Introduction
Аренавирусов представляют собой семейство оболочечных, одноцепочечных РНК -содержащих вирусов, которые обслуживаются в первую очередь у грызунов в природе 1-3. В то время как эти вирусы , как правило , устанавливают бессимптомное, хроническую инфекцию в грызунах водохранилищах 1,2, они могут вызвать серьезные заболевания у людей 3. Важные патогенные виды включают вирус New World Хунин (JUNV) 4 и вирус Ласса Старого Света 5, которые являются этиологическими агентами аргентинской геморрагической лихорадки в Южной Америке и лихорадки Ласса в Африке, соответственно. Лимфоцитарный вирус хореоменингита (LCMV), то прототипичный вирус семейства 6, имеет распространение во всем мире и отвечает за множества болезненных состояний , включая асептического менингита у иммунокомпетентных лиц 6, тяжелых врожденных дефектов развития плода 7 или высокой летальностью иммунодефицитом лица , следующие твердых трансплантации органов. 8,9 Отсутствие Соединенных ШтатовПищевых продуктов и медикаментов (FDA) вакцины или обсуждения и эффективные противовирусные средства для борьбы с этими вирусами подчеркивает острую необходимость в разработке новых стратегий терапевтически предназначаться для этих новых / повторно возникающих патогенных микроорганизмов.
Ареновирус геном состоит из двух одноцепочечных РНК - сегментов, большой (L) (~ 7,2 кб) и малых (S) (~ 3,6 кб) сегментов 10. Сегмент S кодирует вирусный нуклеопротеид (NP) и гликопротеин оболочки (GP) а сегмент L кодирует вирусной полимеразы (L) и матричный белок (Z). L и S геномные сегменты РНК (vRNAs) упакованы в вирионы 10-12. Начальная стадия ареновирус инфекции является прикрепление вирусных частиц к клеткам - хозяевам , через взаимодействие между вирусным GP и ее соответствующими рецепторами клеток - хозяев , которые, для JUNV, включающего человеческий рецептор трансферрина 1 (hTfR1) 13,14. После присоединения частицы JUNV взяты в клетку с помощью клатрин-эндоцитоза 15.Частицы затем трафика на поздних эндосом , где низкое значение рН этого отделения вызывает активацию GP 16,17. После активации GP-кодируемого слитого пептидные вставки в эндосомный мембраны, инициируя слияние между вирусными и эндосомальных мембран. Успешные результаты слияния в выпуске вириона упакованной vRNAs в цитоплазму, где они служат в качестве шаблонов для геномной репликации и транскрипции. Когда достаточное количество вирусных структурных белков и vRNAs образуются новые частицы собираться и бутон из инфицированной клетки , чтобы завершить жизненный цикл 18.
Для того, чтобы облегчить открытие новых стратегий для терапевтических целевых патогенных аренавирусов, наша группа была сосредоточена на выявлении факторов-хозяев, которые имеют решающее значение для распространения вируса, но необязательны для хозяина. В этом контексте, определяя точную стадию (и) жизненного цикла вируса под контролем таких факторов хозяина необходимо направлятьразработка противовирусных стратегий. Здесь мы опишем количественный (Q) ОТ-ПЦР-анализ , который может быть использован для измерения прикрепление ареновирус-клеток с целью идентификации влияют ли определенные белки , принимающие и / или противовирусные молекулы этой начальной стадии проникновения вируса 19. Альтернативные подходы к оценке вложения ареновирус-клеток фигурируют вирионов , меченные биотином 20, флуоресцентных красителей 21 или радиоактивных изотопов 22. Недостатками этих методов может включать требование больших количеств вируса ввода (например , высокая кратностью инфекции (MOI)), использование радиоактивности и / или дополнительных шагов обработки для подготовки ввода вируса (например , концентрацию и / или маркировки вируса) , В частности, использование высокой MOI делает его трудно отличить производительным по сравнению с непроизводственных вложений событий 15,23. QRT-PCR на основе анализа, описанную здесь можно обнаружить крепления события, используя всего лишь 20 зубной налет дляMing единиц (Pfus) вируса, который переводит в МВД 0,0004 для 48-луночного планшета. Таким образом, сильная чувствительность анализа преодолевает требование высокой MOI, а также любые вирусы маркировки или концентрации шагов. Кроме того, анализ может быть я), предназначенный для измерения вириона эндоцитоз, а также высвобождение вирусного генома в цитоплазму следующие слияния и II) специально для использования с другими вирусами через развитие вирус-специфических QRT-реагентов для ПЦР (примеры см 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Очень важно , что описанный протокол проводиться с использованием строгой методики предварительной ПЦР (см 28 для прекрасный обзор о том , как создать лабораторию предварительной ПЦР и как проводить эксперименты с использованием хорошей техники предварительной ПЦР). Крайне важно, чтобы все реагенты и оборудование свободны от амплифицированной ДНК, содержащей целевую последовательность КПЦР и что соответствующие элементы на месте обнаружения такого загрязнения. Обзор протокола показан на рисунке 1.
