Introduction
Arenaviruses er en familie av kappe, enkelt-trådet RNA-virus som opprettholdes hovedsakelig i gnagere i naturen 1-3. Mens disse virusene vanligvis etablere en asymptomatisk, vedvarende infeksjon i gnagere reservoarer 1,2, kan de forårsake alvorlig sykdom hos mennesker 3. Viktige patogene artene omfatter den nye verden Junin virus (JUNV) 4 og den gamle verden Lassa virus 5, som er de etiologiske av argentinske hemoragisk feber i Sør-Amerika og Lassa feber i Afrika, henholdsvis. Lymfatisk choriomeningittvirus (LCMV), det prototypiske virus av familien 6, har en verdensomspennende distribusjon, og er ansvarlig for en rekke sykdomstilstander inkludert aseptisk meningitt hos immunkompetente individer 6, alvorlige misdannelser hos fosteret 7, eller høy dødelighet hos immunsupprimerte individer følgende solid organtransplantasjon 8,9. Mangelen på USAFood and Drug Administration (FDA) -godkjent vaksiner eller effektive antivirale å bekjempe disse virusene streker kritisk behov for å utvikle nye strategier for å terapeutisk målrette disse nye / re-fremvoksende patogener.
Den arenavirus-genomet består av to enkelt-trådede RNA-segmenter, den store (L) (~ 7,2 kb) og små (S) (~ 3,6 kb) segmenter 10. S-segment koder for det virale nukleoprotein (NP) og kappe-glykoproteinet (GP), mens L-segment koder for det virale polymerase (L) og matriseprotein (Z). L og S genomiske RNA segmenter (vRNAs) er pakket inn i viruspartikler 10-12. Det første trinnet av arenavirus infeksjon er festet av viruspartikler vertsceller gjennom et samspill mellom viral GP, og tilsvarende vertscellereseptorer som for JUNV, omfatter den menneskelige transferrin reseptor 1 (hTfR1) 13,14. Etter vedlegg, er JUNV partikler tatt inn i cellen via clathrin endocytose 15.Partikler da trafikk til slutten endosomet hvor lav pH i dette kammeret utløser aktiveringen av GP 16,17. Når aktivert, GP-kodet fusjon peptid innsatser inn i endosomal membranen, initiere fusjon mellom de virale og endosomal membraner. Vellykket fusjon resulterer i utslipp av virion-pakket vRNAs inn i cytoplasma, der de tjener som maler for genomisk replikasjon og transkripsjon. Når tilstrekkelige mengder av virale strukturelle proteiner og vRNAs er generert, nye partikler samle bud og fra den infiserte celle for å fullføre livssyklus 18.
For å lette oppdagelsen av nye strategier for å terapeutisk målrette patogene arenaviruses, har vår gruppe fokusert på identifisering av vertsfaktorer som er kritiske for virus forplantning, men unnværlig for verten. I denne sammenheng, å definere den nøyaktige trinn (e) av den virale livssyklus styrt ved hjelp av slike vertsfaktorer er nødvendig for å ledeutvikling av antivirale strategier. Heri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-basert assay som kan brukes til å måle arenavirus-cellefesting med det formål å identifisere om utvalgte vertsproteiner og / eller antiviral-molekyler påvirke denne innledende fasen av viral inngang 19. Alternative metoder for å måle arenavirus-cellebinding har omtalt virions merket med biotin 20, fluorescerende fargestoffer 21, eller radioaktive isotoper 22. Ulemper til disse metodene kan omfatte behovet for store mengder av inngangsvirus (f.eks høye multiplisiteter av infeksjon (MOI)), bruk av radioaktiviteten, og / eller ytterligere håndteringstrinn for å klarinngangen virus (f.eks konsentrasjon og / eller etikettering av virus) . Spesielt bruk av høy MOI gjør det vanskelig å skille produktiv versus nonproductive feste hendelser 15,23. Den QRT-PCR-basert analysen beskrevet her kan oppdage feste hendelser ved hjelp av så få som 20 plakett forming enheter (PFUs) av virus, noe som tilsvarer en MOI på 0,0004 for en 48-brønns plate. Derfor overvinner den sterke følsomheten til analysen kravet om høy MOI samt eventuelle virus merking eller konsentrasjonstrinn. Videre kan analysen være i) innrettet til å måle virion endocytose, så vel som frigjøring av virus-genomet inn i cytoplasma etter fusjon og ii) tilpasset for bruk sammen med andre virus gjennom utviklingen av virus-spesifikke QRT-PCR-reagenser (for eksempel, se 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Det er viktig at den beskrevne protokollen utføres ved hjelp av strenge pre-PCR-teknikk (se 28 for en god oversikt om hvordan du setter opp en pre-PCR laboratorium og hvordan gjennomføre eksperimenter ved hjelp av god pre-PCR teknikk). Det er viktig at alle reagenser og utstyr er gratis amplifisert DNA inneholder qPCR målsekvensen og at nødvendige kontroller er på plass for å avdekke slik forurensning. En oversikt av protokollen er vist i figur 1.
