Introduction
Arenaviren sind eine Familie von umhüllten, einzelsträngige RNA - Viren , die in erster Linie bei Nagern in der Natur 1-3 gehalten werden. Während diese Viren normalerweise asymptomatisch, persistierende Infektion in Nagetierreservoirs 1,2 etablieren, können sie schwere Krankheiten verursachen beim Menschen 3. Wichtige pathogene Arten gehören die Neue Welt Junin - Virus (JUNV) 4 und die Alte Welt Lassa - Virus 5, die die Erreger der argentinischen hämorrhagisches Fieber in Südamerika und Lassa - Fieber in Afrika sind, beziehungsweise. Lymphatische choriomeningitis Virus (LCMV), das prototypische Virus der Familie 6, hat eine weltweite Verbreitung und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Krankheitszuständen einschließlich aseptischer Meningitis bei immunkompetenten Personen 6, schwere Geburtsschäden in den sich entwickelnden Fötus 7 oder hohe Letalität bei immunsupprimierten Einzelpersonen folgende Festorgantransplantation 8,9. Der Mangel an USAFood and Drug Administration (FDA) -genehmigte Impfstoffe oder wirksame Virostatika diese Viren unterstreicht die kritische Notwendigkeit zur Bekämpfung neuer Strategien zur Entwicklung therapeutisch diese neuen / wieder auftretender Krankheitserreger zu zielen.
Die Arenavirus - Genom besteht aus zwei einzelsträngigen RNA - Segmente, die große (L) (~ 7,2 kb) und klein (S) (~ 3,6 kb) Segmente 10. Das S-Segment codiert, das virale Nukleoprotein (NP) und Hüll-Glycoprotein (GP) während der L-Segment die virale Polymerase (L) und Matrixprotein (Z) kodiert. Die L- und S - genomischen RNA - Segmente (vRNAs) in Virionen verpackt 10-12. Der erste Schritt der Arenavirus - Infektion ist Anlagerung von viralen Partikeln Zellen durch eine Wechselwirkung zwischen dem viralen GP und der entsprechenden Wirtszellrezeptoren für JUNV, die Host, den menschlichen Transferrin - Rezeptor 1 (hTfR1) 13,14 enthält. Nach Befestigung werden JUNV Partikel in die Zelle über Endozytose 15 Clathrin-vermittelte genommen.Partikel dann Verkehr zu den späten Endosomen , wo der niedrige pH - Wert dieses Fach die Aktivierung von GP 16,17 auslöst. Einmal aktiviert, die GP-kodierte Fusionspeptid Einsätze in die endosomale Membran, die Einleitung Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Erfolgreiche Fusion führt zur Freisetzung der Virionen verpackten vRNAs in das Zytoplasma, wo sie als Vorlagen für die genomischen Replikation und Transkription dienen. Wenn ausreichende Mengen an viralen Strukturproteine und vRNAs erzeugt werden, neue Teilchen zusammenstellen und Knospe aus der infizierten Zelle 18 , um den Lebenszyklus zu vollenden .
Um die Entdeckung neuer Strategien erleichtern, um therapeutisch die pathogenen Arenaviren Ziel hat sich unsere Gruppe auf die Identifizierung von Wirtsfaktoren konzentriert, die für die Virusvermehrung von entscheidender Bedeutung sind, aber entbehrlich für den Host. In diesem Zusammenhang die genaue Stadium der Definition (en) des Zyklus viralen Lebens durch solche Wirtsfaktoren gesteuert ist notwendig, die FührungEntwicklung von antivirale Strategien. Hier beschreiben wir eine quantitative (q) RT-PCR-basierten Assays , die verwendet werden können , Arenavirus-Zellanheftung zur Messung zur Identifizierung , ob ausgewählte Wirtsproteinen und / oder antivirale Moleküle beeinflussen diese Anfangsphase der Viruseintritt 19. Alternative Ansätze Arenavirus-Zell - Bindung zu messen , haben Virionen mit Biotin 20, fluoreszierende Farbstoffe 21, oder radioaktive Isotope 22 markiert gekennzeichnet. Nachteile dieser Verfahren kann das Erfordernis für große Mengen von Eingangs Virus (zB hohe Multiplizität der Infektion (MOI)) umfassen, die Verwendung von Radioaktivität, und / oder zusätzliche Handhabungsschritte Eingangs Virus (zB Konzentration und / oder die Kennzeichnung Virus) vorzubereiten . Insbesondere ermöglicht die Verwendung von hohen MOI es schwierig 15,23 produktiv im Vergleich zu unproduktiven Befestigung Ereignisse zu unterscheiden. Die qRT-PCR-basierte Test hier beschriebene