1. Подготовка носителя и семя клеток в 48-луночные планшеты
- Приготовьте 500 мл полной Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 1% HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты) буферного раствора путем добавления 50 мл из инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 5 мл каждого из 100х пенициллин-стрептомицина и 100x HEPES буферный раствор до 500 мл бутылку DMEM. Этот реагент можно хранить при температуре 476; C в течение нескольких месяцев.
- Семенной 2,5 х 10 4 Vero E6 клеток на лунку в 48-луночный планшет для культивирования тканей в конечном объеме 500 мкл полной среды DMEM. Инкубируйте планшет при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2 в течение 10 до 18 часов.
- Семенной пластину в конце рабочего дня. Проверьте каждый образец вируса как в двух или трех повторностях скважин.
Примечание: В то время как 48-луночный на основе платформы для этого анализа описана, она должна быть возможность масштабировать анализ вниз для использования в 96-или 384-луночных планшетах.
- Семенной пластину в конце рабочего дня. Проверьте каждый образец вируса как в двух или трех повторностях скважин.
2. Провести Вирус-клеточное Вложений:
Примечание: вирус , используемый в данном протоколе, штамм JUNV Откровенный # 1 (C # 1), был успешно использован в качестве живой ослабленной вакцины для профилактики заболевания JUNV 29. JUNV C # 1 был получен из вирулентного штамма JUNV через XJ последовательного прохождения как в естественных условиях и в пробирке и отличается от исходного штамма на 12 XJ аминокислот 30. Becausе JUNV C # 1 является уровень биологической безопасности (BSL) -2-номинальная патоген, работа , описанная в данном разделе должны выполняться с использованием соответствующих BSL-2 практики 31. Это включает в себя использование средств индивидуальной защиты (например , средства защиты глаз, лабораторный халат, двойные перчатки), кабинет биологической безопасности II класса, а также обеспечение того , чтобы все сотрудники получили организационную подготовку и согласований , необходимых для безопасного обращения этого организма.
- Развести JUNV C # 1 образца (ов), подлежащих испытанию до желаемого Pfus или фокус-образующих единиц в ледяном полной DMEM и хранить на льду до готовности добавить в каждую лунку.
Примечание: В качестве альтернативы проведения исследования связывания с вирусом, разведенного в полной среде DMEM, используют минимальную среду, содержащую PBS с пониженной концентрацией сыворотки (2%) и соответствующий буфер, чтобы установить, может ли сыворотка вызвать помехи с приложением вируса. Подобные протоколы для крепления альтернативных вирусов сообщили об использовании RPMI 1640 без bicarboНат , содержащий 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 10 мМ (2- (морфолино) этансульфоновой кислоты), и 10 мМ HEPES, рН 6,8 32. Эта привязка носитель может быть выше , чтобы предотвратить изменение рН , которые могут возникнуть , когда носитель удаляется из СО 2 Окружающая среда инкубатора.- Привить скважин с Pfus в диапазоне от 200 до 2000, чтобы ограничить непродуктивные события вложений. Как показано на фиг.2, этот анализ способен обнаруживать прикрепление с помощью всего лишь 20 БОЕ (или целых 2 х 10 6 БОЕ).
