Introduction
Arenavirus sono una famiglia di avvolgeva, virus a RNA a singolo filamento che si mantengono prevalentemente nei roditori in natura 1-3. Mentre questi virus in genere stabiliscono un asintomatica, infezione persistente in serbatoi roditori 1,2, possono causare gravi malattie negli esseri umani 3. Specie patogene importanti includono il virus Nuovo Mondo Junin (JUNV) 4 e il virus Vecchio Mondo Lassa 5, che sono gli agenti eziologici di febbre emorragica argentina in Sud America e febbre di Lassa in Africa, rispettivamente. Virus Coriomeningite linfocitaria (LCMV), il virus prototipo della famiglia 6, ha una distribuzione a livello mondiale ed è responsabile di una varietà di stati patologici tra cui la meningite asettica nei soggetti immunocompetenti 6, gravi difetti di nascita nel feto in via di sviluppo 7, o ad alta letalità in immunodepressi individui a seguito solido-trapianto di organi 8,9. La mancanza di Stati UnitiFood and Drug Administration (FDA) -approvato vaccini o farmaci antivirali efficaci per combattere questi virus mette in evidenza la necessità critica di sviluppare nuove strategie per indirizzare terapeuticamente questi patogeni emergenti / ri-emergente.
Il genoma Arenavirus si compone di due segmenti a singolo filamento di RNA, la grande (L) (~ 7,2 kb) e piccolo (S) (~ 3,6 kb) segmenti di 10. Il segmento S codifica la nucleoproteina virale (NP) e glicoproteina busta (GP) mentre il segmento L codifica la polimerasi virale (L) e la proteina della matrice (Z). La L e segmenti di RNA genomici S (vRNAs) sono confezionati in virioni 10-12. Il primo passo di infezione Arenavirus è l'attaccamento di particelle virali per ospitare cellule attraverso una interazione tra il GP virale e le sue corrispondenti recettori della cellula ospite, che, per JUNV, comprende il recettore umano transferrina 1 (hTfR1) 13,14. A seguito di attaccamento, le particelle JUNV sono presi nella cella via clatrina mediata endocitosi 15.Le particelle quindi il traffico al fine endosome dove il basso pH di questo comparto determinerà l'attivazione della GP 16,17. Una volta attivato, gli inserti peptide di fusione GP-codificato nella membrana endosomal, avviando la fusione tra le membrane virali e endosomali. risultati di fusione di successo nel rilascio delle vRNAs virione-confezionati nel citoplasma, dove servono come modelli per la replicazione e la trascrizione genomica. Quando vengono generati una quantità sufficiente di proteine strutturali virali e vRNAs, nuove particelle assemblare e gemma dalla cellula infettata per completare il ciclo di vita 18.
Per facilitare la scoperta di nuove strategie per indirizzare le terapeuticamente arenavirus patogeni, il nostro gruppo si è concentrata sull'identificazione di fattori dell'ospite che sono fondamentali per la propagazione del virus, ma indispensabili per l'host. In questo contesto, definendo la fase precisa (s) del ciclo di vita virale controllata da tali fattori dell'ospite è necessario guidare lasviluppo di strategie antivirali. Qui, descriviamo un (q) saggio RT-PCR-based che può essere utilizzato per misurare allegato Arenavirus cellule al fine di identificare se le proteine ospitanti selezionate e / o molecole antivirali influenzano questa fase iniziale di ingresso del virus 19. Approcci alternativi per misurare l'attaccamento Arenavirus cellule hanno caratterizzato virioni etichettati con biotina 20, coloranti fluorescenti 21, o isotopi radioattivi 22. Inconvenienti di questi metodi possono includere il requisito per grandi quantità di virus in ingresso (ad esempio elevati molteplicità di infezione (MOI)), l'uso di radioattività, e / o fasi di manipolazione aggiuntivi per preparare virus in ingresso (ad esempio, concentrazione e / o l'etichettatura del virus) . In particolare, l'uso di alta MOI rende difficile distinguere produttiva rispetto eventi di fissaggio non produttive 15,23. Il saggio qRT-PCR-based descritto qui in grado di rilevare gli eventi di attacco utilizzando come pochi come 20 placca perunità Ming (PFUs) di virus, che si traduce in un MOI di 0,0004 per un piatto 48 pozzetti. Pertanto, la forte sensibilità del saggio supera il requisito per alta MOI nonché eventuali operazioni di etichettatura virus o di concentrazione. Inoltre, il test può essere i) atto a misurare virione endocitosi, nonché rilascio di genoma del virus nel citoplasma in seguito alla fusione e ii) su misura per l'utilizzo con altri virus attraverso lo sviluppo di reagenti qRT-PCR virus-specifici (per esempio, vedere 24-27).