Befestigungs Ereignisse mit so wenig wie 20 Plaque erkennen fürming Einheiten (PFU) des Virus, die für eine 48-Well-Platte in einer MOI von 0,0004 übersetzt. Daher überwindet die starke Empfindlichkeit des Tests die Forderung nach hoher MOI sowie alle Viren Kennzeichnung oder Konzentrationsschritte. Weiterhin kann die Assay sein i) Virion Endozytose sowie Freisetzung des Virusgenoms in das Cytoplasma nach Fusion und ii) angepasst für die Verwendung mit anderen Viren durch die Entwicklung von virusspezifischen qRT-PCR-Reagenzien (Beispiele zu messen angepasst, siehe 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hinweis: Es ist wichtig, dass das beschriebene Protokoll streng Prä-PCR - Technik durchgeführt werden (siehe 28 für einen guten Überblick darüber , wie ein Prä-PCR - Labor einzurichten und wie Experimente durchzuführen gute Pre-PCR - Technik verwendet wird ). Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Bereiten Sie Medien und Seed-Zellen in 48-Well-Platten
- Bereiten 500 ml komplettem Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure) Pufferlösung durch Zugabe von 50 ml Wärme inaktiviertes fötales Rinderserum und jeweils 5 ml eines 100x Penicillin-Streptomycin und 100x HEPES-Pufferlösung auf eine 500 ml Flasche DMEM. Dieses Reagenz kann bei 4 gelagert werden76; C für Monate.
- Seed 2,5 x 10 4 Vero E6 - Zellen pro Well in einer 48-Well - Gewebekulturplatte in einem Endvolumen von 500 ul vollständigem DMEM. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 10 bis 18 Stunden.
- Samen, die Platte am Ende des Arbeitstages. Testen Sie jede Virusprobe in entweder doppelte oder dreifache Brunnen.
Anmerkung: Während einer 48-well-basierte Plattform für diesen Test beschrieben wird, sollte es möglich sein, den Test nach unten zur Verwendung in 96- oder 384-Well-Platten zu skalieren.
- Samen, die Platte am Ende des Arbeitstages. Testen Sie jede Virusprobe in entweder doppelte oder dreifache Brunnen.
2. Führen Sie die Virus-Zell-Anlage
Hinweis: das Virus in diesem Protokoll verwendet, Candid JUNV Stamm # 1 (C # 1), wurde als lebende , abgeschwächte Impfstoff zur Prävention von Krankheits JUNV 29 erfolgreich eingesetzt. JUNV C # 1 wurde aus dem virulenten Stamm JUNV XJ durch serielle Passage abgeleitet sowohl in vivo und in vitro und unterscheidet sich von der Eltern XJ - Stamm von 12 Aminosäuren 30. because JUNV C 1 # a Biosicherheitsstufe (BSL) -2-rated Erreger ist, werden die Arbeiten für diesen Abschnitt beschrieben sind, müssen 31 geeignete BSL-2 Praktiken durchgeführt. Dies schließt die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (zB Augenschutz, Laborkittel, doppelte Handschuhe), eine Klasse II Biosicherheitswerkbank, und dafür zu sorgen , dass alle Mitarbeiter der institutionellen Ausbildung und Zulassungen erhalten haben , erforderlich , um sicher zu diesen Organismus behandeln.
- Verdünnen Sie die JUNV C # 1 Probe (n) auf die gewünschte PFU getestet werden oder konzentrieren sich bildende Einheiten in eiskaltem komplettem DMEM und lagern auf Eis, bis sie bereit zu jeder Vertiefung hinzuzufügen.
Anmerkung: Als Alternative können die Bindungsstudien mit Virus Durchführung in komplettem DMEM verdünnt, ein Minimalmedium PBS mit einer reduzierten Serumkonzentration (2%) und einem geeigneten Puffer enthält, verwenden, um festzustellen, ob Serum Interferenz mit Virusanheftung verursachen. Ähnliche Befestigungs Protokolle für alternative Viren haben die Verwendung von RPMI 1640-Medium ohne bicarbo berichtetnate 0,2% Rinderserumalbumin, 10 mM (2- (Morpholino) ethansulfonsäure) enthält, und 10 mM HEPES, pH 6,8 , 32. Diese Bindung Medien kann überlegen sein pH - Änderungen zu verhindern , die auftreten könnten , wenn Medien aus dem CO 2 -Umgebung des Inkubators entfernt wird.- Impfen Brunnen mit PFU von 200 bis 2000 reichen unproduktiven Befestigungs Ereignisse zu begrenzen. Wie in 2 gezeigt, ist dieser Assay zum Nachweis von Befestigungs Lage , so wenig wie 20 PFU (oder so viele wie 2 x 10 & sup6 ; PFU) verwendet wird .