- Создание мастер-микс вируса для инокуляции клеток. Каждый образец вируса будет высевают на дублированных лунках в объеме 50 мкл на лунку. Таким образом, если добавление 2000 Pfus вируса на лунку желательно, разбавленные 4,800 Pfus в общем объеме 120 мкл охлажденного льдом полной DMEM.
- Для контроля специфичности анализа, использовать подобранную пару китайского хомячка клеточных линий яичника, которые либо не выразить TfR1 (TRVb) или ехрССГ hTfR1 (TRVb-1) в качестве JUNV присоединения к этим клеткам должны быть либо сокращены или нет, соответственно , 13,33. В качестве альтернативы, лечить клетки с протеазой , такой как протеиназы К , чтобы предотвратить ареновирус вложение 34 или 35 запись. Растворимый hTfR1 или monocolonal ch128.1 антитело, которое является специфическим для hTfR1, также могут быть рассмотрены , как они известны , чтобы блокировать проникновение в клетки JUNV 13,36. Кроме того, предварительная обработка клеток с свободной маннозы 14 или инкубации частиц с JUNV специфических нейтрализующих антител 37 может ингибировать проникновение вирусов.
- Обратите внимание, однако, что эти последние реагенты и подходы, несмотря на блокирование вход JUNV, не были подтверждены, чтобы блокировать вложение, хотя это вероятное объяснение. Протокол, описанный здесь, может быть использован для формально определить, являются ли эти различные подходы прикрепления воздействие вирионов.
- Удалить пластины из 37 ° C инкубатора ипоместить либо в C холодильнике 4 ° или на льду в течение 15 мин, чтобы ингибировать способность посеянных клеток осуществлять эндоцитоз.
- Далее, аспирация полный DMEM из каждой лунки и быстро промыть каждую лунку дважды с использованием 100 мкл охлажденного льдом PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) с рН 7,4. Затем добавьте 50 мкл предварительно разбавленных образцов вируса (полученного на стадии 2.1) в соответствующие лунки.
- Оберните пластину в полиэтиленовую пленку и немедленно поместить либо обратно на лед или в 4 ° C холодильнике в течение от 1 до 1,5 часа, чтобы позволить произойти прикрепление вируса. Держите тарелку, промывочный буфер и образцы вируса холода при температуре 4 ° C в течение этого шага.
- После завершения 4 ° C Инкубационный, аспирация вирус прививочный материал и промыть каждую лунку 3 раза с 200 мкл охлажденного льдом PBS.
3. Вирусный Экстракция РНК
- Очищают вирусной РНК из JUNV C # 1 частицы , прикрепленные к монослоя с помощью коммерческого набора (например, RNeasy Mini Kit) Accorдинь с протоколом производителя. В частности, следить за "очистку тотальной РНК из клеток животных с использованием протокола спиновой технологии" на страницах 23-28 в мини - справочнике RNeasy (4 - е издание, апрель 2006 г.) с изменениями , перечисленных ниже.
- Лизировать клетки, направленные на стадии 1В путем добавления 350 мкл буфера для лизиса RLT непосредственно в каждую лунку. Смешайте буфер несколько раз, чтобы обеспечить лизис клеток. Следует отметить, что клетки легко лизируют в этом буфере и полный лизис может быть проверена с помощью смотровых колодцев под инвертированным микроскопом.
- Передача в результате клеточного лизата к колонке набора (этап 3a) и следовать остальной части протокола, как описано. В этот момент, как вирус был нейтрализован буфера для лизиса таким образом остальные стадии протокола может быть сделано вне шкафа биологической безопасности класс II при условии, что комплект трубок не были заражены вирусом инфекционного.
- Включите дополнительный шаг 9 из протокола производителя, который является добавки из растиРациональная центрифугирование спиновой колонке для устранения возможного унос буфера ППД.
- На заключительном этапе протокола производителя (этап 10), элюировать очищенную РНК из колонки спина с использованием 30 мкл нуклеазы без DDH 2 O. Магазин РНК при -80 ° С в этом пункте, или использовать непосредственно в анализе QRT-PCR. Для того, чтобы предотвратить деградацию очищенных вирусных образцов РНК с помощью нуклеазы, используют нуклеазы реагенты и оборудование, и держать размораживают образцов РНК на льду.