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Protocol
Nota: E 'fondamentale che il protocollo descritto essere effettuata con rigorosa tecnica di pre-PCR (vedi 28 per un'eccellente panoramica su come impostare un laboratorio di pre-PCR e come condurre esperimenti usando una buona tecnica pre-PCR). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. Una panoramica del protocollo è mostrato in Figura 1.
1. Preparare Media e cellule seme in 48 pozzetti
- Preparare 500 ml di completo Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-etano solfonico) soluzione tampone aggiungendo 50 ml del calore inattivato siero bovino fetale e 5 ml di una soluzione tampone 100x penicillina-streptomicina e 100x HEPES a una bottiglia da 500 ml di DMEM. Questo reagente può essere conservato a 476; C per mesi.
- Seme 2,5 x 10 4 cellule Vero E6 per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti in un volume finale di 500 ml di DMEM completo. Incubare la piastra a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2 per 10 a 18 ore.
- Seme il piatto alla fine della giornata lavorativa. Testare ogni campione di virus sia in due o tre esemplari pozzi.
Nota: Mentre una piattaforma 48 pozzetti basata per questo saggio è descritto, dovrebbe essere possibile per scalare il dosaggio per un uso in 96 o 384 pozzetti.
- Seme il piatto alla fine della giornata lavorativa. Testare ogni campione di virus sia in due o tre esemplari pozzi.
2. Carry Out Allegato virus-cellula
Nota: Il virus utilizzato in questo protocollo, ceppo JUNV Candid # 1 (C # 1), è stato usato con successo come un vaccino vivo attenuato per la prevenzione delle malattie JUNV 29. JUNV C # 1 è stato derivato dalla virulenta XJ ceppo JUNV attraverso il passaggio di serie sia in vivo che in vitro e si differenzia dal ceppo parentale XJ da 12 aminoacidi 30. because JUNV C # 1 è un livello di biosicurezza (BSL) patogeno -2-rated, il lavoro descritto per questa sezione deve essere effettuata con opportuni BSL-2 pratiche 31. Ciò include l'uso di dispositivi di protezione individuale (ad esempio la protezione degli occhi, camice da laboratorio, doppi guanti), un armadio biosicurezza di classe II, e garantire che tutto il personale hanno ricevuto la formazione istituzionale e le approvazioni necessarie per gestire in modo sicuro questo organismo.
- Diluire il JUNV C # 1 del campione (s) da testare al PFUs desiderato o concentrarsi unità formanti in ghiacciata completo DMEM e memorizzare sul ghiaccio fino al momento di aggiungere ad ogni bene.
Nota: In alternativa alla realizzazione degli studi di legame con il virus diluito in DMEM completo, utilizzare un terreno minimo contenente PBS con una concentrazione ridotta di siero (2%) e un tampone appropriato per stabilire se siero può causare interferenze con attacco virus. protocolli di attacco simili per i virus alternativi hanno segnalato l'uso di RPMI 1640 medium senza bicarbonate contenente 0,2% di albumina di siero bovino, 10 mM (2- (morfolino) acido etansolfonico) e 10 mM HEPES, pH 6.8 32. Questo supporto leganti possono essere superiori per evitare variazioni di pH che potrebbero verificarsi quando il supporto viene rimosso dal CO 2 -Ambiente dell'incubatore.- Seminare pozzi con PFUs che vanno da 200 a 2.000 per limitare eventi di attacco non produttive. Come mostrato in figura 2, questo test è in grado di rilevare allegato utilizzando il meno 20 PFU (o fino a 2 x 10 6 PFU).
- Creare un master mix di virus per l'inoculazione sulle cellule. Ogni campione virus sarà inoculata in pozzetti duplicati in un volume di 50 pl per pozzetto. Pertanto, se l'aggiunta di 2.000 PFUs di virus per pozzetto è desiderato, diluire 4.800 PFUs in un volume totale di 120 ml di ghiaccio freddo completare DMEM.
