Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Abstract

Långa fallande fibrerna till ryggmärgen är väsentliga för transport, smärtupplevelse, och andra beteenden. Fiber avslutande mönster i ryggmärgen hos majoriteten av dessa fibersystem har inte undersökts grundligt i alla arter. Serotonerga fibrer, som skjuter ut till ryggmärgen, har studerats hos råttor och opossum på histologiska sektioner och deras funktionella betydelse har härletts baserat på deras fiber avslutande mönster i ryggmärgen. Med utvecklingen av CLARITY och kubiska tekniker, är det möjligt att undersöka denna fiber och dess fördelning i ryggmärgen, vilket sannolikt kommer att avslöja tidigare okända egenskaper hos serotonerga supraspinala vägar. Här ger vi ett detaljerat protokoll för att avbilda de serotonerga fibrerna i ryggmärgen hos möss med användning av kombinerade CLARITY och kubiska tekniker. Metoden innebär perfusion av en mus med en hydrogel lösning och förtydligande av vävnaden med en combination att rensa reagens. Ryggmärgsvävnad rensades i knappt två veckor, och den efterföljande immunofluorescerande färgning mot serotonin fördes på mindre än tio dagar. Med en multi-foton fluorescerande mikroskop, var vävnaden scannas och en 3D-bild rekonstruerades med hjälp av Osirix programvara.

Protocol

Etik uttalande: alla förfaranden som rör djurpatienter följer riktlinjerna i Animal Care och etikkommittén (ACEC) vid University of New South Wales (den godkända ACEC antalet är 14 / 94A).

1. Beredning av Transparent Mouse Spinal Cord

1. Framställning av iskall hydrogel Lösning
   1. Framställning av 16% paraformaldehydlösning (PFA)
      1. Lägg 16 g paraformaldehyd pulver i 70 ml förvärmda destillerat vatten (50-55 ° C) och rör om på en uppvärmd magnetomrörare tills paraformaldehyd är upplöst. Obs: Låt inte lösningen för att värma över 55 ° C och vara medveten om att paraformaldehyd är giftig.
      2. Överföra paraformaldehydlösning till en cylinder och tillsätt destillerat vatten till 100 ml. Kyla paraformaldehydlösning med användning av en 4 ° C kylskåp.
   2. Lös 125 mg VA-044 initiator i 26.25 ml destillerat vatten och kyl lösningen i en 4° C kylskåp.
   3. Cool 5 ml lösning akrylamid (40%), 1,25 ml Bis-lösning (2%) (OBS: Bis och lösningar akrylamid är giftiga, kan orsaka genetiska defekter eller cancer), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA lösning, och VA-044 initiatorlösning på is.
   4. Blanda ovanstående lösningar på is.
      Obs: den totala volymen är 50 ml.
2. Perfusion och Insamling av ryggmärgen hos möss
   1. Söva en mus med en intraperitoneal injektion av ketamin (80 mg / kg) och xyzaline (5 mg / kg) utspätt i 0,9% normal koksaltlösning. Doseringen för mus kan vara lägre än den för råttor.
   2. På en lämplig plastyta i ett dragskåp, fixa benen på musen bort från kroppen (tejp är effektivt) när musen inte svarar på en nypa sin hud på foten.
   3. Skär musen huden över bröstet och sedan benet bröstet för att exponera hjärtat med en sax.
   4. Med hjälp av en peristaltisk pump, med en 25 G nål fäst till the änden av slangen, in nålen i vänster kammare i hjärtat, klipp höger förmak för att skapa en utgång för blod och sedan börja tvätta med 40 ml 0,9% normal koksaltlösning med en hastighet av ca 10 ml / min.
   5. När den är klar, BEGJUTA musen med 35 ml iskall hydrogel lösning.
      Anm: perfundera med en hastighet av 10 ml / min för att undvika svallning av nervvävnad.
   6. Incisionsfilm huden över ryggen med en kniv och sedan ta bort musklerna bredvid ryggradsdjur. Efter kapning ryggkotornas bågar på ena sidan och vända dem till andra sidan, ta ryggmärgen av ryggraden med en fin sax.
3. Rensa ryggmärgen hos möss
   1. Placera ryggmärgen i 15 ml hydrogel lösningen över natten vid 4 ° C.
   2. Avlägsna 10 ml av hydrogelen lösning och häll resten av lösningen med de ryggmärgssegmenten till ett 5 ml rör. Fylla 5 ml rör med hydrogelen lösning tills den är helt full.
   3. Sträcka en liten bit parafilm över toppen av det 5 ml rör och sedan vira parafilm runt halsen av röret. Obs: Se till parafilm i kontakt med hydrogel lösning och det finns inga bubblor mellan hydrogel lösning och parafilm.
   4. Sätta 5 ml rör i en 37   ° C ugn över natten. Observera hydrogel lösning tills det blir en gel.
   5. Ta 5 ml rör ut ur ugnen och ta bort gelén från tuben med en skruvnyckel (t.ex. en skyfflas 1 ml pipettspets). Ta bort gelén från ryggmärg genom att sticka den grova vävnad till gelén och sedan ta den grova vävnaden bort (gelén fastnar på vävnaden och därför kommer att tas bort av vävnad).
   6. Efter avlägsnande av gelén från ryggmärgsvävnad, tvätta ryggmärgen 4 gånger med 1 x PBS (pH 7,4) under 24 h på en skakapparat.
   7. Förbered CUBIC clearinglösning genom att lösa 3,85 g urea och 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-hydroxipropyl) ethylenediamine i 5,38 ml destillerat vatten.
      Obs: En varm omrörare används. Lägga 2,31 g polyetylenglykol-mono-p-isooctylphenyl eter / Triton X-100 till lösningen när den är klar och kyls ner till rumstemperatur.
      Notera: 10 g av dessa tre kemikalier är för en mus.
   8. Skär ryggmärgen hos möss koronalt i 2-3 mm långa segment med ett rakblad och sätta dem i 5 ml av ovanstående CUBIC clearing lösning. Placera på en skakanordning i ugnen vid 37   ° C under 3 dagar.
   9. Tre dagar senare, ändra clearinglösning till ett färskt en. Anmärkning: Ovanstående lösning framställs före användning.
   10. Två till tre dagar senare efter att uppdatera CUBIC clearing lösning, kontrollera insynen i vävnaden mot ett papper med teckensnitt 8 bokstäver. Om det är öppet, kan bokstäverna ses genom rensas vävnaden. Ta clearing lösning och tillsätt 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) för att tvätta vävnaden 4 gånger per dag (var 6 timmar).

