Summary
我们提出了一个简便的方法来制造可生物降解的明胶释药的平台，磁热响应。这是通过由京尼平交联的球形明胶微网内掺入超顺磁性氧化铁纳米颗粒和聚（N- isopropylacrylamide- 共 -丙烯酰胺），在结合交变磁场的应用系统来实现的。
Abstract
磁响应纳米/微工程生物材料，使一个紧密控制的，按需给药已被开发为新的类型的生物医学应用智能软设备。虽然许多磁响应药物递送系统已经证明通过概念研究的或在体内临床前应用中，不是在体外证明功效，其在临床环境中的使用仍然可以通过生物 相容性或生物降解性不足的限制。此外，许多现有的平台依靠自己捏造的尖端技术。我们最近通过物理截留聚（N- isopropylacrylamide- 共 -丙烯酰胺）链作为三维明胶网络中的次要组分表现出生物降解性，基于明胶的热-反应微粒凝胶的制造。在这项研究中，我们提出了一个简便的方法来制造可生物降解的药物释放平台，使磁-Thermally触发药物释放。这是通过结合超顺磁性氧化铁纳米颗粒和热 - 反应聚合物基于明胶的胶体微凝胶内，在结合交变磁场的应用系统来实现的。
Introduction
刺激响应药物输送系统，使响应于内源或外源刺激一个紧密控制的药物递送（例如，温度或pH）已经被广泛地研究作为新型药物递送智能软设备。微尺度水凝胶已被广泛地用作药物递送平台，因为它们赋予可控和持续的药物释放曲线，以及可调的化学和机械性能1-3。特别是，胶体微粒凝胶表现出许多优点，作为药物递送的载体，由于其快速响应外界刺激和合适的可注射到局部组织中以微创方式4。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）或其共聚物已经广泛地在合成热-反应微凝胶通过接枝用的可生物降解/生物相容性的聚合物，包括明胶，壳聚糖，藻酸盐酸或透明质酸PNIPAM通过5,6-，其中在其低临界溶解温度（LCST）PNIPAM的相位转变特性可以用作药物释放7的触发。我们最近证明可生物降解的，基于明胶的热-反应微粒凝胶的制造通过将聚（N- isopropylacrylamide- 共 -丙烯酰胺）[P（NIPAM- 共 -AAm）]链作为三维明胶网络8内的次要组分。明胶/ P（NIPAM- 共 -AAm）微粒凝胶显示出可调谐消溶胀温度增加，这正与牛血清白蛋白（BSA）的释放有关。
在过去的几年里，一直在增加努力，开发出磁响应药物交付平台，可以触发按需时尚9,10药物的释放。为磁响应药物递送平台的合成的基本原理利用超顺磁性纳米颗粒的特性（的MNP）时，他们收到的高频交变磁场（AMF），这将触发一个温度敏感的药物释放产生热量。这适用于在该系统能深定位到组织未来的临床应用的承诺，使得非侵入性和远程控制的药物释放，并可以与热疗治疗和磁共振成像系统10-12被组合。这样的平台包括：（1）的MNP / PNIPAM混合凝胶微粒和13-15（2）宏观水凝胶支架固定结合16-18的MNP。基于PNIPAM-微凝胶平台展示了精细调谐体积相变反应，以磁热刺激。然而，它们仍然依赖于在制造和具有高含量的使用PNIPAM聚合物的复杂和精密的 技术可以潜在细胞毒性，以细胞19，这可能限制了其在体内的应用。宏观支架呈现出相对相比于胶体微粒凝胶LY对外界的刺激反应慢，需要一个微创手术移植。
水包油乳化一直以生产亚毫米或微米尺寸的凝胶颗粒20的标准方法。在该乳液的水 - 油界面，微凝胶颗粒形成球状由于在机械剪切力的水滴的表面能量的最小化。此方法允许产生大量的简单制造过程中水性球形凝胶液滴的，并已成功地采用了用于制造用于药物递送应用21-23基于明胶的微粒凝胶。
这里，我们提出了一个简便的方法通过采用水包油乳化法合成用于药物递送应用magnetothermally响应基于明胶的微粒凝胶。这通过物理地结合的氧化铁的MNP和p（NIPAM- 共同实现-AAM）链作为共价由天然衍生的交联剂京尼平与高频交变磁场（AMF）的应用系统交联的组合，球面微尺度明胶网络中的次要组分。
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Protocol
注意： 在图1A中示出的制造磁场响应明胶微凝胶的整个过程。
1.准备解决方案及停牌
- 通过在2ml磷酸盐缓冲盐水中溶解20mg的京尼平的制备交联剂京尼平（1％重量/体积）溶液（1×PBS; pH 7.4）中。涡旋该溶液，并发生在50℃水浴2小时以完全溶解该溶液中。