- Per controllare per la specificità del test, utilizzare una coppia di linee di cellule ovariche di criceto cinese che o non esprimono TfR1 (TRVB) o express hTfR1 (TRVB-1) come allegato JUNV a queste cellule dovrebbe o essere ridotto o no, rispettivamente, 13,33. In alternativa, il trattamento di cellule con una proteasi come proteinasi K per evitare attaccamento Arenavirus 34 o ingresso 35. Solubile hTfR1 o il ch128.1 anticorpi monoclonali, che è specifico per hTfR1, potrebbero essere considerati come sono conosciuti per bloccare l'ingresso di JUNV nelle cellule 13,36. Inoltre, pre-trattamento delle cellule con mannosio 14 o l'incubazione di particelle con anticorpi neutralizzanti specifici JUNV 37 in grado di inibire l'ingresso di virus.
- Si prega di notare, tuttavia, che questi ultimi reagenti e approcci, pur bloccando l'ingresso JUNV, non sono state confermate per bloccare l'attaccamento, anche se questa è una spiegazione probabile. Il protocollo qui descritto potrebbe essere utilizzato per determinare formalmente se queste vari approcci attaccamento impatto virione.
- Rimuovere le piastre dal 37 ° C incubatore eposizionare sia in frigorifero a 4 ° C o in ghiaccio per 15 min per inibire la capacità delle cellule piastrate ad effettuare endocitosi.
- Avanti, aspirare il DMEM completo di ogni bene e rapidamente lavare i pozzetti due volte con 100 ml di ghiaccio freddo PBS (tampone fosfato salino) pH 7.4. Quindi aggiungere 50 ml di campioni di virus pre-diluito (previste al punto 2.1) nei rispettivi pozzetti.
- Avvolgere il piatto in involucro di plastica e collocare immediatamente sia di nuovo sul ghiaccio o in un frigorifero C 4 ° per 1 a 1,5 ore per consentire attacco di virus che si verifichi. Mantenere la piastra, tampone di lavaggio, e campioni di virus freddo a 4 ° C nel corso di questo passo.
- Dopo il completamento del C incubazione 4 °, aspirare l'inoculo del virus e lavare i pozzetti 3 volte con 200 ml di PBS ghiacciato.
3. virale RNA Estrazione
- Purificare l'RNA virale da JUNV C # 1 particelle fissati ai monostrati utilizzando il kit commerciale (ad esempio, RNeasy Mini kit) According il protocollo del produttore. In particolare, seguire la "purificazione di RNA totale da cellule animali che utilizzano il protocollo tecnologia spin" alle pagine 23-28 del Mini Manuale RNeasy (4 ° edizione, aprile 2006), con le modifiche di seguito elencati.
- Lyse le cellule come indicato al punto 1B con l'aggiunta di 350 ml di tampone di lisi RLT direttamente a ciascun bene. Mescolare il tampone più volte per garantire lisi cellulare. Si noti che le cellule Lyse facilmente in questo buffer e completo lisi possono essere verificati visualizzando i pozzi sotto un microscopio invertito.
- Trasferire il lisato cellulare risultante al kit colonna (step 3a) e seguire il resto del protocollo come descritto. A questo punto, il virus è stato neutralizzato dal tampone di lisi per i passaggi rimanenti del protocollo può essere fatto all'esterno dell'armadio biosicurezza classe II purché i tubi kit non sono stati contaminati da virus infettivo.
- Includere il passo opzionale 9 dal protocollo del produttore, che è un additionale centrifugazione della colonna di selezione per eliminare ogni possibile riporto di Buffer RPE.
- Nella fase finale il protocollo del produttore (punto 10), eluire gli RNA purificato dalla colonna di spin con 30 ml di DDH priva di nucleasi 2 O. RNA Conservare a -80 ° C a questo punto o utilizzare direttamente nel saggio qRT-PCR. Per impedire il degrado del purificati campioni di RNA virale da nucleasi, utilizzare reagenti e attrezzature priva di nucleasi e conservare campioni di RNA scongelati in ghiaccio.
Nota: Buffer RLT e RW1 contengono sale della guanidina e non devono essere mescolati con candeggina. Buffer RW1 contiene etanolo.
4. qRT-PCR Misurazione del genoma virale
- Per convertire JUNV C # 1 RNA segmento S in cDNA per la successiva qPCR, sottoporre l'RNA virale (generato nel passaggio 3.1.4) per RT in un volume totale di 50 microlitri.