Примечание: Буферы RLT и RW1 содержат соли гуанидина и не должны быть смешаны с отбеливателем. Буфер RW1 содержит этанол.
4. QRT-PCR Измерение вирусного генома
- Для преобразования JUNV C # 1 S сегмента РНК в кДНК для последующего КПЦР, подвергнуть вирусной РНК (генерируемый на этапе 3.1.4) в РТ в общем объеме 50 мкл.
- Чтобы настроить реакцию RT, сначала необходимо создать мастер-смеси, содержащей каждый из следующих реагентов в реакции: 6,75 мкл нуклеазы-бесплатно DDH 2 O, 5 мкл 2 мкМ запаса праймера S RT 2098- до 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), который является дополнением к НП области S сегмента геномной РНК, 5 мкл 10Х ПЦР - буфера II, 11 мкл раствора 2 мМ MgCl 25, 1,25 мкл (62,5 единиц) фермента RT 1 мкл (0,4 единиц) ингибитора РНКазы и 10 мкл 500 мкМ дНТФ запаса.
Примечание: Во время ареновирус репликации, 4 вид вируса S сегмент РНК образуются: полноразмерным геномную РНК (вРНК), полная длина антигеномного РНК (vcRNA) (то есть обратное дополнение к вРНК), а также два субгеномных мРНК кодирующие гены NP и GP, соответственно. RT праймер, перечисленные здесь имеет место только для сегмента S вРНК, но не vcRNA, мРНК NP, или мРНК GP. - Аккуратно перемешать основной смеси RT и затем аликвоту 40 мкл в отдельные 0,2 мл ПЦР-пробирки. Добавьте 10 мкл вирусной РНК в каждую пробирку. Включают я) Нет управления шаблон трубки (например ,. Добавить 10 мкл нуклеазы без DDH 2 O до 40 мкл основной смеси) и II) в отсутствии контроля фермента RT (например , добавить 10 мкл заведомо положительного образца вирусной РНК в 40 мкл основной смеси , которые не получали любой фермент РТ) для скрининга загрязнения реагентов RT с амплифицированной ДНК, содержащей вирусную последовательность-мишень. Включают РНК, выделенной из неинфицированных клеток с полной RT мастер-смеси для контроля за Специфичность анализа в присутствии клеточной РНК.
- Кроме того, включают в себя заведомо положительный вирусный образец РНК в полной смеси мастер-микс, чтобы проверить качество реагентов RT. Следует отметить, что объем реакционной смеси RT может быть снижена до 25 мкл, при необходимости.
- Чтобы настроить реакцию RT, сначала необходимо создать мастер-смеси, содержащей каждый из следующих реагентов в реакции: 6,75 мкл нуклеазы-бесплатно DDH 2 O, 5 мкл 2 мкМ запаса праймера S RT 2098- до 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), который является дополнением к НП области S сегмента геномной РНК, 5 мкл 10Х ПЦР - буфера II, 11 мкл раствора 2 мМ MgCl 25, 1,25 мкл (62,5 единиц) фермента RT 1 мкл (0,4 единиц) ингибитора РНКазы и 10 мкл 500 мкМ дНТФ запаса.
- Subject трубы RT для следующих условий езды на велосипеде: 25 ° C в течение 10 мин, 48 ° С в течение 30 мин и 95 ° С в течение 5 мин. Следует отметить, что образцы можно хранить при -20 ° С в этой точке или оставляют на ночь в амплификатор, добавив шаг 4 ° C.
- пerform КПЦР в общем объеме 25 мкл.
- Сделать мастер смеси КПЦР путем объединения следующий: 2,5 мкл (в соотношении 9 мкМ акций) каждого прямого праймера ПЦР S1937 + до 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') и обратного праймера PCR S 2001- в 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 мкл (из 2 мкМ запаса) от КПЦР зонда S 1960+ с 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), и 12,5 мкл мастер 2X универсальный КПЦР смешивание. Следует отметить , что прямой праймер сообщалось здесь, который является специфическим для JUNV C # 1, отличается от 1 нт от первоначально сообщалось праймера последовательности 38, которая ориентирована на яростную JUNV штамма Ромеро.
