Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53682
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

Introduction

Arenaviruses הם משפחה של מעטפת, וירוסים RNA חד-גדילי שנשמרים בעיקר במכרסמים בטבע 1-3. בעוד וירוסים אלה בדרך כלל להקים זיהום אסימפטומטית, עיקש במאגרי מכרסם 1,2, הם יכולים לגרום למחלות קשות בבני אדם 3. מיני פתוגניים חשובים לכלול את וירוס העולם החדש חונין ​​(JUNV) 4 ואת העולם הישן לסה הווירוס 5, אשר הם סוכני האטיולוגי של קדחת מדממת ארגנטינית בדרום אמריקה קדחת לסה באפריקה, בהתאמה. וירוס choriomeningitis לימפוציטית (LCMV), וירוס אב הטיפוס של המשפחה 6, נפוץ ברחבי עולם ואחראי על מגוון של מצב מחלה כולל דלקת קרום מוח אצל אנשים עם מערכת חיסון תקין 6, למומים מולדים חמורים בעובר 7 מתפתח, או קטלנית גבוה immunosuppressed אנשים הבאים 8,9 השתלה מוצק איברים. חוסר ארצות הבריתמזון ותרופות (FDA) -approved חיסונים או antivirals היעילה להילחם וירוסים אלה מדגישים את הצורך הקריטי לפתח אסטרטגיות רומן למקד אלה מתעוררים / מחדש המתעוררים פתוגנים טיפוליים.

הגנום arenavirus מורכב משני המגזרים RNA חד-גדילי, גדול (L) (~ 7.2 kb) וקטנים (S) (~ 3.6 kb) מגזרי 10. מגזר S המקודד את nucleoprotein ויראלי (NP) ו גליקופרוטאין המעטפה (GP) בעוד קטע L מקודד פולימראז ויראלי (L) וחלבון מטריקס (Z). The L ומגזרי RNA S גנומי (vRNAs) ארוזים לתוך virions 10-12. השלב הראשוני של זיהום arenavirus הוא מצורף של חלקיקים נגיפיים לארח התאים דרך אינטראקציה בין GP ויראלי קולטני התא המארח המתאים אשר עבור JUNV, כולל קולטן transferrin האדם 1 (hTfR1) 13,14. בעקבות עיקול, חלקיקים JUNV נלקחים לתוך התא באמצעות אנדוציטוזה בתיווך clathrin 15.חלקיקים אז תנועה אל אנדוזום מאוחר שבו pH הנמוך של תא זה מעורר את ההפעלה של GP 16,17. לאחר ההפעלה, מוסיף פפטיד היתוך בקידוד GP לתוך קרום endosomal, ייזום היתוך בין ממברנות ויראלי endosomal. תוצאות היתוך מוצלחות שחרורו של vRNAs ארוז virion לתוך הציטופלסמה, שם הם משרתים כתבניות שכפולות שעתוק הגנומי. כאשר כמויות מספיקות של חלבונים מבניים ויראלי vRNAs נוצרות, חלקיקים חדשים להרכיב ניצן מהתא הנגוע כדי להשלים את מחזור החיים 18.