- Per impostare la reazione RT, prima creare una master mix contenente ciascuna delle seguenti reagenti per la reazione: 6,75 ml di nucleasi-free DDH 2 O, 5 ml di uno stock 2 mM della RT Primer S 2098- per 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), che è complementare alla regione NP del segmento S dell'RNA genomico, 5 ml di 10X tampone PCR II, 11 ml di una soluzione 2 25 mM MgCl, 1,25 ml (62,5 unità) di RT enzima, 1 ml (0,4 unità) di inibitore RNasi, e 10 ml di uno stock di dNTP 500 micron.
Nota: Durante il corso della replica Arenavirus, 4 specie segmento S RNA virale vengono generati: un full length RNA genomico (vRNA), una a figura intera RNA antigenomic (vcRNA) (che è il complemento inverso della vRNA), e due mRNA subgenomico codifica i geni NP e GP rispettivamente. Il primer RT elencati qui è specifico per solo il segmento S vRNA, ma non il vcRNA, NP mRNA o GP mRNA. - mescolare delicatamente il master mix RT e quindi un'aliquota di 40 ml in singoli tubi di 0,2 ml per PCR. Aggiungere 10 ml di RNA virale in ogni provetta. Includere i) un tubo nessun controllo del modello (ad esempio,. Aggiungere 10 ml di-nucleasi libera DDH 2 O a 40 microlitri della master mix) e ii) un controllo enzima NO RT (ad esempio, aggiungere 10 ml di un campione di RNA virale noto positivo per 40 ml di master mix che non hanno ricevuto qualsiasi enzima RT) per lo screening della contaminazione dei reagenti RT con DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio virale. Includi RNA estratto da cellule non infettate con il pieno master mix RT per il controllo per il saggio di specificità in presenza di RNA cellulare.
- Inoltre, su un campione di RNA virale noto positivo al master mix completo per verificare la qualità dei reagenti RT. Si noti che il volume della reazione RT può essere ridotto a 25 microlitri se necessario.
- Per impostare la reazione RT, prima creare una master mix contenente ciascuna delle seguenti reagenti per la reazione: 6,75 ml di nucleasi-free DDH 2 O, 5 ml di uno stock 2 mM della RT Primer S 2098- per 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), che è complementare alla regione NP del segmento S dell'RNA genomico, 5 ml di 10X tampone PCR II, 11 ml di una soluzione 2 25 mM MgCl, 1,25 ml (62,5 unità) di RT enzima, 1 ml (0,4 unità) di inibitore RNasi, e 10 ml di uno stock di dNTP 500 micron.
- Sottoporre i tubi RT alle seguenti condizioni di ciclo: 25 ° C per 10 min, 48 ° C per 30 minuti, e 95 ° C per 5 min. Si noti che i campioni possono essere conservati a -20 ° C a questo punto o lasciati notte nel termociclatore aggiungendo un passaggio 4 ° C.
- Perfo rm qPCR in un volume totale di 25 microlitri.
- Fare un master mix qPCR combinando il seguente: 2,5 ml (di un magazzino 9 micron) di ogni primer PCR in avanti S1937 + a 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') e reverse PCR Primer S 2001- per 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ml (di un magazzino 2 micron) della sonda qPCR S 1960+ al 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), e 12,5 ml di maestro 2X universale qPCR mescolare. Si noti che il primer in avanti riportato qui, che è specifico per JUNV C # 1, differisce di 1 nt dalla sequenza di innesco originariamente riportato 38, che si rivolge il virulento ceppo JUNV Romero.
- Mescolare delicatamente la soluzione e poi aggiungere 20 ml di ogni qPCR bene. Aggiungere 5 ml di ogni reazione RT ai pozzetti qPCR appropriate. Condurre qPCR in triplice copia per ogni campione testato. Si noti che il volume di reazione PCR può essere ridotto a non più di 12,5 microlitri se necessario.
Nota: il software associatola macchina qPCR genererà numero di copie assoluti di JUNV C # 1 segmento S dell'RNA genomico confrontando il valore di ciascun campione sconosciuto ad una serie di diluizioni standard di plasmide codificante il JUNV C # 1 NP gene, che è il bersaglio del primer qPCR e impostare la sonda. Il saggio qPCR può fornire soltanto la quantificazione di valori che rientrano nel range della curva standard. Per questo motivo, i seguenti quantitativi di plasmide (in triplice copia) pozzetti: 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 e 5 x 10 7 copie per pozzetto.