- 由20毫克聚（乙二醇）的聚（丙二醇） -聚（乙二醇）溶解制备表面活性剂溶液（M W = 2900达;称为L64）在200毫升PBS中是在100的浓度PPM。
- 由64.5毫克明胶溶于0.43毫升的PBS制备15％（重量/体积）明胶溶液。涡旋该溶液，将其放在水浴在37℃下 ，直到它到达一个溶胶相，其中所述溶液变成流体。然后，涡明胶溶液2 - 3次，以确保日样品电子同质性。
- P（NIPAM- 共 -AAm）/的MNP溶液与模型药物（BSA）的制备：
- 分散10.75毫克亲水的MNP的0.43毫升的PBS，然后在MNP悬浮液溶解12.9毫克对的（NIPAM- 共同 -AAm），使其浓度为3％（重量/体积）。的p（NIPAM- 共同 -AAm）浓度的增加，可用于实现微凝胶的增加的消溶胀行为。
- 使用得克萨斯州红共轭牛血清白蛋白（TR-BSA; 男女〜66 kDa的）为模型药物。溶解0.5毫克的TR-BSA中的p（NIPAM- 共同 -AAm）/的MNP的混合物。
- 通过增加（0.43毫升）P（NIPAM- 合作 -AAm）混合/的MNP（0.43毫升）到明胶溶液，然后准备明胶/ P（NIPAM- 合作 -AAm）/的MNP / BSA溶液（0.86毫升）的混合物彻底涡他们作出均匀的混合物。因此，聚合物和MNP的浓度成为初始浓度在最终混合物的一半。
- 倒入15毫升硅油[聚二甲基硅氧烷（粘度350 CST）]成一个洁净无菌烧杯中。
- 立即加入明胶/ P（NIPAM- 共 -AAm）/的MNP / BSA溶液（0.86毫升）的预先准备好的含水混合物进硅油，并通过与在900磁性搅拌棒搅拌下乳化于油相中的含水混合物转速，在30℃下 30分钟。
3.凝胶和微滴转移到水溶液
- 传送从烧杯乳液（〜16ml）中到50毫升管中。
- 冷却该管10分钟，在4℃下，在油中的微滴的凝胶化。
- 装满准备L64溶液（4℃）管可达50 ml和大力摇晃管。它可以是可能的的L64表面活性剂的一部分将是微凝胶内。
- 离心管20分钟为2300 XG在4℃
- Regularlý检查凝胶粒子的颗粒在管的一侧的存在。如果颗粒不可见，离心以相同的速度和温度20分钟。请继续小心地取出上清液，而不会干扰形成在管的内壁上的沉淀。
- 重复步骤（3.3）至（3.5）一次。每次，将样品转移到新的试管中，以避免任何油滴中微粒凝胶悬浮液中的夹杂物。此步骤后，确保表面活性剂或油滴中不存在的样品悬浮液。然而，重复的分离步骤可导致初始材料的损失。
4.微凝胶的共价交联
- 加2ml的京尼平溶液（在第1制备的），以凝胶粒子的沉淀并通过涡旋将溶液它们拌匀。
- 很快，在23℃下转移在水浴将悬浮液的管中的德期间发起的共价交联反应（ 如5 - 120分钟）IRED交联时间。
- 交联后，立即被丢弃京尼平的解决方案，在PBS重悬微凝胶，和2,300 XG（4℃）离心管20分钟，除去任何过多的交联剂。如果需要的话，小心翼翼掰开形成颗粒用枪头。该洗涤步骤可重复最多3次，如果京尼平仍然在溶液中剩下的。
- 通过用血球计数的数目弃去上清液并以所希望的密度重悬在PBS中的微粒凝胶（例如，5×10 6微凝胶/ ml）中。
- 对于显微镜观察，加载微粒凝胶悬浮液在载玻片和盖玻片之间的空间和密封用环氧树脂盖玻片的边界。
触发药物释放交变磁场5.应用
- 放置管与在水性介质中微凝胶的期望浓度成磁线圈的腔室。如果需要的话，插入一个光纤温度探头插入管的AMF的应用过程中监视介质的温度变化。
- 在限定的场强（> 5千安/米）和一特定的持续时间施加高频率（> 100千赫）的AMF。以下的AMF的应用，离心机在2,273 xg离心（4℃）并收集上清液量化从微粒凝胶释放到使用分光周围介质的TR-BSA的量20分钟的样品管中。为德克萨斯红的激发和发射波长分别为584纳米和612纳米。
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Representative Results