כדי להקל על גילוי האסטרטגיות חדשות כדי למקד את arenaviruses פתוגניים טיפולי, הקבוצה שלנו התמקדה בזיהוי גורמים מארחים כי הם קריטיים עבור התפשטות נגיף, אבל אפשר לוותר עליהן עבור המארחת. בהקשר זה, המגדיר את הבמה המדויקת (ים) של מחזור החיים של הנגיף נשלט על ידי גורמי מארח שכזו נדרשת בכדי להנחות אתפיתוח של אסטרטגיות נגיפים. בזאת, אנו מתארים assay כמותית (q) RT-PCR מבוסס כי ניתן להשתמש כדי למדוד מצורף arenavirus תאים לצורך זיהוי אם חלבונים מארחים נבחרים ו / או מולקולות אנטי להשפיע בשלב ראשוני זה של כניסה ויראלי 19. גישות חלופיות למדידת מצורף arenavirus תאים כיכבו virions שכותרתו עם ביוטין 20, צבעי ניאון 21, או איזוטופים רדיואקטיביים 22. חסרונות שיטות אלה יכולים לכלול את הדרישה עבור כמויות גדולות של וירוס קלט (למשל multiplicities גבוהה של זיהום (משרד פנים)), שימוש רדיואקטיביות, ו / או צעדי טיפול נוספים להכנת וירוס קלט (למשל ריכוז ו / או תיוג של וירוס) . בפרט, השימוש גבוה משרד פנים מקשה להבחין פרודוקטיבי לעומת אירועים מצורפים פרודוקטיבי 15,23. את assay qRT-PCR המבוסס המתואר כאן ניתן לזהות אירועים מצורפים באמצעות כמה כמו 20 פלאק עבוריחידות מינג (PFUs) של הנגיף, אשר מיתרגם משרד הפנים של 0.0004 עבור צלחת 48-היטב. לכן, הרגישות החזקה של assay מתגברת על הדרישה גבוהה משרד פנים וכן כל צעדי תיוג וירוס או ריכוז. יתר על כן, assay יכול להיות אני) מותאם למדוד אנדוציטוזה virion וכן שחרורו של הגנום וירוס לתוך הציטופלסמה הבא פיוז'ן ii) מותאם לשימוש עם וירוסים אחרים באמצעות הפיתוח של חומרים כימיים qRT-PCR ספציפי וירוס (לדוגמות, ראה 24-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: זה קריטי, כי הפרוטוקול המתואר להתבצע באמצעות טכניקה מראש PCR קפדנית (ראה 28 עבור סקירה מצויינת על איך להקים מעבדה טרום PCR וכיצד לבצע ניסויים באמצעות טכניקה מראש PCR טוב). זה הכרחי כי כל חומרים כימיים וציוד חופשיים של DNA מוגבר המכיל את רצף היעד qPCR וכי הבקרות המתאימות נמצאים במקום כדי לזהות זיהום כזה. סקירה כללית של פרוטוקול מוצג באיור 1.

1. כן מדיה תאי זרע צלחות 48-היטב

  1. הכן 500 מ"ל של מדיום הנשר שונה של שלמה Dulbecco (DMEM) המכיל בסרום שור 10% עוברית, 1% פניצילין, סטרפטומיצין, ו -1% HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-אתאן חומצה sulfonic) פתרון חיץ על ידי הוספת 50 מ"ל של בסרום שור העובר מומת חום 5 מ"ל כל אחד פתרון חיץ פניצילין, סטרפטומיצין ו 100x HEPES 100x כדי בקבוק 500 מ"ל של DMEM. ניתן לאחסן מגיב זה ב 476; C במשך חודשים.
  2. זרע 2.5 x 10 4 תאים Vero E6 לכל היטב צלחת תרבות 48-היטב רקמות בנפח סופי של 500 μl של שלמה DMEM. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO 2 עבור 10 עד 18 שעות.
    1. זרעים הצליחו בסוף יום העבודה. בדוק מדגם וירוס בבארות ומשכפלים או בשלושה עותקים.
      הערה: בעוד פלטפורמה 48-ומבוססת עבור assay זה מתואר, זה צריך להיות אפשרי כדי לשנות את גודל assay למטה לשימוש צלחות 96 או 384 גם.

2. לבצע Attachment תאי וירוס

הערה: וירוס בשימוש בפרוטוקול זה, זן JUNV פספוסים 1 # (C # 1), שימש בהצלחה כחיסון מוחלשים חי למניעת JUNV המחלה 29. JUNV C # 1 נגזר XJ הארסית זן JUNV דרך מעבר סדרתי היא in vivo ו במבחנה נבדל זן XJ הורי על ידי 12 חומצות אמינו 30. becausדואר JUNV C # 1 רמת biosafety (מנהלת ליגה) הפתוגן -2 מדורג, העבודה המתוארת עבור סעיף זה חייבת להתבצע באמצעות 31 שיטות BSL-2 מתאימות. זה כולל שימוש בציוד מגן אישי (הגנה וחקר עיניים למשל, מעייל מעבדה, כפפות כפולות), ארון בטיחות ביולוגי בכיתה שנייה, וכן להבטיח כי כל האנשים קבלו הודעה כוללת הכשרה ואישורים המוסדיות נדרשים להתמודד האורגניזם הזה בשלום.