- Caricare la piastra di qPCR nel termociclatore ed eseguire le seguenti condizioni di reazione: 95 ° C per 10 min e 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min.
- Raccogliere e analizzare i dati per determinare la quantità di RNA virale presente in ciascun campione secondo il protocollo del produttore.
- Per stabilire una curva standard utilizzando un campione di recente purificato del plasmide contenente catrame qPCRottenere la sequenza, prima di determinare il numero di plasmide copia in questa soluzione.
- Calcolare il peso molecolare del plasmide. Se è nota la sequenza dell'intero plasmide, calcolare ciò utilizzando la seguente formula: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61.13). Ricordatevi di includere il numero totale di un particolare nucleotide trovato su ogni filo del plasmide a doppio filamento.
- Se la dimensione del plasmide è noto, ma la sua sequenza esatta non è, calcolare la MW sotto l'ipotesi che ciascuna coppia di base dsDNA ha un Mw di 600.
Nota: Il pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide usato qui ha un MW di 4,2 x 10 6. - Una volta che la MW del plasmide è stata determinata, calcolare il numero di copie per microlitri sono presenti nella soluzione madre plasmide.
- Prima calcolare il ug del plasmide totale nella soluzione, poi convertire questo per moli di plasmide (ad esempio se 69 ug del plasmide sono contenuti in 300 ml di acqua, quindi 6,9 x 10 -5 g di plasmide * 1 mole / 4,2 x 10 6 g di plasmide = 1,6 x 10 -11 moli di plasmide), che può essere convertita per copiare numero (ad esempio 1,6 x 10 -11 moli di plasmide * 6,022 x 10 23 molecole / mole = 9.8 x 10 12 molecole (o copie)).
- Dividere le copie totali del plasmide nella soluzione plasmide per il volume di tale soluzione per ottenere copie per ml (ad esempio 9,8 x 10 12 copie / 300 microlitri = 3,28 x 10 10 copie).
- Diluire questa soluzione in modo appropriato in modo che 5 volumi microlitri possono essere caricati sulla piastra PCR per fornire una gamma di numero di copie necessarie per stabilire la curva standard.
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Representative Results
Per dimostrare la sensibilità e la gamma dinamica del saggio qPCR, quantità note di un plasmide codificante il gene NP di JUNV C # 1 (range 5-5 x 10 7 copie) sono stati sottoposti a qPCR come descritto nella Sezione 4 del protocollo. Il test è sensibile e può attendibilmente rilevare come pochi come 5 copie di acido nucleico bersaglio (Figura 2). Inoltre, la gamma dinamica del saggio è grande e, come mostrato in figura 2, può coprire almeno 7 registri di template. Sebbene non mostrato, abbiamo rilevato fino a 5 x 10 9 copie di acido nucleico.
Per illustrare l'utilità del test per la misurazione della # 1 allegato particelle JUNV C, varie quantità di JUNV C # 1 sono stati prebound alle cellule Vero E6 come descritto nel protocollo. Dopo aver lavato via le particelle non legate, le cellule sono state lisate per la purificazione di RNA ed i campioni di RNA risultanti sono stati sottoposti a qRT-PCR. Come mostrato in figura 3, il saggio può rilevare eventi di attacco virale utilizzando il meno 20 o fino a 2 x 10 6 PFU, che si traduce in MOI rispettivamente 0,0004 e 40,.
Come mostrato in figura 4, è possibile modificare il protocollo per misurare non solo attacco virale, ma anche il tasso di amplificazione del genoma contenuta nelle particelle virali in arrivo nel tempo. Questo approccio modificato può essere utilizzato come un surrogato per determinare se ulteriori difetti nelle restanti fasi di ingresso virale (endocitosi esempio particelle e / o fusione e rilascio di genoma virale nel citoplasma) potrebbero essere presenti. È interessante notare che la quantità di genoma virale sembra diminuire durante il primo allegato 6 ore dopo, il che suggerisce che una porzione del genoma virale in ingresso è degradata. Ciò può accadere a particelle che non riescono ad essere preso nella cella e degradano nel extracellularespazio colare o forse a causa del degrado all'interno della rete endolysosomal. I dati riportati dimostrano che il 12 o 18 ore dopo l'infezione sarebbe tempi ottimali per lo screening per la replica del genoma attiva.