- Аккуратно перемешать раствор и затем добавляют 20 мкл в каждую кПЦР хорошо. Добавьте по 5 мкл каждой реакционной смеси RT в соответствующие КПЦР скважин. Проведение КПЦР в трех экземплярах для каждого испытуемого образца. Обратите внимание, что при необходимости объем реакции ПЦР может быть уменьшена до всего лишь 12,5 мкл.
Примечание: программное обеспечение, связанное смашина КПЦР будет генерировать абсолютные числа копий JUNV C # 1 S сегмента геномной РНК путем сравнения значения каждого неизвестного образца к серии стандартных разведений плазмиды, кодирующей JUNV С # 1 NP гена, который является объектом праймера КПЦР и зонд установлен. Анализ КПЦР может обеспечить только количественное определение значений, которые находятся в пределах диапазона стандартной кривой. По этой причине, включают в себя следующие количества плазмид (в трех лунках): 5, 50, 5 х 10 3, 5 × 10 5 и 5 х 10 7 копий на каждую лунку.
- Вставьте пластину КПЦР в амплификатор и запустить следующие реакционные условия: 95 ° C в течение 10 мин и 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин.
- Сбор и анализ данных для определения количества вирусной РНК, присутствующего в каждом образце в соответствии с протоколом производителя.
- Для того, чтобы установить стандартную кривую, используя недавно очищенный образец плазмиды, содержащей смолу КПЦРполучить последовательность, сначала необходимо определить число копий плазмиды в этом растворе.
- Вычислить молекулярную массу плазмиды. Если последовательность всей плазмиды, как известно, его вычислить по следующей формуле: ММ = ([А * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Не забудьте включить общее количество конкретного нуклеотида, найденной на каждой цепи двухцепочечной плазмиды.
- Если размер плазмиды известен, но его точная последовательность не вычислите MW в предположении, что каждая пара оснований двухцепочечной ДНК имеет MW 600.
Примечание: NP плазмиду pCAGGS-JUNV C # 1 , используемый здесь имеет МВт 4,2 х 10 6. - После того, как МВТ плазмиды было установлено, вычислить, сколько копий на мкл присутствуют в запас раствора плазмиды.
- Во- первых рассчитать общую мкг плазмиды в растворе, а затем преобразовать это число молей плазмиды (например , если 69 мкг плазмиды, содержатся в 300 мкл воды, затем 6,9 х 10 -5 г плазмидной * 1 моль / 4,2 х 10 6 мкг плазмиды = 1,6 · 10 -11 моль плазмиды), которые могут быть преобразованы , чтобы скопировать номер (например , 1,6 × 10 -11 моль плазмиды * 6.022 х 10 23 молекул / моль = 9,8 × 10 12 молекул (или их копии)).
- Разделите общее число копий плазмиды в плазмиде растворе по объему этого раствора , чтобы получить копий в мкл (например , 9.8 × 10 12 копий / 300 мкл = 3,28 · 10 10 копий).
- Развести это решение соответствующим образом так, что 5 мкл объемы могут быть загружены на пластину ПЦР, чтобы поставить диапазон числа копий, необходимых для создания стандартной кривой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать чувствительность и динамический диапазон анализа КПЦР, известные количества плазмиды , кодирующей ген НП JUNV C # 1 (диапазон 5-5 х 10 7 экземпляров) были подвергнуты кПЦР , как описано в разделе 4 протокола. Анализ чувствителен и может надежно обнаружить всего лишь 5 копий нуклеиновой кислоты - мишени (рисунок 2). Кроме того, динамический диапазон анализа велик и, как показано на рисунке 2, может покрывать , по меньшей мере , 7 журналов шаблона. Хотя это не показано, мы обнаружили целых 5 х 10 9 копий нуклеиновой кислоты.
Чтобы проиллюстрировать полезность анализа для измерения прилипания частиц JUNV C # 1, различные количества JUNV C # 1, были prebound к клеткам Vero E6, как описано в протоколе. После того, как вымывание несвязанные частицы, клетки лизируют для очистки РНК и полученные образцы РНК подвергали Qrt-PCR. Как показано на рисунке 3, анализ может обнаружить вирусные события вложений с помощью всего лишь 20 или целых 2 х 10 6 БОЕ, который переводит к 0,0004 множественностью инфекции и 40, соответственно.