  1. לדלל את מדגם # 1 JUNV C (ים) להיבדק אל PFUs הרצוי או להתמקד יחידות להרכיב DMEM המלא קר כקרח ולאחסן על קרח עד מוכן להוסיף היטב כל אחד.
    הערה: כחלופת ביצוע המחקרים המחייבים בוירוס המדולל השלם DMEM, להשתמש מדיום מינימאלי המכיל PBS עם ריכוז בסרום מופחת (2%) ו מאגר מתאים כדי לקבוע אם בסרום עלול לגרום להפרעות עם קובץ מצורף וירוס. פרוטוקולים מצורפים דומים לאיתור וירוסי אלטרנטיבה דיווחו שימוש בינוני RPMI 1640 ללא bicarboנייט המכיל אלבומין 0.2% שור, 10 מ"מ (2- (morpholino) חומצה ethanesulfonic), ו 10 HEPES מ"מ, pH 6.8 32. תקשורת מחייבת זה יכול להיות מעולה כדי למנוע שינויי pH שעלולה להתרחש כאשר התקשורת יוסרה -environment CO 2 של החממה.
    1. לחסן בארות עם PFUs הנעות בין 200 ל -2,000 להגביל אירועים מצורפים פרודוקטיבי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, assay זה הוא מסוגל לאתר מצורף באמצעות כמה כמו 20 PFU (או רבים ככל 2 x 10 6 PFU).
    2. צור מיקס מאסטר של וירוס עבור חיסון על תאים. כל מדגם וירוס יהיה מחוסן על בארות כפולות בהיקף של 50 μl לכל טוב. לכן, אם התוספת של 2,000 PFUs של וירוס לכל טוב היא רצויה, לדלל 4,800 PFUs לתוך בנפח כולל של 120 μl של קרח קר להשלים DMEM.
      1. כדי לשלוט על הספציפיות של assay, להשתמש זוג תואם של שורות תאים שחלה של אוגר סיני, כי אם לא להביע TfR1 (TRVb) או express hTfR1 (TRVb-1) כקובץ מצורף JUNV לתאים אלה צריך גם להיות מופחת או לא, בהתאמה 13,33. לחלופין, לטפל בתאים עם פרוטאז כגון K proteinase למנוע מצורף arenavirus 34 או כניסה 35. מסיסים hTfR1 או ch128.1 נוגדן monocolonal, שהוא ספציפי עבור hTfR1, יכול להיחשב גם כפי שהם ידועים כדי לחסום כניסת JUNV לתאים 13,36. בנוסף, טיפול מקדים של תאים עם מנוז חינם 14 או דגירה של חלקיקים עם נוגדנים מנטרלים ספציפי JUNV 37 יכול לעכב כניסת וירוס.
      2. שים לב, עם זאת, כי ריאגנטים אלה אחרונים וגישות, למרות חסימת כניסת JUNV, שלא אושרו לחסום מצורף, אם כי זה הוא הסבר סביר. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לקבוע באופן רשמי אם מצורף virion השפעה הגישות השונות הללו.
  2. סור צלחות מן 37 ° C החממה וכל אחד מהמקומות במקרר 4 ° C. או על קרח למשך 15 דקות כדי לעכב את היכולת של התאים מצופה לבצע אנדוציטוזה.
  3. לאחר מכן, לשאוב DMEM המלא מכל טוב ובמהירות לשטוף היטב כל פעמים באמצעות 100 μl של קרח הקר PBS (בופר פוספט) pH 7.4. לאחר מכן להוסיף 50 μl של הדגימות מראש מדולל הווירוס (מוכנות בשלב 2.1) על הבארות המתאימות.
  4. עוטפים את הצלחת בניילון נצמד ומכניסים מיד או חזרה על קרח או במקרר 4 ° C. עבור 1 עד 1.5 שעות כדי לאפשר התקשרות וירוס להתרחש. שמור את הצלחת, לשטוף חיץ, ו דגימות נגיף קר על 4 מעלות צלזיוס במשך שלב זה.
  5. לאחר השלמת הדגירה 4 ° C., לשאוב את הבידוד וירוס ולשטוף היטב כל 3 פעמים עם 200 μl של PBS קר כקרח.