Figura 1:. Rappresentazione del flusso di lavoro protocollo Le fasi principali del saggio attacco virus-cellula sono 1) incubazione di particelle del virus con le cellule a 4 ° C per consentire l'attaccamento virus-cellula a verificarsi seguita da lavaggi per rimuovere il virus non legato, 2) la purificazione di RNA virale dalle cellule, 3) trascrizione inversa (RT) per convertire JUNV S segmento di RNA genomico (vRNA) in cDNA, e 4) qPCR per enumerare le copie del JUNV S vRNA come misura di attaccamento virus-cellula. cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Dosaggio qPCR per la rilevazione di JUNV S genoma segmento è sensibile e può essere utilizzato su una vasta gamma dinamica Il set di primer-sonda JUNV S segmento qPCR è stato testato per la sua capacità di misurare accuratamente quantità note (5, 16.6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, o 5 x 10 7 copie) di un plasmide di controllo standard di DNA che codifica per la sequenza bersaglio. Raffigurati sono i grafici di amplificazione (A) e linee curve in forma standard (B). R 2, coefficiente di correlazione di set di primer-sonda. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: saggio attaccamento JUNV celle affidabile misurefissaggio delle particelle utilizzando il minor numero di 20. Le cellule Vero E6 PFU sono stati prebound con quantità note di JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, o 2 x 10 6 PFU) per 1,5 ore a 4 ° C. particelle non legate sono state rimosse mediante lavaggio, le cellule sono state lisate per l'estrazione di RNA, ed i campioni di RNA risultanti sono stati sottoposti a qRT-PCR per rilevare JUNV C # 1 segmento S vRNA come misura di attaccamento particella cellule Vero E6. I dati rappresentano il numero di copie media per pozzetto da pozzetti in doppio ± SEM.
Figura 4:. Cinetica di JUNV C # 1 replicazione del genoma seguenti infezione cellule Vero E6 sono state incubate con 2 x 10 3 PFU di JUNV C # 1 (MOI di 0,04) per 1,5 ore a 4 ° C. Dopo diversi lavaggi in PBS ghiacciato, le cellule sono state raccolte sia immediatamente (0 HR punto di tempo)o riscaldato a 37 ° C per i tempi indicati prima collezione. In ogni caso, l'RNA totale è stato estratto dalle cellule e sottoposto a qRT-PCR per rilevare JUNV C # 1 segmento S vRNA. I valori sono elencati copie medi per bene dai pozzetti in doppio ± SEM.
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Discussion
Il protocollo che descriviamo è semplice e robusta, purché siano rispettate le seguenti considerazioni critiche. In primo luogo, rigorosa tecnica di pre-PCR deve essere impiegato (si veda il 28 per un'eccellente recensione). E 'indispensabile che tutti i reagenti e le attrezzature sono privi di DNA amplificato contenente la sequenza bersaglio qPCR e che i controlli appropriati sono in atto per rilevare tale contaminazione. In secondo luogo, per la parte di attacco virus-cellula del protocollo, il virus, cellule, e dei media devono essere conservati a 4 ° C per prevenire endocitosi di virioni superficie-bound. In terzo luogo, la quantità di cellule raccolte per l'estrazione di RNA non deve superare la capacità di legame dell'RNA del filtro di purificazione dell'RNA. In quarto luogo, purificati campioni di RNA virale devono essere protetti dalla degradazione ribonucleasi mediata attraverso l'uso di reagenti e attrezzature priva di nucleasi e il loro mantenimento sul ghiaccio quando scongelati. In quinto luogo, la gamma della curva standard incluso nel test qPCR deve essere sufficientemente grandeper catturare tutti i valori osservati dai campioni sconosciuti. Sesto, repliche tecniche dovrebbero essere inclusi sia la porzione di attacco virus-cellula del test, nonché la qPCR di singoli campioni di RNA. Settimo, controlli (ad esempio linee cellulari che esprimono hTfR1 o meno) possono essere inclusi per il controllo per la specificità del test. Infine, tutto il personale deve avere un'adeguata formazione biosicurezza e l'approvazione istituzionale per gestire JUNV infettiva C # 1 o di altri arenavirus patogeni.