1. Inkubera ryggmärgssegmenten i den primära antikroppslösningen (anti-serotonin, uppvuxen i kanin, utspätt 1: 100 i PBST) i 3 dagar på en skakanordning i en ugn vid 37 °.
2. Avlägsna antikropplösningen och tillsätt 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) för att tvätta de ryggmärgssegmenten 4 gånger per dag (varje 6 h) i en ugn vid 37 °.
3. Avlägsna PBST-lösning och tillsätt den sekundära antikroppslösning (594 konjugerad get-anti-kanin-IgG, utspätt 1: 100 i PBST) för att inkubera vävnaden i 3 dagar på en skakanordning i en ugn vid 37 °.
4. Ta bort den sekundära antikroppen lösning och tillsätt 4 ml PBST att tvätta ryggmärgssegmenten 4 gånger per dag (var 6 timmar) på en shaker i en ugn vid 37 °. Nästa dag vävnaden är redo för avbildning.

3. Imaging

1. Avlägsna PBST-lösning och tillsätt 4 ml av 85% glycerol för att göra brytningsindex för den vävnad även.
2. Sätt några droppar 85% glycerol intill ryggmärgsvävnad och täckglas den med en 22 x 50 mm ² täckglas.
   Notera: Orienteringen av ryggmärgen bestämmer hur bilden ser ut.
3. Sätta glasskiva på hållarramen av flerfotonfluorescensmikroskop och flytta vävnad in i ljusvägen.
4. Välj Helium Neon laser linje 594 nm och justera intensiteten hos lasern till den optimala nivån genom att kontrollera ljusstyrkan på den positiva signalen i den aktiva bilden.
5. Välj skanningsområdet av ryggmärgsvävnad med hjälp av 20X objektiv (i vatten, NA 0,7) och förbereda för att skapa en z-stack, och djupet hos varje steg satt till 3 | j, m.
6. Skanna vävnad från toppen till botten av z-stack under 20X objektivttiva och sedan 63x mål (i olja, NA 1,4) (steg storlek var 1 pm), respektive. Rekonstruera 3D-filmer med hjälp av en 3D-program ^28.