3. ויראלי RNA הפקה

  1. לטהר רנ"א נגיפי מ JUNV C # 1 חלקיקים מצורפים monolayers באמצעות הערכה המסחרית (למשל, ערכת RNeasy מיני) אקורדינג הפרוטוקול של היצרן. באופן ספציפי, בצע את "הטיהור של RNA הכולל תאים של בעלי חיים באמצעות פרוטוקול טכנולוגית ספין" בעמודים 23-28 בחוברת מיני RNeasy (4 מהדורת ה, אפריל 2006) בשינויים המפורטים להלן.
    1. Lyse התאים כמצוין בשלב 1B ידי הוספת 350 μl של RLT חיץ תמוגה ישירות היטב כל אחד. מערבבים את החיץ מספר פעמים על מנת להבטיח תמוגה התא. שים לב תאים בקלות lyse במאגר זה תמוגה המלא ניתן לאמת על ידי הצגת בארות תחת מיקרוסקופ הפוכה.
    2. מעביר את lysate התא וכתוצאה מכך לעמודת ערכה (3a הצעד) ובצע את שאר הפרוטוקול כמתואר. בשלב זה, הנגיף נוטרל על ידי חיץ תמוגה לכן השלבים הנותרים של הפרוטוקול יכול להיעשות מחוץ לארון biosafety בכיתה השני ספקו צינורות הערכה לא היו מזוהמים וירוס מדבק.
    3. כלול את השלב האופציונלי 9 מתוך הפרוטוקול של היצרן, המהווה additצנטריפוגה ional של הטור לסיבוב כדי לחסל כל שריד אפשרי של הצפת הרשתית.
    4. בשלב האחרון פרוטוקול של היצרן (שלב 10), elute רנ"א מטוהרים מהעמודה ספין באמצעות 30 μl של DDH nuclease ללא 2 O. RNA חנות ב -80 ° C, בשלב זה או להשתמש ישירות assay qRT-PCR. כדי למנוע הידרדרות של דגימות רנ"א נגיפי מטוהרים ידי nucleases, להשתמש ריאגנטים nuclease ללא וציוד ולשמור דגימות רנ"א מופשר על הקרח.
      הערה: חוצצי RLT ו RW1 מכילים מלח guanidine ולא צריך להיות מעורב עם אקונומיקה. הצפת RW1 מכיל אתנול.