La porzione qPCR del protocollo prevede una sonda qPCR principalmente per garantire la specificità del prodotto amplificato durante ogni fase della reazione PCR. Il costo del dosaggio può essere ridotto, tuttavia, eliminando questa sonda qPCR a favore di un'altra chimica qPCR che non richiede una sonda (ad esempio l'impiego del colorante asimmetrica SYBR Green I 25) e / o riducendo il volume della miscela di reazione qPCR utilizzato. Se una sonda indipendente qPCR appscarafaggio viene utilizzato, sarebbe importante verificare che le condizioni di reazione sono sufficientemente rigorose per garantire la specificità dei primer qPCR. E 'anche importante essere consapevoli che l'RNA Arenavirus, sia estratto da cellule o virioni, può essere aspecifico innescato per formare cDNA durante la RT in assenza di un virus specifica RT Primer 12. Pertanto, copiare i numeri rilevati utilizzando un vRNA specifico fondo RT non riflettono rigorosamente solo le specie vRNA mirati da parte del fondo RT. Se specificità per genoma o antigenome è richiesto, ci hanno segnalato un mezzo per aggirare questo fenomeno di adescamento non specifico attraverso l'uso di primer biotinilati RT e perline streptavidina 12.
Una forza importante di questo saggio è la sua estrema sensibilità. Altri saggi di attacco Arenavirus celle dotate radioattivamente marcato 22, biotinilati 20 o fluorescenza marcata 21 particelle hanno richiesto MOI di 0.2, 100, o 1000, rispettivamentely. Mentre l'uso di particelle risultati radioattivamente marcato con una buona sensibilità, si richiede l'uso di radioattività, che aumenta le preoccupazioni logistiche complessità e sicurezza collegate con tale particolare dosaggio. Il metodo qPCR basato qui descritto richiede un minimo di 20 PFU (MOI di ~ 0.0004 in una piastra a 48 pozzetti) e può attendibilmente rilevare allegato in un ampio intervallo dinamico di MOI (es MOI da 0,0004 ad almeno 40) (Figura 3 ). La forte sensibilità di questo saggio rende possibile utilizzare partire MOI per una misurazione più accurata produttivi eventi di legame di virus infettivo standard. L'elevata sensibilità riduce significativamente la quantità di virus necessaria per l'analisi e, così facendo, limita le fasi di manipolazione aggiuntivi che possono influire sulla qualità di virioni utilizzati nel saggio (ad esempio polietilene precipitazione base di glicole di virioni, etichettatura virioni con fluorofori o isotopi radioattivi e / o di saccarosio-banding di Virions). Inoltre, il saggio qPCR stesso è semplice da eseguire così come estremamente preciso e riproducibile.
Il test cellulare allegato descritta può essere modificata per misurare ulteriori fasi di ingresso del virus compreso endocitosi particella virale così come fase finale della fusione virus, che è liberazione di genoma virale nel citoplasma. Per misurare endocitosi particelle, le stesse fasi del protocollo allegato sarebbero seguiti fino al passo 2.5, che è allegato di particelle alle celle a 4 ° C. Le cellule venivano poi riscaldati per consentire particelle virali da endocitosi, seguita da trattamento con una proteasi a nudo eventuali virioni esternamente vincolato che non sono stati endocitosi come descritto 22,24. Le sezioni 3 e 4 del presente protocollo sarebbero poi seguiti per estrarre l'RNA virale e quantificare le copie di RNA virale genomico come misura di endocitosi. Per misurare genoma uncoating dopo la fusione delle membrane virali e endosomali, le cellule sarebbero prebound convirus a 4 ° C, riscaldato (per consentire endocitosi e fusione) e spogliato delle particelle esterne, e poi raccolto per l'analisi. In un approccio, le cellule possono essere lisate in un tampone isotonico di preservare vescicole intracellulari e quindi suddiviso in 2 frazioni: una che verrebbe trattata con un cocktail di RNasi (non rivestito RNA virale è suscettibile di degradazione) e l'altra che no 39 . In alternativa, le cellule possono essere separati in citosoliche o endosomali frazioni 40. In entrambi i casi, qRT-PCR sarebbe utilizzato per quantificare genoma virale nel citoplasma come misura virale uncoating genoma. Ultimo, il saggio qRT-PCR può essere facilmente modificato per studiare attacco di virus, endocitosi, o fusione per altri virus forniti i reagenti di RT-PCR sono su misura per il nuovo virus di interesse (per esempio vedere 24-27).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, e Benjamin Re per utili discussioni e il National Institutes of Health per il supporto di questi studi, attraverso borse di studio T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), e P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
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