- Erstellen Sie einen Master-Mix von Virus zur Impfung auf Zellen. Jede Virusprobe wird auf zwei Vertiefungen in einem Volumen von 50 & mgr; l pro Vertiefung beimpft werden. Deshalb, wenn die Zugabe von 2000 PFU des Virus pro Vertiefung gewünscht wird, verdünnen 4.800 PFU in einem Gesamtvolumen von 120 ul eiskaltem DMEM vervollständigen.
- Um zu steuern, für die Spezifität des Assays, verwenden Sie ein passendes Paar von Eizellen des chinesischen Hamsters Zelllinien, die entweder gar nicht ausdrücken TfR1 (TRVb) oder express hTfR1 (TRVb-1) als JUNV Bindung an diese Zellen entweder reduziert werden sollte oder nicht, bzw. 13,33. Alternativ behandeln Zellen mit einer Protease wie Proteinase K 35 Arenavirus Befestigung 34 oder Eintrag zu verhindern. Soluble hTfR1 oder monocolonal Antikörper ch128.1, die für hTfR1 spezifisch ist, auch in Betracht gezogen werden könnten , da sie bekannt sind 13,36 Eintritt von JUNV in Zellen zu blockieren. Zusätzlich Vorbehandlung von Zellen mit freiem Mannose 14 oder Inkubation von Partikeln mit JUNV spezifische neutralisierende Antikörper 37 kann das Eindringen von Viren hemmen.
- Bitte beachten Sie jedoch, dass diese letzteren Reagenzien und Ansätze, trotz JUNV Eintrag zu blockieren, nicht zu blockieren Befestigung bestätigt worden, obwohl dies eine wahrscheinliche Erklärung ist. Das hier beschriebene Protokoll könnte formal verwendet werden, ob diese verschiedenen Ansätze Auswirkungen Virion Befestigung bestimmen.
- Entfernen Platten aus dem 37 ° C Inkubator undentweder in einem 4 ° C Kühlschrank oder auf Eis für 15 min, um die Fähigkeit der plattierten Zellen zu hemmen Endocytose durchzuführen.
- Als nächstes wird die komplette DMEM aus jeder Vertiefung absaugen und jeder schnell gut waschen zweimal mit 100 ul eiskaltem PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) pH-Wert 7,4. Anschließend werden 50 & mgr; l der vorverdünnten Virusproben (hergestellt in Schritt 2.1) in die entsprechenden Vertiefungen.
- Wickeln Sie die Platte in der Plastikverpackung und sofort entweder wieder auf Eis oder in einem 4 ° C Kühlschrank für 1 bis 1,5 Stunden zu ermöglichen Virusanheftung auftreten. Halten Sie die Platte, Waschpuffer und Virusproben kalt bei 4 ° C in diesem Schritt.
- Nach dem Abschluss der C Inkubation 4 °, die Virusinokulum aspirieren und jede Vertiefung 3 mal mit 200 ul eiskaltem PBS waschen.
3. Viral RNA-Extraktion
- Reinige viraler RNA aus JUNV C # 1 - Partikeln zu den Monoschichten angebracht , indem der kommerziellen Kits (zB RNeasy Mini Kit) according dem Protokoll des Herstellers. Genauer gesagt, um die "Reinigung von Gesamt - RNA aus tierischen Zellen unter Verwendung von Spin - Technologie - Protokoll" auf den Seiten 23 bis 28 in der RNeasy Mini Handbuch (4. Auflage, April 2006) mit den Änderungen , die nachstehend aufgeführt sind .
- Lysieren die Zellen, wie in Schritt ausgerichtet 1B durch Zugabe von 350 & mgr; l Lyse-Puffer RLT direkt in jede Vertiefung. Mischen Sie den Puffer mehrmals Zell-Lyse zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Zellen leicht in diesem Puffer lysieren und vollständige Lyse kann durch Anzeigen Brunnen unter einem inversen Mikroskop überprüft werden.