4. qRT-PCR מדידה של הגנום הויראלי

  1. כדי להמיר RNA קטע S # 1 JUNV C לתוך cDNA עבור qPCR הבאים, לייחד רנ"א נגיפי (שנוצר בשלב 3.1.4) כדי RT בנפח כולל של 50 μl.
    1. כדי להגדיר את תגובת RT, ראשון ליצור תערובת אמן המכילה כל אחד ריאגנטים הבאים לכל תגובה: 6.75 μl של nuclease-חינם DDH 2 O, 5 μl של המניה 2 מיקרומטר של S פריימר RT 2098- ל 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), אשר הוא משלים באזור NP של RNA הגנומי קטע S, 5 μl של 10X PCR חיץ השנייה, 11 μl של פתרון 25 מ"מ MgCl 2, 1.25 μl (62.5 יחידות) של האנזים RT, 1 μl (0.4 יחידות) של מעכב RNase, ו -10 μl של 500 מיקרומטר המניות של dNTPs.
      הערה: במהלך שכפול arenavirus, 4 מינים רנ"א נגיפי S קטע נוצרות: א RNA הגנומי באורך מלא (vRNA) חברה RNA באורך מלא antigenomic (vcRNA) (כי הוא המשלים השני של vRNA), ושני mRNAs subgenomic קידוד גני NP ו- GP, בהתאמה. פריימר RT הרשום כאן הוא ספציפי רק עבור מקטע S vRNA, אך לא את vcRNA, NP mRNA, או GP mRNA.
    2. בעדינות מערבבים את תערובת מאסטר RT ואז aliquot 40 μl לתוך צינורות 0.2 מ"ל PCR בודדים. הוסף 10 μl של רנ"א נגיפי על צינור אחד. כלול i) לא צינור מלא תבנית (למשל. להוסיף 10 μl של nuclease ללא DDH 2 O עד 40 μl של מיקס מאסטר) ו ii) אין שליטה האנזים RT (למשל להוסיף 10 μl של מדגם רנ"א נגיפי ידוע חיובי עד 40 μl של תמהיל אמן שלא קיבלו כל אנזים RT) למסך זיהום של חומרים כימיים RT עם DNA מוגבר המכיל את רצף היעד ויראלי. כלול RNA חילוץ מתאי נגוע עם מיקס מאסטר מלא RT לשלוט על סגוליות assay בנוכחות RNA הסלולר.
    3. בנוסף, כולל מדגם רנ"א נגיפי ידוע חיובי מיקס מאסטר המלא לאימות האיכות של ריאגנטים RT. ראוי לציין, כי היקף התגובה RT ניתן להפחית עד 25 μl במידת הצורך.
  2. נושא צינורות RT לתנאי האופניים הבאים: 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 48 ° C למשך 30 דקות, ו 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שים לב ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C, בשלב זה או שמשאירים אותה כל הלילה את thermocycler על ידי הוספת שלב 4 ° C..
  3. Perform qPCR בנפח כולל של 25 μl.
    1. הכן תערובת מאסטר qPCR על ידי שילוב של הבאים: 2.5 μl (מלאי 9 מיקרומטר) של כל פריימר PCR קדימה S1937 + כדי 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') הפוכה PCR פריימר S 2001 ל 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2.5 μl (של המניה 2 מיקרומטר) של S החללית qPCR 1960+ כדי 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), ו -12.5 μl של המאסטר 2X אוניברסלי qPCR לְעַרְבֵּב. ראוי לציין, כי פריימר קדימה דיווחו כאן, שהוא ספציפי עבור JUNV C # 1, שונה על ידי 1 NT מהרצף פריימר דווח במקור 38, אשר מטרות JUNV זן ארסי רומרו.
    2. בעדינות מערבבים את הפתרון ולאחר מכן להוסיף 20 μl לכל qPCR היטב. הוסף 5 μl של כל תגובת RT על בארות qPCR המתאימות. לנהל qPCR בשלושה עותקים עבור כל דגימה הנבדקת. ראוי לציין, כי עוצמת התגובה PCR יכול להיות מופחת מעט ככל 12.5 μl במידת הצורך.
      הערה: התוכנה קשורההמכונה qPCR יפיק מספרי עותק מוחלטים של RNA הגנומי JUNV C # 1 קטע S ידי עריכת השוואה בין הערך של כל מדגם לא ידוע על שורה של דילולים רמים פלסמיד המקודד את גן JUNV C # 1 NP, המהווה את היעד של פריימר qPCR ו חללי להגדיר. את assay qPCR יכול לספק quantitation רק עבור ערכים ליפול בטווח של עקומת סטנדרט. מסיבה זו, כוללים את כמויות פלסמיד הבאים (בבארות בשלושה עותקים): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, ו -5 x 10 7 עותקים לכל טוב.
  4. טען את צלחת qPCR לתוך thermocycler ולהפעיל את תנאי התגובה הבאים: 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות ו 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    1. לאסוף ולנתח את הנתונים כדי לקבוע את הכמות הנוכחית רנ"א נגיפי כל דגימה על פי הפרוטוקול של היצרן.
  5. כדי להקים עקומת סטנדרט באמצעות מדגם חדש מטוהר של פלסמיד המכיל את זפת qPCRלקבל רצף, יש לקבוע תחילה את מספר עותק פלסמיד בפתרון זה.
    1. חשב את המשקל המולקולרי של הפלסמיד. אם הרצף של פלסמיד כולו ידוע, לחשב זה באמצעות הנוסחה הבאה: MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13). זכור לכלול את המספר הכולל של נוקלאוטיד מסוים נמצא על כל גדיל של פלסמיד גדילים הכפול.
    2. אם הגודל של פלסמיד ידוע אבל הרצף המדויק שלה הוא לא, לחשב את MW בהנחה שכל זוג בסיס dsDNA יש MW 600.
      הערה: הפלסמיד NP pCAGGS-JUNV C # 1 משמש כאן יש MW של 4.2 x 10 6.
    3. לאחר MW של פלסמיד נקבע, לחשב כמה עותקים רבים לכל μl נוכחי הפתרון פלסמיד מניות.
    4. ראשית לחשב את מיקרוגרם הכולל של פלסמיד בתמיסה, ולאחר מכן להמיר את זה כדי שומות של פלסמיד (למשל אם 69 מיקרוגרם של פלסמיד כלול 300 μl של מים, אז 6.9 x 10 -5 גרם של פלסמיד * 1 חפרפרת / 4.2 x 10 6 גרם של פלסמיד = 1.6 x 10 -11 שומות של פלסמיד), אשר ניתן להמיר להעתיק מספר (למשל 1.6 x 10 -11 שומות של פלסמיד * 6.022 x 10 23 מולקולות / שומה = 9.8 x 10 12 מולקולות (או עותקים)).
    5. מחלקים את העותקים הכולל של פלסמיד הפתרון פלסמיד על ההיקף הכולל של שהפתרון לקבל עותקים לכל μl (למשל 9.8 x 10 12 עותקים / 300 μl = 3.28 x 10 10 עותקים).
    6. לדלל את הפתרון הזה כראוי כך 5 כרכים μl ניתן לטעון לצלחת PCR כדי לספק את טווח המספרים עותק נדרש כדי ליצור עקומת סטנדרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להגיע לרגישות וטווח דינמי של assay qPCR, כמויות ידועות של פלסמיד המקודד את הגן NP של # 1 JUNV C (טווח 5-5 x 10 7 עותקים) היו נתונים qPCR כמפורט בסעיף 4 לפרוטוקול. Assay הוא רגיש והוא יכול לזהות באופן מהימן מעטים ככל 5 עותקים של חומצת גרעין היעד (איור 2). יתר על כן, את הטווח הדינמי של assay הוא גדול, כפי שמוצג באיור 2, יכול לכסות לפחות 7 יומנים של תבנית. אמנם לא לעין, זיהינו כמה שרק 5 x 10 9 עותקים של חומצות גרעין.