1. Forbered Media og Seed celler i 48-brønners plater
- Fremstille 500 ml komplett Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin, og 1% HEPES (N-2-hydroksyetylpiperazin-N-2-etansulfonsyre) buffer-oppløsning ved tilsetning av 50 ml av varme-inaktivert føtalt bovint serum og 5 ml hver av en 100x Penicillin-streptomycin og 100x HEPES-buffer-løsning til en 500 ml flaske med DMEM. Dette reagenset kan bli lagret ved 476 C i flere måneder.
- Frø 2,5 x 10 4 Vero E6 celler per brønn i en 48-brønners vevskulturplate i et sluttvolum på 500 pl med fullstendig DMEM. Inkuber platen ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO 2 i 10 til 18 timer.
- Seed platen på slutten av arbeidsdagen. Test hver virusprøve i enten duplisere eller tredoble brønner.
Merk: Når en 48-brønners-basert plattform for denne analysen er beskrevet, bør det være mulig å skalere ned analysen for bruk i 96- eller 384-brønners plater.
- Seed platen på slutten av arbeidsdagen. Test hver virusprøve i enten duplisere eller tredoble brønner.
2. Carry Out Virus-celle vedlegg
Merk: Viruset som brukes i denne protokollen, JUNV belastning Candid # 1 (C # 1), har blitt brukt som en levende svekket vaksine for forebygging av JUNV sykdom 29. JUNV C # 1 ble utledet fra den virulente stamme JUNV XJ gjennom seriell passasje både in vivo og in vitro, og er forskjellig fra den parentale stammen XJ av 12 aminosyrer 30. because JUNV C # 1 er et biosikkerhetsnivå (BSL) -2-karakter patogen, må det arbeidet som er beskrevet for denne seksjonen utføres ved hjelp av egnede BSL-2 praksis 31. Dette inkluderer bruk av personlig verneutstyr (f.eks vernebriller, laboratoriefrakk, doble hansker), en klasse II biosikkerhet skap, og sørge for at alt personell har fått den institusjonelle opplæring og godkjenninger som kreves for å trygt håndtere denne organismen.
- Fortynn JUNV C # en sample (s) som skal testes til det ønskede PFUs eller fokusere dannende enheter i iskaldt komplett DMEM og lagre på is inntil klar til å legge til hver brønn.
Merk: Som et alternativ til å drive de bindingsstudier med virus fortynnet i fullstendig DMEM, bruker et minimalt medium inneholdende PBS med en redusert serumkonsentrasjon (2%) og en passende buffer for å fastslå hvorvidt serum kan forårsake interferens med virus vedlegg. Liknende feste protokoller for alternative virus er rapportert ved bruk av RPMI 1640 medium uten bicarbonate inneholdende 0,2% bovint serumalbumin, 10 mM (2- (morfolino) etansulfonsyre), og 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Dette bindingsmateriale kan være overlegne i forhold til å forhindre pH-endringer som kan oppstå når mediet blir fjernet fra den CO 2 -miljø av inkubatoren.- Vaksinere brønner med PFUs som strekker seg fra 200 til 2000 for å begrense nonproductive feste hendelser. Som vist i figur 2, er denne analysen stand til å påvise ved hjelp av feste så få som 20 PFU (eller så mange som 2 x 10 6 PFU).
- Lag en mester blanding av virus for vaksinasjon mot celler. Hver virusprøve vil bli inokulert på duplikate brønner i et volum på 50 ul per brønn. Derfor, hvis tilsetningen av 2000 PFUs av virus per brønn er ønskelig, fortynne 4,800 PFUs inn i et totalvolum på 120 pl iskald full DMEM.