- Übertragen Sie die resultierende Zelllysat zu dem Kit-Säule (Schritt 3a) und folgen Sie den Rest des Protokolls, wie beschrieben. An diesem Punkt hat sich das Virus durch den Lysepuffer neutralisiert worden, so dass die übrigen Schritte des Protokolls kann außerhalb der Klasse II Biosicherheit Schrank durchgeführt werden, sofern die kit Rohre nicht mit infektiösen Virus kontaminiert wurden.
- Fügen Sie den optionalen Schritt 9 aus dem Protokoll des Herstellers, der ein addit istional Zentrifugation der Spin-Säule eine mögliche Verschleppung von Buffer RPE zu beseitigen.
- Im letzten Schritt eluieren Protokoll des Herstellers (Schritt 10), um die gereinigte RNA von der Spin - Säule unter Verwendung von 30 & mgr; l Nuklease-freies ddH 2 O. Shop-RNA bei -80 ° C an dieser Stelle oder direkt in der qRT-PCR-Assays verwendet werden. Um den Abbau von gereinigten viralen RNA-Proben durch Nukleasen zu verhindern, Nuklease-freies Reagenzien und Geräte verwenden und aufgetauten RNA-Proben auf Eis halten.
Hinweis: Puffer RLT und RW1 Guanidinsalzlösung enthalten und nicht mit Bleichmittel gemischt werden sollte. Buffer RW1 Ethanol enthält.
4. qRT-PCR-Messung des viralen Genoms
- JUNV C # 1 S-Segment RNA in cDNA für die nachfolgende qPCR, unterziehen die virale RNA (erzeugt in Schritt 3.1.4) bis RT in einem Gesamtvolumen von 50 ul zu konvertieren.
- So stellen Sie die RT-Reaktion auf, erstellen Sie zuerst einen Master-Mix für jede der folgenden Reagenzien pro Reaktion enthält: 6,75 ul Nuklease-freie ddH 2 O, 5 & mgr; l einer 2 & mgr; M Lager des RT - Primers S 2098- bis 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), die mit dem NP - Region des S - Segment genomischer RNA komplementär ist, 5 ul 10X PCR - Puffer II, 11 ul einer 25 mM MgCl 2 -Lösung, 1,25 ul (62,5 Einheiten) RT - Enzym, 1 ul (0,4 Einheiten) RNase - Inhibitor und 10 ul einer 500 uM dNTPs Vorrat an.
Hinweis: Im Verlauf der Arenavirus-Replikation, 4 viralen S Segment RNA-Spezies erzeugt werden: ein in voller Länge genomische RNA (vRNA), ein in voller Länge antigenomische RNA (vcRNA) (dh das reverse Komplement des vRNA) und zwei subgenomischen mRNAs kodieren der NP und GP-Gene, respectively. Der RT-Primer aufgelistet ist spezifisch nur für die S-Segment vRNA, aber nicht die vcRNA, NP mRNA oder mRNA GP. - Vorsichtig mischen die RT-Master-Mix und dann Aliquotierung 40 ul in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen. Zugabe von 10 ul der viralen RNA zu jedem Röhrchen. Fügen i) eine keine Vorlage Steuerrohr (zB. 10 ul Nuklease-freiem ddH 2 O zu 40 ul des Master - Mix) und ii) eine ohne RT Enzymkontrolle (zB werden 10 & mgr; l eines bekannten positiven viralen RNA - Probe auf 40 & mgr; l , die Master hinzufügen Mix nicht erhalten haben jede RT-Enzym) für die Kontamination der RT-Reagenzien mit amplifizierten DNA enthält, die das virale Ziel-Sequenz zu screenen. Umfassen RNA aus nicht-infizierten Zellen mit dem vollständigen RT Mastermix extrahiert für den Assay Spezifitätskontrolle in Anwesenheit von zellulären RNA.
- Darüber hinaus sind eine bekannte positive virale RNA-Probe auf den vollen Master-Mix, die Qualität der RT-Reagenzien zu überprüfen. Beachten Sie, dass das Volumen der RT-Reaktion kann auf 25 & mgr; l reduziert werden, wenn notwendig.
- So stellen Sie die RT-Reaktion auf, erstellen Sie zuerst einen Master-Mix für jede der folgenden Reagenzien pro Reaktion enthält: 6,75 ul Nuklease-freie ddH 2 O, 5 & mgr; l einer 2 & mgr; M Lager des RT - Primers S 2098- bis 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), die mit dem NP - Region des S - Segment genomischer RNA komplementär ist, 5 ul 10X PCR - Puffer II, 11 ul einer 25 mM MgCl 2 -Lösung, 1,25 ul (62,5 Einheiten) RT - Enzym, 1 ul (0,4 Einheiten) RNase - Inhibitor und 10 ul einer 500 uM dNTPs Vorrat an.