כדי להמחיש את התועלת של assay למדידת מצורף החלקיקים # 1 JUNV C, כמויות שונות של JUNV C # 1 היו prebound לתאי Vero E6 כמתואר בפרוטוקול. לאחר שטיפת חלקיקים מאוגד משם, התאים היו lysed לטיהור RNA ואת דגימות רנ"א וכתוצאה מכך היו נתונים qRT-PCR. כפי שניתן לראות בתרשים 3, assay יכול לזהות אירועים מצורפים ויראלי באמצעות כמה כמו 20 או כמה שרק 2 x 10 6 PFU, המתרגם MOIs של 0.0004 ו -40, בהתאמה.

כפי שניתן לראות בתרשים 4, אפשר לשנות את הפרוטוקול לא רק למדוד מצורף ויראלי, אך גם שיעור ההגברה של הגנום כלול החלקיקים הנגיפיים נכנסים לאורך זמן. גישה שונה זו יכולה לשמש פונדקאית כדי לקבוע אם פגמים נוספים על השלבים הנותרים של כניסה ויראלי (אנדוציטוזה החלקיקים למשל ו / או היתוך ושחרור הגנום הויראלי לתוך הציטופלסמה) שיכול להתרחש. מעניין לציין, כי כמות הגנום נגיפי נראית לרדת במהלך מצורף 6 שעות הראשונות לאחר, אשר טוען כי חלק של הגנום הויראלי נכנס נפגע. זה יכול לקרות לכל חלקיקים שאינם עומדים להילקח התא לבזות את extracell שטח תואר בלבד או אולי עקב הידרדרות בתוך הרשת endolysosomal. הנתונים המוצגים מוכיחים כי 12 או 18 שעות לאחר הדבקה תהיה פעמים אופטימליות למסך שכפול הגנום פעיל.

איור 1
איור 1:. תיאור של עבודת פרוטוקול השלבים העיקריים של assay מצורף תאי וירוס הם 1) דגירה של חלקיקי נגיף עם תאים ב 4 ° C כדי לאפשר התקשרות תאי וירוס כך שתתרחש ואחריו שוטף להסיר וירוס מאוגד, 2) טיהור של רנ"א נגיפי מהתאים, 3) שעתוק לאחור (RT) כדי להמיר RNA הגנומי קטע JUNV S (vRNA) לתוך cDNA, ו -4) qPCR למנות עותקים של JUNV S vRNA כמדד מצורף תאים וירוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

her.within-page = "1"> איור 2
איור 2:. Assay qPCR לגילוי הגנום קטע S JUNV הוא רגיש והוא יכול לשמש על פני טווח דינמי גדול סט פריימר חללית JUNV S קטע qPCR נבדק עבור יכולתו למדוד כמויות ידועות במדויק (5, 16.6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, או 5 x 10 7 עותקים) של פלסמיד מלא תקן ה- DNA המקודד את רצף היעד. מתואר הם מגרשים ההגברה (א) וקווים בכושר עקום סטנדרט (B). R 2, מקדם מתאם של קבוצת פריימר-בדיקה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: assay מצורף תאי JUNV צעדים באופן מהימןמצורף החלקיקים באמצעות כמה כמו 20 PFU. תאים Vero E6 היו prebound עם כמויות ידועות של JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, או 2 PFU x 10 6) עבור 1.5 שעות ב 4 ° C. חלקיקים מאוגדים הוסרו על ידי שטיפה, תאים היו lysed להפקת RNA, ואת דגימות רנ"א וכתוצאה מכך היו נתונים qRT-PCR כדי לזהות פלח JUNV C # 1 S vRNA כמדד מצורף חלקיקים לתאי E6 Vero. נתונים מייצגים את מספר העותק הממוצע לכל טוב מבארות כפולות ± SEM.