- For å kontrollere for spesifisiteten av analysen, bruk en matchet par av kinesisk hamster ovarie cellelinjer som enten ikke uttrykke TfR1 (TRVb) eller exprykk hTfR1 (TRVb-1) som JUNV vedlegg til disse cellene skal enten reduseres eller ikke, henholdsvis 13,33. Alternativt kan du unne celler med en protease som proteinase K for å hindre arenavirus vedlegg 34 eller oppføring 35. Løselig hTfR1 eller monocolonal antistoffet ch128.1, som er spesifikk for hTfR1, kan også anses som de er kjent for å blokkere inntrengning av JUNV i celler 13,36. I tillegg kan forbehandling av cellene med gratis mannose 14 eller inkubasjon av partikler med JUNV spesifikke nøytraliserende antistoffer 37 hemme virus oppføring.
- Vær imidlertid oppmerksom på at disse siste reagenser og tilnærminger, til tross for å blokkere JUNV oppføring, ikke har blitt bekreftet å blokkere vedlegg, selv om dette er en sannsynlig forklaring. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å formelt avgjøre om disse ulike tilnærminger innvirkning virus vedlegg.
- Fjern platene fra 37 ° C inkubator ogplassere enten i et 4 ° C kjøleskap eller på is i 15 minutter for å hemme evnen av de pletterte celler til å utføre endocytose.
- Deretter aspireres fullstendig DMEM fra hver brønn og hurtig vaske hver brønn to ganger ved anvendelse av 100 ul iskald PBS (fosfatbufret saltvann), pH 7,4. Deretter legger 50 mL av de pre-utvannet virusprøver (utarbeidet i trinn 2.1) til de aktuelle brønnene.
- Pakk platen i plastfolie og umiddelbart plassere enten tilbake på is eller i en 4 ° C kjøleskapet i 1 til 1,5 time for å la virus vedlegg til forekomme. Hold plate, vaskebuffer, og virusprøver kulde ved 4 ° C i hele dette trinnet.
- Etter gjennomføring av den 4 ° C inkubering aspireres viruspodestoff og vask hver brønn 3 ganger med 200 ul iskald PBS.
3. Viral RNA Utvinning
- Rens viral RNA fra JUNV C # 1 partikler festet til monolagene ved hjelp av kommersielle kit (f.eks RNeasy Mini kit) According til produsentens protokoll. Nærmere bestemt, følg "rensing av total RNA fra dyreceller ved hjelp av spin-teknologi protokoll" på sidene 23-28 i RNeasy Mini Handbook (4. utgave, april 2006) med de endringer som er oppført nedenfor.
- Lysere cellene som er beskrevet i trinn 1B ved tilsetning av 350 ul lyseringsbuffer RLT direkte til hver brønn. Bland buffer flere ganger for å sikre cellelyse. Legg merke til at cellene lett lyserer i denne bufferen og fullstendig lysering kan bekreftes ved å vise brønner i henhold til et invertert mikroskop.
- Overfør den resulterende cellelysat til settet kolonnen (trinn 3a) og følger resten av den protokoll som er beskrevet. På dette punkt har viruset blitt nøytralisert med lysis buffer slik at de gjenværende trinnene i protokollen kan gjøres utsiden av klasse II biosikkerhet skap tilgjengelig i settet rørene ble ikke forurenset med infeksiøst virus.
- Inkluder valgfritt trinn 9 fra produsentens protokollen, som er en additional sentrifugering av spinnkolonne for å eliminere enhver mulig overføring av Buffer RPE.
- I det siste trinnet produsentens protokoll (trinn 10), eluere det rensede RNA fra spinnkolonne ved å bruke 30 ul av nuklease-fri DDH 2 O. Lagres RNA ved -80 ° C på dette tidspunkt, eller bruk direkte i QRT-PCR-analyse. For å hindre nedbrytning av rensede virale RNA prøver av nukleaser, bruker nukleasefritt reagenser og utstyr og holde tinte RNA prøver på is.
Merk: Buffere RLT og RW1 inneholde guanidinsalt og bør ikke blandes med blekemiddel. Buffer RW1 inneholder etanol.
4. QRT-PCR Måling av Viral Genome
- For å konvertere JUNV C # 1 S segment RNA til cDNA for etterfølgende qPCR, underkaste det virale RNA (generert i trinn 3.1.4) til romtemperatur i et totalt volum på 50 ul.