- Gegenstand Die RT Rohre zu folgenden Zyklusbedingungen: 25 ° C für 10 min, 48 ° C für 30 min, und 95 ° C für 5 min. Beachten Sie, dass die Proben durch Zugabe einer 4 ° C Schritt an dieser Stelle oder über Nacht in den Thermocycler bei -20 ° C gelagert werden.
- Perform qPCR in einem Gesamtvolumen von 25 ul.
- Machen Sie einen Master-Mix qPCR durch die Kombination der folgenden: 2,5 ul (einer 9 uM Lager) von jedem der Vorwärts-PCR-Primer S1937 + bis 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') und Rückwärts-PCR-Primer S 2001- bis 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ul (eines 2 uM Lager) der qPCR Sonde S 1960+ bis 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') und 12,5 ul des 2X universal-qPCR Master mischen. Beachten Sie, dass die hier berichtet Vorwärts - Primer, die für JUNV C # 1 spezifisch ist, um 1 38 nt von der ursprünglich gemeldeten Primersequenz unterscheidet, die den virulenten Stamm JUNV Romero zum Ziel hat .
- Sie vorsichtig die Lösung mischen und dann 20 & mgr; l zu jeder Vertiefung qPCR hinzufügen. In 5 ul jeder RT-Reaktion auf die entsprechenden qPCR Brunnen. Führen Sie qPCR in dreifacher Ausfertigung für jede getestete Probe. Man beachte, dass das PCR-Reaktionsvolumen auf weniger als 12,5 & mgr; l reduziert werden kann, wenn nötig.
Hinweis: Die Software, die mitdie qPCR Maschine absolute Kopienzahl von # 1 S Segment genomischer RNA JUNV C erzeugen, indem sie den Wert jeder unbekannten Probe zu einer Reihe von Standardverdünnungen von Plasmid Vergleichen des JUNV C # 1 NP-Gen kodiert, welches das Ziel der qPCR Primer ist und Sonde eingestellt. Der qPCR-Assay kann nur Quantifizierung für Werte liefern, die im Bereich der Standardkurve fallen. Aus diesem Grund enthalten die folgenden Mengen an Plasmid (in dreifachen Vertiefungen): 5, 50, 5 x 10 3 5 x 10 5 und 5 x 10 7 Kopien pro Vertiefung.
- Laden Sie die qPCR Platte in den Thermocycler und führen Sie die folgenden Reaktionsbedingungen: 95 ° C für 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C für 15 Sekunden und 60 ° C für 1 min.
- Sammeln und Analysieren der Daten der Menge der viralen RNA in jeder Probe zu bestimmen, gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Um eine Standardkurve unter Verwendung einer neu gereinigt Probe von Plasmid herzustellen, die qPCR teerhaltigeerhalten Sequenz bestimmen zuerst die Plasmid-Kopienzahl in dieser Lösung.
- Berechnen, das Molekulargewicht des Plasmids. Wenn die Sequenz des gesamten Plasmid bekannt ist, berechnen diese nach der folgenden Formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303.2] - 61.13). Denken Sie daran, die Gesamtzahl von einem bestimmten Nukleotid an jeden Strang des doppelsträngigen Plasmids gefunden aufzunehmen.
- Wenn die Größe des Plasmids bekannt ist, aber seine genaue Sequenz nicht, berechnen die MW unter der Annahme, dass jede dsDNA Basenpaar mit einem MW von 600 hat.
Hinweis: Die pCAGGS-JUNV C # 1 NP - Plasmid verwendet , hier hat ein MW von 4,2 x 10 6. - Sobald das MW des Plasmid bestimmt worden ist, zu berechnen, wie viele Kopien pro ul vorhanden sind, in der Lager-Plasmid-Lösung.
- Zuerst berechnen die Gesamt ug Plasmid in der Lösung, dann ist dieses Plasmid zu Molen wandeln (zB wenn 69 ug Plasmid werden in 300 & mgr; l Wasser enthielt, dann 6,9 x 10 -5 g des Plasmids * 1 Mol / 4,2 x 10 & sup6 ; g des Plasmids = 1,6 x 10 -11 mol Plasmid), die Anzahl zu kopierüberführt werden können (beispielsweise 1,6 x 10 -11 mol Plasmid * 6,022 x 10 23 Moleküle / Mol = 9,8 x 10 12 Moleküle (oder Kopien)).