当正确地进行协议，所制造的微凝胶应表现出在5微米之间微米至20（图1B 和C）的范围内的充分表征的球形形态和胶体分散直径。任一荧光灯的MNP或荧光的BSA可以用来确认是否的MNP或药物（BSA在这项研究中）的微粒凝胶（图1D）内适当包封。所制作的微凝胶可以稳定且存储在没有任何酶降解剂，包括胶原酶摄氏 4度长达4周。的p在明胶微凝胶中掺入（NIPAM- 共 -AAm）使其能够表现出依赖于温度的体积变化（图2A），其中，所述介质的温度从22℃至 42℃下的增加导致了消溶胀由〜40％纳入p（NIPAM- 合作 -AAm）明胶微凝胶体积，而相比之下，对于明胶微粒凝胶仅〜10％的体积变化而不ρ（NIPAM- 共同 -AAm）（ 图2B）。明胶/对的消溶胀的程度（NIPAM- 共同 -AAm）微凝胶可被调谐为明胶基质的交联度的函数和p的（NIPAM- 共同 -AAm）的浓度为8。
如果的MNP适当的明胶/ P（NIPAM - 共 - AAM）微粒凝胶掺入，微粒凝胶应该经历在施加适当的AMF的应用，其可以诱发溶液温度的增加，以及在凝胶内的温度上升。在这项研究中，AMF（10分钟）的短曝光的在20千安/米的磁场强度的应用导致在温度逐渐升高通过在媒体10℃（从20℃至 30℃）（ 图2C）。据预计，所述微粒凝胶中的实际温度上升将bË比在媒体观察到的高得多，由于微粒凝胶的基质可以阻碍散热到周围区域。从明胶/ P（NIPAM- 共 -AAm）TR-BSA的释放的程度/的MNP测定为〜35％，而由明胶/的MNP微凝胶的TR-BSA的释放不掺入P（NIPAM- 共同 -AAm）为显著低在约10％（图2D）。因此，我们的结果表明，BSA的响应于AMF应用的释放诱导明胶/ P（NIPAM- 共 -AAm）的消溶胀/的MNP微粒凝胶，用对的收缩有关（NIPAM- 共同 -AAm）聚合物链微粒凝胶内（图3）。因为微凝胶消溶胀的程度成正比的温度上升和p的浓度的两个范围（NIPAM- 共 -AAm）8，一个策略，以增加在步骤1的MNP 24或对（NIPAM- 共 -AAm）8的任一量在协议部分可能会增加释放Ø ˚FBSA在AMF的应用给定的磁场强度和频率。
图1.准备明胶混合微凝胶。 （A）的磁响应微粒凝胶的制造的示意性概述。掺入 超顺磁性纳米颗粒（的MNP）和热-反应p磁响应微粒凝胶的胶体悬浮液（B）的相衬显微镜图像（NIPAM- 共同 -AAm）链。比例尺= 50微米。单个微粒凝胶（C）的微分干涉对比（DIC）图像。比例尺=5μm以下。单个微粒凝胶包封的TR-BSA（D）的荧光显微镜图像。图像中的荧光信号从TR-BSA中。比例尺=5μm以下。K“>点击此处查看该图的放大版本。
从明胶混合动力微凝胶图2.热响应消溶胀行为与BSA发布。（A）代表DIC图像显示为42℃。明胶/ P（NIPAM- 合作 -AAm）微凝胶在22 摄氏度诱导温度升高的消溶胀这个数字已经从基准修改[8]。纯明胶微凝胶和明胶微凝胶包埋p的消溶胀比率（最终体积/初始体积）的（B）的比较（NIPAM- 共同 -AAm）链响应于从22 摄氏度的温度升高至42℃。这个数字已经从基准修改[8]。 （C）的AMF的应用过程中在媒体中的环境温度的变化（在20kA的/米，并在frequ磁场强度 2.1兆赫的胶片）。 （D）的TR-BSA（％）的响应于AMF（在2.1兆赫20千安/米）的释放的应用10分钟。从微凝胶的TR-BSA释放的程度通过测定的TR-BSA的荧光强度的比率，在AMF刺激后微凝胶溶液中的媒体的AMF刺激之前microgles内于22℃下定量，以TR-BSA的总荧光强度，用分光光度计*：p <群体之间0.05 点击此处查看该图的放大版本。
图3.潜在的机制的示意图由明胶/ P（NIPAM-CO-AAM）/微凝胶的MNP发布响应AMF应用药物。“_blank”>请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里所描述的技术演示概念的使用纳米粒子微凝胶杂交的磁热触发药物释放证明。这是通过由京尼平交联的微尺度三维明胶网络内的物理截留的MNP和p（NIPAM- 共 -AAm）链来实现的。磁场响应平台足以响应于远程施加的AMF，这又引发了模型药物，BSA的释放，以产生微粒凝胶内的热量。