- For å sette opp RT reaksjon, må du først opprette en mester blanding som inneholder hver av de følgende reagenser per reaksjon: 6,75 mL av nuklease-fri DDH 2 O, 5 ul av en 2 mM lager av RT-primeren S 2098- 2075- til (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), som er komplementær til den NP-regionen til S-segmentet genomisk RNA, 5 ul 10X PCR-buffer II, 11 ul av en 25 mM MgCl2-løsning, 1,25 mL (62,5 enheter) fra RT-enzymet, 1 pl (0,4 enheter) av RNase-inhibitor, og 10 ul av en 500 uM lager av dNTP.
Merk: I løpet av arenavirus replikasjon, er 4 virale S segment RNA arter generert: en full lengde genomisk RNA (vRNA), en full lengde antigenomisk RNA (vcRNA) (som er den omvendte komplement av den vRNA), og to subgenomiske mRNA som koder for NP og GP-gener, respektivt. RT-primer som er oppført her er spesifikk for bare den S-segmentet vRNA, men ikke den vcRNA, NP mRNA, eller GP-mRNA. - Bland forsiktig RT mester mix og deretter delmengde 40 ul i individuelle 0,2 ml PCR rør. Tilsett 10 mL av viralt RNA til hvert rør. Ta i) en ingen mal styrerør (f.eks. Legge til 10 mL av nukleasefritt DDH 2 O til 40 mL av master mix) og ii) en no RT enzym kontroll (for eksempel legge til 10 mL av en kjent-positiv viral RNA prøve til 40 ul mester miks som ikke mottar en hvilken som helst RT enzym) for å screene for forurensning av RT-reagenser med amplifisert DNA inneholdende det virale target-sekvensen. Omfatte RNA ekstrahert fra infiserte celler med den fulle RT Master Mix å kontrollere for spesifisitet av bestemmelsen i nærvær av cellulært RNA.
- I tillegg, omfatter en kjent-positiv viral RNA prøven til full master blandingen for å kontrollere kvaliteten av RT-reagenser. Legg merke til at volumet av RT-reaksjonen kan reduseres til 25 ul om nødvendig.
- For å sette opp RT reaksjon, må du først opprette en mester blanding som inneholder hver av de følgende reagenser per reaksjon: 6,75 mL av nuklease-fri DDH 2 O, 5 ul av en 2 mM lager av RT-primeren S 2098- 2075- til (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), som er komplementær til den NP-regionen til S-segmentet genomisk RNA, 5 ul 10X PCR-buffer II, 11 ul av en 25 mM MgCl2-løsning, 1,25 mL (62,5 enheter) fra RT-enzymet, 1 pl (0,4 enheter) av RNase-inhibitor, og 10 ul av en 500 uM lager av dNTP.
- Underkaste RT rørene til følgende sykkel betingelser: 25 ° C i 10 min, 48 ° C i 30 min, og 95 ° C i 5 min. Legg merke til at prøver kan bli lagret ved -20 ° C, ved dette punkt, eller stå over natten i thermocycler ved tilsetning av et 4 ° C trinn.
- Perform qPCR i et totalt volum på 25 pl.
- Foreta en qPCR konsentrat-blanding ved å kombinere følgende: 2,5 ul (fra et 9 pM lager) for hver forover PCR-primeren S1937 + til 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') og revers PCR primer S 2001- til 1982 (fem '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 ul (fra en 2 mM lager) av qPCR sonden S 1960+ 1975+ til (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), og 12,5 ul av 2X universell qPCR hoved blande. Vær oppmerksom på at frem primer rapportert her, som er spesifikk for JUNV C # 1, er forskjellig fra en nt fra opprinnelig rapporterte primer sekvens 38, som retter seg mot den smittsomme JUNV belastning Romero.
- Bland forsiktig løsningen og deretter legge til 20 ul til hver qPCR brønnen. Tilsett 5 ul av hver RT-reaksjon til de passende brønnene qPCR. Gjennomføre qPCR i triplikat for hver prøve testet. Legg merke til at PCR-reaksjonsvolumet kan reduseres til så lite som 12,5 ul hvis nødvendig.
Merk: Programvaren i forbindelse medqPCR maskinen vil generere absolutte kopiantall av JUNV C # 1 S segment genomisk RNA ved å sammenligne verdien av hver ukjent prøve til en serie av standard fortynninger av plasmid som koder for JUNV C # 1 NP-genet, som er målet for qPCR primer og sonde satt. QPCR analysen kan bare gi kvantifisering for verdier som faller innenfor rekkevidden av standardkurven. Av denne grunn omfatter de følgende mengder plasmid (i triplikate brønner): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, og 5 x 10 7 kopier per brønn.