- Teilen Sie die Gesamt Kopien von Plasmid in der Plasmid - Lösung durch das Volumen dieser Lösung zu erhalten Kopien pro ul (zB 9,8 x 10 12 Kopien / 300 & mgr; l = 3,28 x 10 10 Kopien).
- Man verdünnt diese Lösung so ein, dass 5 ul-Volumina auf die PCR-Platte geladen werden kann, den Bereich der Kopienzahlen zu liefern, benötigt die Standardkurve zu etablieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um die Empfindlichkeit und Dynamikbereich des qPCR - Assay bekannt Mengen eines Plasmid , das das NP - Gen von JUNV C # 1 (Bereich 5-5 x 10 7 Kopien) zeigen , wurden auf qPCR unterzogen , wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben. Der Test ist empfindlich und zuverlässig so wenige wie 5 Kopien der Zielnukleinsäure (Figur 2) zu erkennen. Ferner ist der dynamische Bereich des Assays groß und kann wie in 2 gezeigt ist , mindestens 7 logs der Vorlage abzudecken. Während es nicht gezeigt wird , haben wir nicht weniger als 5 x 10 9 Kopien der nachzuweisenden Nukleinsäure.
Zur Veranschaulichung wurden die Nützlichkeit des Assays für die Messung der JUNV C # 1 Partikel Befestigungs, verschiedene Mengen an JUNV C # 1 bis Vero E6-Zellen vorgebunden, wie in dem Protokoll beschrieben. Nach Wegwaschen ungebundenen Partikel wurden die Zellen wurden zur RNA-Reinigung lysiert und die resultierenden RNA-Proben zu qRT unterworfen-PCR. Wie in 3 gezeigt, kann der Assay viral Befestigungs Ereignisse unter Verwendung von so wenig wie 20 oder so viele wie 2 x 10 6 PFU, detektieren , die jeweils an MOIs von 0,0004 und 40 übersetzt.
Wie in Figur 4 gezeigt, ist es möglich , das Protokoll zu modifizieren , viral Befestigung nicht nur zu messen, sondern auch die Rate der Amplifikation des Genoms in den ankommenden viralen Partikel über die Zeit enthalten. Diese modifizierte Vorgehensweise kann als Ersatz verwendet werden , um zu bestimmen , ob weitere Defekte in den verbleibenden Schritten des viralen Eintritts (zB Partikel Endocytose und / oder Verschmelzung und Freisetzung von viralen Genoms in das Cytoplasma) werden könnten auftreten. Interessanterweise scheint die Menge des viralen Genoms während der ersten 6 Stunden nach Bindung zu verringern, was darauf hindeutet, dass ein Teil des ankommenden viralen Genoms verschlechtert wird. Dies könnte zu einer Partikel passieren, die in die Zelle aufgenommen werden scheitern und verschlechtern in der extradere Raum oder vielleicht aufgrund einer Verschlechterung innerhalb des endolysosomale Netzwerk. Die gezeigten Daten zeigt, dass 12 oder 18 Stunden nach der Infektion optimale Zeiten wäre für aktive Genomreplikation zu screenen.
Abb . 1: Darstellung von Protokoll Workflow Die Hauptschritte des Virus-Zellanheftung Assay sind : 1) Inkubation von Viruspartikeln mit Zellen bei 4 ° C virus-Zellanheftung durch Wäschen auftreten gefolgt zuzulassen ungebundenen Virus zu entfernen, 2) Reinigung von viraler RNA aus den Zellen, 3) die reverse Transkription (RT) JUNV S Segment genomischer RNA (vRNA) in cDNA und 4) qPCR aufzuzählen Kopien JUNV S vRNA als Maß für die Virus-Zellanheftung. konvertieren bitte hier klicken eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. QPCR - Assay zum Nachweis von JUNV S Segment Genom ist empfindlich und kann über einen großen Dynamikbereich verwendet werden Der Primer-Sonde JUNV S Segment qPCR Satz auf seine Fähigkeit getestet wurde genau bekannt Größen zu messen (5, 16.6, 50, x 5 10 3, 5 x 10 5, oder 5 x 10 7 Kopien) eines DNA - Standard - Steuer Plasmid , das die Zielsequenz kodiert. Abgebildet die Verstärkungsstücke (A) und Standard - Kurvenanpassung Linien (B) sind. R 2, Korrelationskoeffizient von Primer-Sonden - Set. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: JUNV-Zellanheftung Test zuverlässig MaßnahmenPartikel Befestigung mit so wenig wie 20 PFU. Vero E6 - Zellen wurden mit bekannten Mengen JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3 2 x 10 4, 2 × 10 5 oder 2 vorgebunden x 10 & sup6 ; PFU) für 1,5 h bei 4 ° C. Ungebundene Partikel durch Waschen entfernt wurden, wurden die Zellen zur RNA-Extraktion lysiert, und die resultierenden RNA-Proben wurden auf qRT-PCR unterworfen JUNV C # 1 S Segment vRNA als Maß für die Partikel Befestigung an Vero E6-Zellen zu detektieren. Die Daten stellen die mittlere Kopienzahl pro Vertiefung von Dublikatmulden ± SEM.