איור 4
איור 4:. קינטיקה של שכפול הגנום # 1 JUNV C בעקבות זיהום תאים Vero E6 הודגרו עם 2 x 10 3 PFU של JUNV C # 1 (משרד הפנים של 0.04) עבור 1.5 שעות ב 4 ° C. לאחר מספר שטיפות ב PBS קר כקרח, התאים נקצרו או מיד (0 hr נקודת זמן)או חמם עד 37 מעלות צלזיוס במשך הפעמים הצביעו לפני האיסוף. בכל מקרה, RNA הכולל היה שחולץ מן התאים נתונים qRT-PCR כדי לזהות פלח JUNV C # 1 S vRNA. ערכים מופיעים כאן בתור עותקים מתכוונים לכל טוב מבארות כפולות ± SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול אנו מתארים הוא פשוט וחזקים בתנאי השיקולים הקריטיים הבאים הם נצפו. ראשית, טכניקה מראש PCR קפדנית חייבת להיות מועסקת (ראה 28 לבחינה מעולה). זה הכרחי כי כל חומרים כימיים וציוד חופשיים של DNA מוגבר המכיל את רצף היעד qPCR וכי הבקרות המתאימות נמצאים במקום כדי לזהות זיהום כזה. שנית, עבור החלק המצורף תאי וירוס של הפרוטוקול, הנגיף, תאים, ומדיה חייב להישמר על 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע אנדוציטוזה של virions נכנס שטח. שלישית, כמות התאים שנאספו להפקת RNA אסורה תגבור על יכולתם RNA המחייבת של מסנן טיהור RNA. חייבות להיות מוגנות רביעיות, דגימות רנ"א נגיפיות מטוהרים מן השפלה בתיווך ribonuclease באמצעות ריאגנטים nuclease ללא וציוד על ידי שמירה על אותם על קרח כאשר מופשר. חמישי, המגוון של עקומת הסטנדרט כלול assay qPCR חייב להיות גדול מספיקכדי ללכוד את כל הערכים שנצפו מן הדגימות הידועות. שישית, יש לכלול משכפל טכני הוא החלק המצורף תאי וירוס של assay, כמו גם את qPCR של דגימות רנ"א פרט. (שורות תאים למשל מבטאי hTfR1 או לא) שביעיות, שולטים ניתן לכלול לשלוט על הספציפיות של assay. לבסוף, כל האנשים חייבים לעבור הכשרת בטיחות ביולוגית מתאימה ואישור מוסדי לטפל C זיהומיות JUNV # 1 או arenaviruses פתוגניים אחר.

חלק qPCR של הפרוטוקול קורא בדיקת qPCR בעיקר כדי להבטיח את הספציפיות של המוצר להיות מוגברות במהלך כל שלב של תגובת PCR. העלות של assay יכולה להיות מופחתת, לעומת זאת, על ידי ביטול בדיקת qPCR זה לטובת אחרת כימית qPCR שאינו דורשת בדיקה (למשל השימוש של הצבע הסימטרי SYBR הירוק אני 25) ו / או על ידי הקטנת הנפח של תערובת התגובה qPCR בשימוש. אם אפליקצית qPCR בדיקה עצמאיתהמקק משמש, זה יהיה חשוב לוודא כי תנאי התגובה מחמירים מספיק כדי להבטיח ספציפי של פריימרים qPCR. כמו כן, חשוב להיות מודעים לכך RNA arenavirus, אם מופק תאים או virions, יכול להיות דרוך nonspecifically לגבש cDNA במהלך RT בהעדר פריימר RT ספציפיים וירוס 12. לכן, להעתיק מספרים זוהו באמצעות פריימר RT vRNA ספציפי אינו משקפים בהחלט רק מיני vRNA כוונת של פריימר RT. אם וספציפיות הגנום או antigenome נדרש, דיווחנו אמצעי לעקוף תופעה תחול ספציפי זה באמצעות פריימרים RT biotinylated וחרוזים streptavidin 12.