- Laste qPCR platen inn i den termo og kjøre følgende reaksjonsbetingelser: 95 ° C i 10 minutter og 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 min.
- Samle og analysere data for å bestemme mengden av viral RNA til stede i hver prøve i henhold til produsentens protokoll.
- For å etablere en standardkurve ved anvendelse av en nylig renset prøve av plasmid inneholdende qPCR tjærefå sekvens, først bestemme plasmid kopiantall i denne oppløsning.
- Beregn molekylvekten av plasmidet. Dersom sekvensen av hele plasmidet er kjent, beregnes dette ved hjelp av følgende formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Huske å ta med det totale antall av en bestemt nukleotid som finnes på hver enkelt tråd av dobbeltkjedet plasmid.
- Hvis størrelsen på plasmidet er kjent, men dens nøyaktige sekvens er ikke, beregn MW under den forutsetning at hver dsDNA-basepar har en molekylvekt på 600.
Merk: pCAGGS-JUNV C # en NP plasmid brukt her har en MW på 4,2 x 10 6. - Når MW av plasmidet er blitt bestemt, beregne hvor mange kopier pr mL er til stede i plasmidet lagerløsningen.
- Først beregne den totale ug av plasmid i oppløsningen, og deretter omdanne dette til mol av plasmidet (for eksempel hvis 69 mikrogram av plasmid inneholdes i 300 mL vann og deretter 6,9 x 10 -5 g av plasmid * 1 mol / 4,2 x 10 6 g av plasmid = 1,6 x 10 -11 mol plasmid), som kan omdannes til kopitall (for eksempel 1,6 x 10 -11 mol plasmid * 6,022 x 10 23 molekyler / mol = 9,8 x 10 12 molekyler (eller kopier)).
- Dele den totale kopier av plasmidet i plasmidet oppløsning av volumet av denne løsningen for å få kopier pr ul (for eksempel 9,8 x 10 12 kopier / 300 pl = 3,28 x 10 10 kopier).
- Fortynn denne løsningen riktig måte, slik at 5 ul volumer kan bli lastet på PCR-plate for å gi omfanget av kopiantall nødvendig for å opprette standardkurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere følsomheten og dynamisk område for qPCR-analyse, ble kjente mengder av et plasmid som koder for NP-genet av JUNV C # 1 (område 5-5 x 10 7 eksemplarer) kastet qPCR som beskrevet i del 4 av protokollen. Analysen er følsomme og kan på en pålitelig detektere så få som 5 kopier av målnukleinsyren (figur 2). Dessuten er det dynamiske området av analysen stor og, som vist i figur 2, kan dekke minst 7 logger av malen. Selv om det ikke er vist, har vi oppdaget at så mange som 5 x 10 ni kopier av nukleinsyre.
For å illustrere anvendeligheten av analysen for måling av JUNV C # 1 partikkelfeste, ble forskjellige mengder av JUNV C # 1 på forhånd bundet til Vero E6-celler som beskrevet i protokollen. Etter å ha vasket bort ubundet partikler ble cellene lysert for RNA-rensing, og de resulterende RNA-prøver ble underkastet QRT-PCR. Som vist i figur 3, kan analysen detektere virale feste hendelser ved bruk av så få som 20 eller så mange som 2 x 10 PFU 6, som kan oversettes til mois av 0,0004 og 40, respektivt.
Som vist i figur 4, er det mulig å modifisere den protokollen som skal ikke bare måle viral tilknytning, men også graden av amplifikasjon av genomet som inneholdes i de innkommende virale partikler over tid. Denne modifiserte tilnærmingen kan brukes som et surrogat for å bestemme hvorvidt ytterligere defekter i de gjenværende trinnene for viral inngang (f.eks partikkel endocytose og / eller sammensmelting og frigjøring av virale genom inn i cytoplasma) kan ha oppstått. Interessant, mengde virale genom synes å avta i løpet av den første 6 timer etter feste, noe som tyder på at en del av den innkommende virale genom er degradert. Dette kan skje med partikler som ikke klarer å bli tatt inn i cellen og forringer i extracellmessig plass eller kanskje på grunn av nedbrytning i den endolysosomal nettverket. Dataene som vises viser at 12 eller 18 timer etter infeksjon ville være optimale ganger for å screene for aktiv genom replikering.
Fig. 1: Visning av protokollen arbeidsflyt De primære trinn av virus-cellebinding assay er 1) inkubering av viruspartikler med celler ved 4 ° C for å tillate virus-cellebinding å skje etterfulgt av vasking for å fjerne ubundet virus, 2) rensning av viral RNA fra cellene, 3) revers transkripsjon (RT) for å konvertere JUNV S segment genomisk RNA (vRNA) i cDNA, og 4) qPCR å nummerere kopier av JUNV S vRNA som et mål på virus-celle vedlegg. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: qPCR-analyse for deteksjon av JUNV S segment genomet er sensitivt og kan brukes over et stort dynamisk område Den JUNV S segment qPCR primer-probe settet ble testet for dets evne til å måle nøyaktig kjente mengder (5, 16,6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, eller 5 x 10 7 kopier) av en DNA-standard kontroll-plasmid som koder for målsekvensen. Avbildet er forsterker tomter (A) og standard kurve linjer (B). R2, korrelasjonskoeffisient på primer-probe sett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: JUNV-celle vedlegg analyse en pålitelig tiltakpartikkel feste ved hjelp av så få som 20 PFU. Vero E6-celler ble på forhånd bundet med kjente mengder av JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, eller 2- x 10 6 PFU) i 1,5 timer ved 4 ° C. Ubundne partikler ble fjernet ved vasking ble cellene lysert for RNA-ekstraksjon, og de resulterende RNA-prøvene ble underkastet QRT-PCR for å påvise JUNV C # 1 S segment vRNA som et mål på partikkel tilknytning til Vero E6-celler. Data representerer det midlere antall kopier per brønn fra duplikate brønner ± SEM.
Fig. 4: Kinetikk JUNV C # 1 genomet replikasjon etter infeksjon Vero E6-celler ble inkubert med 2 x 10 3 PFU av JUNV C # 1 (MOI på 0,04) i 1,5 timer ved 4 ° C. Etter flere vaskinger i iskald PBS, ble cellene høstet enten umiddelbart (0-t tidspunkt)eller oppvarmet til 37 ° C i de angitte tidsrom før samlingen. I hvert tilfelle, ble total RNA ekstrahert fra celler og underkastet QRT-PCR for å påvise JUNV C # 1 S segment vRNA. Verdier er angitt som gjennomsnitt eksemplarer per brønn fra to brønner ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen vi beskriver er enkel og robust dersom følgende kritiske betraktninger er observert. Først må strenge pre-PCR teknikk benyttes (se 28 for en utmerket vurdering). Det er viktig at alle reagenser og utstyr er gratis amplifisert DNA inneholder qPCR målsekvensen og at nødvendige kontroller er på plass for å avdekke slik forurensning. For det andre, for virus-cellefesting del av protokollen, virus, celler og media må holdes ved 4 ° C for å forhindre endocytose av overflatebundet virioner. For det tredje må mengden av celler som er samlet inn for RNA-ekstraksjon ikke overskride den RNA-bindingskapasiteten av RNA rensefilter. Fjerde, rensede virale RNA prøver må beskyttes mot ribonuklease-mediert degradering gjennom bruk av nukleasefritt reagenser og utstyr og ved å holde dem på isen når tint. Femte, området for standardkurven inngår i qPCR analysen må være tilstrekkelig storå fange opp alle målte verdier fra de ukjente prøvene. For det sjette bør tekniske replikater være med både virus-cellefesting del av analysen, samt qPCR av individuelle RNA prøver. Syvende, kontroller (for eksempel cellelinjer som uttrykker hTfR1 eller ikke) kan være inkludert for å kontrollere for spesifisiteten av analysen. Til slutt må alt personell har riktig biosikkerhet opplæring og institusjonelle godkjenning til å håndtere smittsomme JUNV C # 1 eller andre patogene arenaviruses.