A至嵌入两者的MNP和p（NIPAM- 共 -AAm）策略似乎是实现从明胶微凝胶所期望的药物释放至关重要的，因为从明胶/的MNP微粒凝胶在没有的p BSA的释放的程度（NIPAM- 共 -AAm）高于从微粒凝胶掺入p（NIPAM- 共 -AAm）所述一个显著下，即使温度升高至AMF应用的程度是在两种类型的微粒凝胶的类似（图2C和2D）。我们表明，明胶/ P（NIPAM- 共 -AAm）微粒凝胶的消溶胀行为由p的收缩率（NIPAM- 共 -AAm）响应于温度的升高聚合物链引起的;此外，该消溶胀行为正与药物释放从微粒凝胶8的程度相关。总之，这个支持的P（NIPAM- 共同 -AAm）的收缩，由于加热的MNP可能是从明胶/ P（NIPAM- 共同 -AAm）/微凝胶的MNP的BSA释放的主要动力。
我们以前报道，一个高频的AMF到的MNP应用程序可以在一个方式是成正比的AMF强度和的MNP 25的浓度的大小触发的MNP的表面上的温度升高。已经显示5的那AMF强度- 30千安/米是足以诱导的MNP 9,25,26的表面上的适当加热。因此，药物的rel的程度从明胶/ P（NIPAM - 共 - AAM）缓解/的MNP微凝胶可通过适当地改变的参数，其中包括对（NIPAM - 共 - AAM）的量，交联时间，的MNP的量，和AMF参数（字段被调谐强度，频率和曝露的持续时间）。
在我们的用于制造磁 - 热响应微凝胶协议中，最关键的步骤是明胶凝胶粒子在京尼平溶液中的共价交联。的交联时间和温度仔细控制，以及保持在京尼平溶液中的微粒凝胶悬浮液的均匀性，需要以达到预期的凝胶弹性，这可能影响微粒凝胶响应。交联后，除去未反应的京尼平分子也是一个重要的步骤。
明胶已被证明是生物相容的具有低免疫原性和酶可降解8,27。化学交联剂京尼平，一直被认为是无毒的<SUP> 28。因此，我们的基于明胶的药物递送平台呈现磁响应和合适的可生物降解的特性可提供用于组织工程应用的有用工具作为一个按需药物载体。
然而，它也应注意的是，当前的协议有其局限性。首先，通过水包油乳化法取得的微凝胶通常显示出多分散性，这可能导致在粒子间的药物和的MNP封装异质性。微流体可以克服该限制29一个很好的选择。其次，目前的药物递送系统仍然具有LCST（〜34℃）的相对低的值相关联的，它必须在37℃的体温可使用由于一个小的程度在该温度下消溶胀特性的限制，对于聚在该研究中使用（NIPAM- 共 -AAm）聚合物。使用温敏聚合物，可以表现出更高的LCST可以克服THIs刊30。
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Acknowledgments
这项研究是由里斯家庭创新奖和美国国立卫生研究院1R01NR015674-01到MK支持。作者感谢何塞普Nayfach（Qteris公司）提供的电磁发电机系统，以及他的技术咨询。作者还感谢焕颜（LCI及物理化学跨学科计划，肯特州立大学），她的技术助理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, MO, USA | G2500 | Gelatin type A, porcine skin |
| poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) | Sigma-Aldrich, MO, USA | 738727 | MW = 20,000, LCST = 34 - 38 °C |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich, MO, USA | 378372 | Viscosity 350 cSt |
| Pluoronic L64 | Sigma-Aldrich, MO, USA | 435449 | poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) |
| genipin | TimTec LLC, DE, USA | ST080860 | MW = 226.23 |
| Magnetic nanoparticles (MNPs) | Micromod Inc, Germany | 79-00-102 | nanomag-D-spio, 100 nm |
| TR-BSA | Life Technologies, NY USA | A23017 | Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate |
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