Representative Results

Detta avsnitt visar resultaten från serotonin antikroppar färgning i den genomskinliga musen ryggmärgen med hjälp av en kombination av CLARITY och kubiska protokoll. Vi visar att serotonerga fibrer finns i alla lameller av ryggmärgen med en dominans i den ventrala delen av den ventrala horn (Figur 1, se även Video 1). Kontrollvävnaden hade inte positiva fibrer (resultatet visas ej). I ventrala horn, tätt packade serotonerga fibrer är närvarande i den ventromediala delen av den ventrala hornet och de sträcker sig i riktning mot den laterala delen av den ventrala hornet (figur 2, se även Video 2). Vissa immunpositiva fibrerna sträcker sig också från den ventrala horn mot dorsalhorn eller den centrala kanalen. Immunopositiva fibrer är närvarande i alla lameller av det dorsala hornet men det finns en liten spalt mellan positiva fibrer i lamell 2 och 4, särskilt i den lateralaen del av det dorsala hornet. Majoriteten av serotonerga fibrer i dorsala hornet är av liten diameter och endast ett litet antal av dem är av stor diameter (Video 1). I en horisontell sektion, var tätt packade serotonerga fibrer i den ventrala hornet observeras att förflytta sig längs den längsgående axeln av ryggmärgen och bildar en stor fiberknippe. Det mest intressanta resultatet är att denna stora fiberknippe utfärdar grenar regelbundet utmed den längsgående axeln, vilka är vinkelräta mot fiberbunten. Dessa grenar collateralize vidare längs deras vägar till den laterala delen av den ventrala horn. Jämfört med dessa grenar, de sträcker sig mot mittlinjen är oregelbundna och inte större (figur 2). Under 63x objektiv ades de serotonerga fibrerna i det dorsala hornet observeras att förflytta sig längs axeln för ryggmärgen och slutar vid olika punkter längs banan av tarmkanalen. De tjocka fibrerna sporadiskt fördelas den tunna f ibers (Figur 3, se även Video 3).

Figur 1:. Serotonerga fibrer i en koronal sektion av ländmärgen minst 200 gångers förstoring Vänster är den ventrala horn, höger är det dorsala hornet, är dorsala det mediala partiet av ryggmärgen, och ventralt är den laterala delen av ryggmärgen. Skalan bar är 100 pm. Serotonerga fibrer är närvarande i alla lameller, särskilt i den ventromediala delen av den ventrala hornet där fibertätheten är hög. Dessa fibrer sträcker sig mot både den laterala delen av den ventrala hornet och den centrala kanalen eller dorsala horn. Densiteten av fibrer i andra lamellerna är låg. Majoriteten av serotonerga fibrer är tunna. Endast ett litet antal fibrer är tjocka och de ses i både dorsala horn och den ventrala hornet (> se även Video 1 (Högerklicka för att ladda ner)).

Figur 2:. Serotonerga fibrer i den ventrala delen av den ventrala hornet vid 200 gångers förstoring Vänster och höger är de laterala sidorna av ryggmärgen, är dorsala rostralt delen av ryggmärgen, och ventrala är den kaudala delen av ryggmärgen. Skalan bar är 100 pm. Serotonerga fibrer visas reser längs den längsgående axeln av ryggmärgen och förpackas i den mediala delen av den ventrala hornet, där de bildar en tjock fiberknippe. Ut ur denna bunt är vissa grenar förlängas med jämna mellanrum mot den laterala delen av den ventrala horn, medan andra, som sträcker sig mot mittlinjen är oregelbundna och kortare. Dessa fibrer avslutas på många punkter längs banan av tarmkanalen ( se även Video 2(Högerklicka för att ladda ner)).

Figur 3: Serotonerga fibrer i det dorsala hornet enligt vid 630X förstoring Vänster är den laterala delen av ryggmärgen, höger är det mediala partiet av ryggmärgen, dorsala och ventrala hänvisa till de dorsala och ventrala delen av det dorsala hornet, respektive. . Skalstrecket är 7 pm. Serotonerga fibrerna färdas längs den längsgående axeln av ryggmärgen och slutar längs banan av tarmkanalen. Dessa fibrer är huvudsakligen av liten diameter med ett litet antal tjocka fibrer sammanblandade. Dessa fibrer sällan överlappar varandra ( se även Video 3 (Högerklicka för att ladda ner) ).

Discussion

Det protokoll som beskrivits visar hur bilden serotonerga fibrer i ryggmärgen hos möss med den kombinerade CLARITY och kubiska tekniker. Det införs en snabbare clearing process jämfört med den passiva clearing protokoll som utvecklats av et al. Cheung ¹⁴ och al. Tomer et ¹⁵ och tillåter ryggmärg vara väl stöds av hydrogelen under clearing.

Ett viktigt steg under fixering av ryggmärgen hos möss, som rapporterats av et al. Cheung ¹⁴ och Tomer et al. ^15, är att hålla alla lösningar svalna på is, vilket förhindrar polymerisation av kemikalierna. Det andra kritiska steget är att perfundera musen långsamt med hydrogelen lösning för att undvika svallning av nervvävnad. För hydrogel lösningen blir en gel, är avgas krävs. Som ett alternativ till detta använde vi parafilm för att täcka toppen av röret och lämnade några luftbubblor mellan hydRogel lösning och parafilm. Detta fungerat mycket bra och hydrogelen lösningen blev en gel efter några timmar. Även om vissa bubblor påträffades i gelén, de inte stör följande experiment, vilka visades genom frånvaron av bubblor i ryggmärgsvävnad. Clearing är det mest kritiska steget, och kräver en kombination av reagens. Clearinglösning, innehållande amino-alkohol, avlägsnar lipiden av ryggmärgen vävnad mycket snabbare än den SDS / borsyra baserade clearinglösning som användes i den ursprungliga CLARITY-protokollet ^16.

Fördelen klarhet och CUBIC jämfört med traditionella immunhistokemiska tekniker är att hela vävnadsblock kan avbildas utan sektionering vävnaden, som ett resultat, är kontinuiteten i serotonerga fibrerna behålls, och det är möjligt att följa samma fiber för långa avstånd inom z-stack. Med denna fördel, kan collateralization vara tryggt identifieras med 3D-bilder, ennd nya slutsatser kan därför göras om vilken typ av serotonerga vägar. Det protokoll som beskrivits är ett praktiskt verktyg för undersökning av fibersystem, såväl som kärnor genom att helt enkelt märka vävnaden med specifika antikroppar. Denna teknik är också ett idealiskt val för att förhöra olika system i samma mus hjärnan med hjälp av dubbla eller tredubbla märkning. I vårt laboratorium inställning, en multifotonfluorescensmikroskop var tillgänglig med ett arbetsavstånd av approximativt 300 um. Detta begränsar vår image till högst 600 pm om båda sidorna av vävnaden skannas. Men en ljus ark fluorescerande mikroskop, kan avbilda hela musen hjärnan och ryggmärgen genom sin fulla bredd, längd och djup. Den andra fördelen med denna teknik är att antikropparna kan elueras och sedan en annan annan antikropp eller antikroppar återinföras mot samma vävnad. Detta minskar användningen av djur avsevärt liksom kostnader i samband med att förbereda nya hjärnvävnadför varje experiment. Av samma skäl kan denna teknik tillämpas på andra vävnader. Det har redan gjorts studier som utförts på lungor, njurar, hjärta, tarm, och tumörvävnad ^26,27.

Det finns också begränsningar för denna teknik, till exempel, de rafekärnor i musen hindbrain innehåller många typer av neuroner, inklusive GABAerga neuroner. Även CLARITY och CUBIC kommer att möjliggöra studier av fördelningen av de olika typerna av raphespinal fibrer i en enda mus hjärna och ryggmärg. Dessa nervceller, som inte är identifierade särskilt av deras neurotransmittorer eller proteinmarkörer, inte kan identifieras i den här inställningen. Ett alternativ är att märka de specifika nervceller eller fibersystem med nukleinsyrasonder såsom i in situ hybridisering. Detta är, å andra sidan, begränsas av märkningssystemet och de tillgängliga filter för fluorescerande avbildning. Imaging alla raphespinal fibrerna förblir därför en utmaning.Om dessa tekniker kombinerades med en intrakraniell injektion av en anterograd spårämne (såsom Phaseolus vulgaris leucoagglutinin - PHA-L), kan det vara möjligt att se serotonerga fibrer, GABAergic fibrer och andra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Photoinitiator VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% acrylamide solution	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% Bis Solution	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
paraformaldehyde	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU
urea	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
Triton-X 100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
sucrose	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU
serotonin antibody	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
goat anti rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 594 conjugate	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
multi-photon microscope	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/