Abb . 4: Kinetics of JUNV C # 1 Genomreplikation nach Infektion Vero E6 - Zellen wurden mit 2 x 10 3 PFU von JUNV C # 1 (MOI von 0,04) für 1,5 h bei 4 ° C inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in eiskaltem PBS wurden die Zellen entweder sofort geerntet (0 h Zeitpunkt)oder bis 37 ° C für die angegebenen Zeiten vor der Sammlung erwärmt. In jedem Fall wurde Gesamt-RNA aus Zellen extrahiert und einer qRT-PCR JUNV C # 1 S Segment vRNA zu detektieren. Die Werte sind als Mittelwert Kopien pro Vertiefung von zwei Vertiefungen ± SEM angegeben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Protokoll, das wir beschreiben, ist einfach und robust, sofern die folgenden kritischen Überlegungen beachtet werden. Zunächst strenge pre-PCR - Technik muss (siehe 28 für eine ausgezeichnete Bewertung) eingesetzt werden. Es ist zwingend notwendig, dass alle Reagenzien und Ausrüstung von amplifizierte DNA-frei sind die qPCR Zielsequenz und entsprechende Kontrollen an Ort und Stelle, die solche Kontamination zu erkennen. Zweitens, für das Virus-Zell-Befestigungsabschnitt des Protokolls, dem Virus, Zellen und Medien müssen bei 4 ° C aufbewahrt werden Endocytose von oberflächengebundenen Virionen zu verhindern. Drittens muss die Menge von Zellen zur RNA-Extraktion gesammelt nicht die RNA-Bindungskapazität des RNA Reinigungsfilter überschreiten. Viertens gereinigten viralen RNA-Proben müssen von Ribonuklease-vermittelten Abbau durch die Verwendung von Nuklease freien Reagenzien und Geräte geschützt werden und durch sie auf Eis zu halten, wenn aufgetaut. Fünftens enthalten der Bereich der Standardkurve in der qPCR Assay muss ausreichend groß sein,beobachtet alle Werte aus den unbekannten Proben zu erfassen. Sechstens sollte technische Replikate für sowohl des Assays sowie der qPCR einzelner RNA-Proben der Virus-Zell-Befestigungsteil aufgenommen werden. Siebtens Steuerungen (zB Zelllinien , die hTfR1 oder nicht exprimieren) können eingeschlossen werden , um die Spezifität des Assays zu steuern. Schließlich müssen alle die Ausbildung des Personals angemessen Biosicherheit haben und institutionelle Zulassung infektiöse JUNV C # 1 oder andere pathogene Arenaviren zu behandeln.
Der qPCR Teil des Protokolls erfordert eine qPCR Sonde vor allem die Spezifität des Produkts zu gewährleisten, während jeder Stufe der PCR-Reaktion amplifiziert werden. Die Kosten des Assays konnte verringert sich jedoch durch diese qPCR Sonde zugunsten einer anderen qPCR Chemie eliminiert werden, die keine Sonde erfordert (beispielsweise die Verwendung des asymmetrischen Farbstoff SYBR Green I 25) und / oder das Volumen des Reduktions qPCR Reaktionsgemisch verwendet. Wenn eine Sonde unabhängige qPCR AppRotaugen verwendet wird, wäre es, dass die Reaktionsbedingungen ausreichend stringent, um sicherzustellen, wichtig sein Spezifität der Primer qPCR sicherzustellen. Es ist auch wichtig zu wissen, dass Arenavirus RNA, ob aus Zellen oder Virionen extrahiert kann unspezifisch cDNA zu bilden , während der RT grundiert werden in Abwesenheit eines virusspezifischen RT - Primer 12. Daher Kopienzahlen erfasst eine vRNA-spezifischen RT Primer nicht streng von der RT-Primer gezielt nur die vRNA Spezies widerspiegeln. Wenn Spezifität für Genom oder Antigenom erforderlich ist, haben wir ein Mittel berichtet 12 diese unspezifischen Priming - Phänomen durch die Verwendung von biotinylierten Primern RT und Streptavidin - Kügelchen zu umgehen.