חוזק חשוב של assay זה רגישות קיצונית. מבחנים מצורפים arenavirus תאים אחרים שמציעים רדיואקטיבית שכותרתו 22, biotinylated 20 או שכותרתו fluorescently 21 חלקיקים נדרשו MOIs של 0.2, 100, או 1000, בהתאמהly. בעוד שימוש תוצאות חלקיקים שכותרתו רדיואקטיבית ברגישות טובה, זה מחייב שימוש רדיואקטיביות, אשר מגביר את החששות המורכבים ובטיחות הלוגיסטיות הקשורות assay המסוים הזה. השיטה המבוססת qPCR המתואר כאן דורשת מעט ככל 20 PFU (משרד הפנים של ~ 0.0004 בצלחת 48-היטב) והוא יכול לזהות מצורף באופן מהימן על פני טווח דינמי גדול של MOIs (למשל MOIs מ 0.0004 לפחות 40) (איור 3 ). הרגישות החזקה של assay זה מאפשר להשתמש MOIs הנמוך למדידה מדויקת יותר של אירועים מחייבים פרודוקטיבי ידי וירוס מדבק סטנדרטי. הרגישות הגבוהה גם מפחיתה באופן משמעותי את כמות וירוס דרושי assay ו, ותוך כדי כך, מגבילה את צעדי טיפול הנוספים שעשויות להשפיע על איכות virions בשימוש assay (למשל פוליאתילן ממטרים מבוסס גליקול של virions, תיוג virions עם fluorophores או איזוטופים רדיואקטיביים ו / או סוכרוז פסים של virions). בנוסף, assay qPCR עצם הוא פשוט לביצוע, כמו גם מאוד מדויק לשחזור.

את assay תא-המצורף המתוארים יכול להיות שונה כדי למדוד שלבים נוספים של כניסת ויראלי כוללים אנדוציטוזה חלקיקים ויראלי, כמו גם את השלב האחרון של היתוך וירוס, וזה שחרורו של הגנום הויראלי לתוך הציטופלסמה. כדי למדוד אנדוציטוזה חלקיקים, אותם השלבים של הפרוטוקול המצורף יהיו אחריו עד שלב 2.5, שהוא מצורף של חלקיקים לתאים על 4 מעלות צלזיוס. תאים יהיה אז חימם לאפשר חלקיקים נגיפיים להיות endocytosed, ואחריו טיפול עם פרוטאז להתפשט בכל virions חיצוני הנכנס שלא היו endocytosed כמתואר 22,24. סעיפים 3 ו -4 של פרוטוקול זה היה אז להיות אחריו כדי לחלץ RNA ויראלי לכמת עותקים של RNA הגנומי ויראלי כמדד אנדוציטוזה. כדי למדוד הגנום uncoating הבאים היתוך של ממברנות ויראלי endosomal, התאים יהיה prebound עםוירוס ב 4 מעלות צלזיוס, מחומם (להתיר אנדוציטוזה ואיחוי) שולל מהם החלקיקים חיצוניים, ולאחר מכן אסף לניתוח. בגישה אחת, ותאים עלולים להיות lysed בתוך חיץ איזוטוני לשמר שלפוחית ​​תאית, ולאחר מכן התפצל 2 שברים: אחד כי הייתה להיות מטופלים עם קוקטייל של RNases (רנ"א הנגיפי ללא ציפוי רגיש שפל) והשני שלא היה 39 . לחלופין, והתאים עלולים להיות מופרדים לתוך שברים cytosolic או endosomal 40. בשני המקרים, qRT-PCR ישמש לכמת הגנום הויראלי בציטופלסמה כמדד uncoating הגנום הויראלי. לאחרונה, assay qRT-PCR ניתן לשנות בקלות ללמוד מצורף וירוס, אנדוציטוזה, או היתוך לאיתור וירוסים אחרים המסופקים ריאגנטים RT-PCR המותאמות וירוס חדש של עניין (לדוגמאות ראה 24-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים מרקוס טאלי, נתן רועי, כריסטופר זיגלר, אמילי ברוס, ובנימין המלך לדיונים מועילים לבין המכון הלאומי לבריאות לתמיכה במחקרים אלה באמצעות מענקים T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ו P20RR021905 (JB) .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’		 Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 109 arenavirus וירוס חונין וירוס choriomeningitis לימפוציטית מצורף תאי וירוס וירוס תאים מחייבים מצורף virion מצורף חלקיקים ויראלי כמוני RT-PCR נמוך משרד פנים רגישות גבוהה כניסת וירוס
Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klaus, J. P., Botten, J. Highly… More

Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter