X, наблюдались серотонинергические волокна в заднем роге, чтобы перемещаться по оси спинного мозга и заканчиваются в различных точках вдоль пути кишечного тракта. Толстые волокна спорадически распределены между тонкой F ibers (рис 3, а также смотрите видео 3).

Рисунок 1:. Серотонинергической волокна в корональной части поясничного отдела мозга на 200X увеличение левых является вентральный рог, право спинной рог, спинной является медиальная часть спинного мозга, а вентральный боковая часть спинного мозга. Шкалы составляет 100 мкм. Серотонинергической волокна присутствуют во всех пластинках, особенно в вентрамедиального части вентральном роге, где плотность волокон высока. Эти волокна проходят в направлении обоих боковой части вентральном роге и центральным каналом или дорсального рога. Плотность волокон в других прослоек является низким. Большинство серотонинергические волокна тонкие. Только небольшое количество волокон, толстые и они рассматриваются как в заднем роге и вентральном роге (> смотрите также видео 1 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить)).

Рис . 2: Серотонинергической волокна в вентральной части вентральном роге при 200X увеличении слева и справа боковые стороны спинного мозга, спинной является ростральной частью спинного мозга, и брюшные является хвостовой частью спинного мозга. Шкалы составляет 100 мкм. Серотонинергической волокна показаны, бегущих вдоль продольной оси спинного мозга и упаковано в медиальном части вентральном роге, где они образуют толстый пучок волокон. Из этого пучка, некоторые ветви вытягиваются через равные промежутки в направлении боковой части вентральном роге, в то время как другие, которые проходят в направлении от средней линии нерегулярные и короче. Эти волокна заканчиваются на многих точках вдоль пути -кишечного тракта ( см также видео 2(Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить)).

Рисунок 3: Серотонинергической волокна в заднем роге под при 630X увеличении Левая боковая часть спинного мозга, право медиальная часть спинного мозга, спинного и брюшного относятся к спинной и брюшной части спинного рога, соответственно. , Шкалы составляет 7 мкм. Серотонинергической волокна, бегущих вдоль продольной оси спинного мозга и заканчиваются по пути тракта. Эти волокна в основном малого диаметра с небольшим количеством толстых волокон перемешаны. Эти волокна редко пересекаются друг с другом ( смотрите также видео 3 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы загрузить) ).

Discussion

Протокол, описанный показывает, как изображение серотонинергических волокон в спинном мозге мыши с комбинированным четкостью и КУБИЧЕСКИХ техники. Он вводит более быстрый процесс клиринга по сравнению с пассивным протоколом клиринга , разработанного Cheung и др. ¹⁴ и Томер и др. ¹⁵ и позволяет ткани спинного мозга , чтобы быть хорошо поддерживается гидрогеля в процессе очистки.

Важным шагом в процессе фиксации спинного мозга мыши, как сообщает Cheung и др. ¹⁴ и Томер и др. ^15, чтобы сохранить все решения охлаждения на льду, что предотвращает полимеризацию химических веществ. Другим важным шагом является заливать мышь медленно с раствором гидрогеля для того, чтобы избежать отека нервной ткани. Для решения гидрогель стать гель, требуется дегазация. В качестве альтернативы этому, мы использовали парафильмом, чтобы покрыть верхнюю часть трубки и оставили пузырьков воздуха между гидрометРешение Rogel и парафильмом. Это работало очень хорошо, и раствор гидрогеля стал гель после нескольких часов. Хотя некоторые пузырьки были обнаружены в геле, что они не мешают следующие эксперименты, о чем свидетельствовало отсутствие пузырьков в ткани спинного мозга. Клиринг является наиболее важным шагом, и требует сочетания реагентов. Клиринг раствор, содержащий аминоспирта, удаляет липидный ткани спинного мозга намного быстрее , чем / клирингового раствора борной кислоты на основе SDS , используемого в первоначальном протоколе CLARITY ^16.

Преимущество четкостью и КУБИЧЕСКИЙ по сравнению с традиционными иммуногистохимических методов состоит в том, что блок вся ткань может быть отображена без секционирования ткани, в результате, непрерывность серотонинергических волокон сохраняется, и можно следовать тем же волокно на большое расстояние в Z-стека. С этим преимуществом, применение залоговых можно уверенно отождествить с 3D-образов,е новые выводы, следовательно, могут быть сделаны о природе серотонинергических путей. Протокол, описанный является удобным инструментом для исследования волоконных систем, а также ядер просто мечения ткани со специфическими антителами. Этот метод также является идеальным выбором для допрашивая различных систем в том же головном мозге мышей с помощью двойной или тройной маркировки. В нашей лабораторных условиях, мульти-Фотон флуоресцентный микроскоп был доступен с рабочим расстоянием приблизительно 300 мкм. Это ограничивает наше изображение до максимум 600 мкм, если обе стороны ткани сканируются. Тем не менее, легкий лист флуоресцентный микроскоп, изображение может весь мозг мыши и спинной мозг через всю ширину, длину и глубину. Другим преимуществом этого метода является то, что антитела могут быть элюируют, а затем еще разные антитела или антитела применяются снова к той же ткани. Это уменьшает использование животных значительно, а также затраты, связанные с подготовкой новой ткани головного мозгадля каждого эксперимента. По той же причине, этот метод может быть применен к другим тканям. Там уже были исследования , проведенные на легкие, почки, сердце, кишечник, и опухолевой ткани ^26,27.

Существуют также ограничения этого метода, например, ядра шве в мозге мыши содержит множество типов нейронов, в том числе ГАМКергических нейронов. Хотя CLARITY и кубические позволит для изучения распределения различных типов raphespinal волокон в одном мозге мыши и спинного мозга. Эти нейроны, которые не определены специально их нейротрансмиттеров или белковых маркеров, не могут быть идентифицированы в этой установке. В качестве альтернативы можно обозначить конкретные нейроны или оптические системы с помощью зондов нуклеиновых кислот , таких , как в in - situ гибридизации. Это, с другой стороны, ограничено системой маркировки и доступных фильтров для флуоресцентных изображений. Визуализация всех raphespinal волокон поэтому остается проблемой.Если эти методы были объединены с внутричерепной инжекции антероградного трассера (например, фасоль обыкновенная leucoagglutinin - PHA-L), можно было бы увидеть серотонинергические волокна, ГАМКергических волокна и другие.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/