Eine wichtige Stärke dieses Tests ist die extreme Empfindlichkeit. Andere Arenavirus-Zellanheftung Assays mit radioaktiv markiertem 22, biotinyliert 20 oder fluoreszenzmarkierte Partikel 21 erforderlich sind MOIs von 0,2, 100, oder 1000, jeweilsly. Während die Verwendung von radioaktiv markierten Partikeln führt zu einer guten Empfindlichkeit, erfordert es die Verwendung von Radioaktivität, die die logistischen Aufwand und Sicherheitsbedenken im Zusammenhang mit diesem bestimmten Assay erhöht. Der qPCR-basierte hier beschriebene Verfahren erfordert so wenig wie 20 PFU (MOI von ~ 0,0004 in einer 48-Well - Platte) und Befestigung über einen großen Dynamikbereich von MOI zuverlässig erkennen kann (zB MOI von 0,0004 bis mindestens 40) (Abbildung 3 ). Die starke Sensitivität dieses Tests ermöglicht es, niedrige MOI für eine genauere Messung der produktiven Bindungsereignisse durch Standard-infektiösen Virus zu verwenden. Die hohe Empfindlichkeit reduziert auch signifikant die Virusmenge für den Assay benötigt und dabei begrenzt die zusätzlichen Handhabungsschritte, die die Qualität von Virionen beeinflussen können (zB auf Basis von Polyethylenglycol Fällung von Virionen in dem Test verwendet wird, die Kennzeichnung Virionen mit Fluorophore oder radioaktive Isotope und / oder Saccharose-Banding von VIRIOns). Darüber hinaus ist der qPCR Assay selbst einfach als auch sehr genau und reproduzierbar durchzuführen.
Die zellBefestigungs Assay beschrieben, kann modifiziert werden, um zusätzliche Stufen der viralen Eintritt einschließlich viralen Partikels Endozytose zu messen als auch den letzten Schritt der Virusfusion, die die Freisetzung des viralen Genoms in das Zytoplasma ist. Partikel Endozytose messen, würden die gleichen Schritte des Befestigungs Protokoll gefolgt werden durch Schritt 2.5, die Anlagerung von Teilchen an Zellen bei 4 ° C. Zellen würden dann erwärmt werden , um virale Partikel zu erlauben , durch Behandlung mit einer Protease Endozytose, gefolgt werden alle abzustreifen extern gebundenen Virionen , die nicht Endozytose wurden 22,24 beschrieben. Die Abschnitte 3 und 4 dieses Protokolls würde dann folgen viraler RNA zu extrahieren, und Kopien der viralen genomischen RNA als Maß für die Endozytose quantifizieren. Zur Messung der Genom uncoating nach Fusion von viralen und endosomalen Membranen, Zellen würden im Voraus gebunden mitVirus bei 4 ° C, erwärmt und gestrippt externer Teilchen (Endozytose und Fusion zu ermöglichen), und dann zur Analyse gesammelt. In einem Ansatz können Zellen in einem isotonischen Puffer lysiert werden , intrazelluläre Vesikel zu erhalten, und dann in zwei Fraktionen aufgeteilt: eine , die mit einem Cocktail von RNasen behandelt wird (ungestrichenen viralen RNA ist anfällig für Abbau) und die andere das wäre nicht 39 . Alternativ können Zellen in zytosolischen Fraktionen oder endosomalen 40 getrennt werden. In beiden Fällen würde qRT-PCR verwendet werden, um virale Genom in das Zytoplasma als Maß für virales Genom uncoating zu quantifizieren. Zuletzt kann die qRT-PCR - Test leicht zu studieren Virusanheftung modifiziert werden, Endozytose oder Fusion für andere Viren , die RT-PCR - Reagenzien zur Verfügung gestellt werden , um das neue Virus von Interesse zugeschnitten (Beispiele 24-27 zu sehen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce und Benjamin König für hilfreiche Diskussionen und die National Institutes of Health für die Unterstützung dieser Studien durch Zuschüsse T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) und P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