QPCR del av protokollen krever en qPCR sonde i første rekke for å sikre at spesifisiteten til produktet som skal forsterkes under hvert trinn av PCR-reaksjonen. Kostnaden av analysen kan bli redusert, men ved å eliminere denne qPCR sonde til fordel for en annen qPCR kjemi som ikke krever en probe (for eksempel ved bruk av den asymmetriske fargestoff SYBR grønn I 25) og / eller ved å redusere volumet av qPCR reaksjons~~POS=TRUNC blandingen~~POS=HEADCOMP som ble anvendt. Hvis en sonde uavhengig qPCR appmort anvendes, ville det være viktig å verifisere at reaksjonsbetingelsene er strenge nok til å sikre spesifisiteten av primerne qPCR. Det er også viktig å være klar over at arenavirus RNA, enten ekstrahert fra celler eller virioner, kan ikke-spesifikt primet for å danne cDNA under RT i fravær av et virus-spesifikke RT primer 12. Derfor kopiere numre oppdaget ved hjelp av en vRNA-spesifikke RT primer ikke strengt gjenspeiler bare de vRNA artene målrettet av RT primer. Hvis spesifisitet for genom eller antigenome er nødvendig, har vi rapportert et middel for å omgå dette ikke-spesifikk priming fenomen ved anvendelse av biotinylert RT-primere og streptavidin perler 12.
En viktig styrken av denne analysen er dens ekstreme følsomhet. Andre arenavirus-celle feste analyser med radioaktivt-merket 22, biotinylert 20 eller fluorescens-merket 21 partikler ha krevd Mois på 0,2, 100 eller 1000, respektively. Selv om bruken av radioaktivt-merkede partikler resulterer i god følsomhet, det nødvendiggjør bruken av radioaktivitet, noe som øker kompleksiteten og logistiske sikkerhetshensyn i forbindelse med denne analysen. QPCR-baserte metoden beskrevet her krever så lite som 20 PFU (MOI av ~ 0,0004 i en 48-brønns plate) og kan sikkert oppdage vedlegg over et stort dynamisk område på Mois (f.eks Mois fra 0,0004 til minst 40) (figur 3 ). Den sterke følsomheten av denne analyse gjør det mulig å bruke lave mois for mer nøyaktig måling av produktive bindingsarrangement med standard infeksjonsdyktige virus. Den høye følsomheten også reduserer den mengde virus som er nødvendig for analysen og ved å gjøre dette, begrenser de ytterligere behandlingstrinn som kan påvirke kvaliteten av virioner som brukes i den analysen (for eksempel polyetylenglykol-basert utfelling av virioner, merking virioner med fluoroforer eller radioaktive isotoper og / eller sukrose-banding av virions). I tillegg er qPCR analysen i seg selv er grei å utføre så vel som svært nøyaktig og reproduserbar.
Den celle-feste analysen beskrevet kan modifiseres til å måle flere trinn av viral inngang inkludert virale partikkel endocytose, så vel som det siste trinnet av virus fusion, som er frigjøring av virale genom inn i cytoplasma. For å måle partikkel endocytose, vil de samme trinnene med å feste protokollen bli fulgt til trinn 2.5, som er festing av partikler til cellene ved 4 ° C. Celler vil deretter bli oppvarmet for å tillate virale partikler som skal endocytose, etterfulgt av behandling med en protease for å fjerne eventuelle utvendig bundet virioner som ikke går gjennom endocytose som beskrevet 22,24. Seksjonene 3 og 4 i denne protokollen vil da bli fulgt for å ekstrahere viralt RNA og kvantifisere kopier av viralt genomisk RNA som et mål for endocytose. For å måle genom avkapsling etter fusjon av virus og endosomal membraner, ville cellene forhånd bundet medvirus ved 4 ° C, oppvarmet (for å muliggjøre endocytose og fusjon) og strippet for eksterne partikler, og deretter samlet for analyse. I en metode, kan cellene bli lysert i en isotonisk buffer for å bevare intracellulære vesikler, og deretter delt inn i 2 fraksjoner: en som ville bli behandlet med en cocktail av RNaser (ubelagt viralt RNA er utsatt for nedbrytning), og den andre som ikke ville 39 . Alternativt kan cellene separeres i cytosoliske eller endosomale fraksjoner 40. I begge tilfeller vil QRT-PCR benyttes for å kvantifisere viralt genom i cytoplasma som et mål på virusgenomet avkapsling. Siste kan QRT-PCR-analyse kan enkelt endres til å studere virus vedlegg, endocytose eller fusjon for andre virus som tilbys av RT-PCR reagenser er tilpasset det nye viruset av interesse (for eksempel se 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, og Benjamin King for nyttige diskusjoner og National Institutes of Health for støtte av disse studiene gjennom tilskudd T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), og P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