Как показано на рисунке 4, можно модифицировать протокол , чтобы не только измерить вирусную вложение, но и скорость амплификации генома , содержащегося в приходящих вирусных частиц с течением времени. Этот модифицированный подход может быть использован в качестве заменителя , чтобы определить , может ли происходить дальнейшие дефекты в остальных этапах вхождения вируса (например , эндоцитоза частиц и / или синтеза и высвобождения вирусного генома в цитоплазму). Интересно отметить, что количество вирусного генома, как представляется, уменьшить в течение первых 6 ч следующего прикрепления, что говорит о том, что часть поступающего вирусного генома деградирует. Это может случиться с частицами, которые не должны быть приняты в клетку и ухудшались в extracellулар пространство или, возможно, из-за деградации в сети endolysosomal. Приведенные данные показывают, что 12 или 18 ч после заражения будет оптимальное время для скрининга активной репликации генома.
Рисунок 1:. Изображение рабочего процесса протокола Основные этапы анализа связывания вируса-клеток являются 1) инкубацию вирусных частиц с клетками при температуре 4 ° С , чтобы позволить прикрепление вируса-клеток к происходят с последующим промывок для удаления несвязанного вирус, 2) очистка вирусной РНК из клеток, 3) с обратной транскрипцией (RT) для преобразования JUNV S сегмент геномную РНК (вРНК) в кДНК, и 4) КПЦР перечислить копии JUNV S вРНК как мера прикрепления вируса с клеткой. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рис . 2: КПЦР тест для обнаружения JUNV S сегмента генома чувствителен и может быть использован в широком динамическом диапазоне Набор праймеров-зонд JUNV S сегмент КПЦР тестировали на его способность точно измерить известные величины (5, 16.6, 50, 5 х 10 3, 5 × 10 5 или 5 × 10 7 копий) стандартной ДНК плазмиды управления кодирующей последовательности - мишени. Изображенный являются усилительные участки (А) и стандартные аппроксимации кривой линии (B). R 2, коэффициент корреляции набора праймеров зонд. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: приложение анализа JUNV-клеток надежно измеряетприкрепление частиц с использованием всего лишь 20 PFU. клеток Vero E6 были prebound с известными количествами JUNV C # 1 (2 х 10 1, 2 х 10 2, 2 х 10 3, 2 х 10 4, 2 х 10 5, или 2 х 10 6 БОЕ) в течение 1,5 ч при температуре 4 ° С. Несвязанные частицы были удалены промывкой, клетки лизируют для экстракции РНК, а полученные образцы РНК подвергали QRT-PCR для обнаружения JUNV C # 1 сегмента сети вРНК как мера прикрепления частиц к клеткам Vero E6. Данные представляют собой среднее число копий на лунку из дублирующих лунок ± SEM.
На рис . 4: Кинетика репликации генома JUNV C # 1 после инфицирования клеток Vero E6 инкубировали с 2 х 10 3 БОЕ JUNV C # 1 (MOI 0,04) в течение 1,5 ч при температуре 4 ° С. После нескольких промываний в ледяном PBS, клетки собирали либо немедленно (0 час момент времени)или нагревают до 37 ° С в течение указанных периодов времени до сбора. В каждом случае Суммарную РНК экстрагировали из клеток и подвергали QRT-PCR для обнаружения JUNV C # 1 сегмента сети вРНК. Значения приведены в виде средних копий на лунку из дублирующих лунок ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол мы описываем прост и надежный при соблюдении следующих критических соображений. Во- первых, необходимо применять строгие предварительно ПЦР метод (см 28 для отличного обзора). Крайне важно, чтобы все реагенты и оборудование свободны от амплифицированной ДНК, содержащей целевую последовательность КПЦР и что соответствующие элементы на месте обнаружения такого загрязнения. Во-вторых, для крепежной части вирус-клетка протокола, вирус, клетки, и средства массовой информации должны храниться при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить эндоцитоз поверхностно-св занный вирионов. В-третьих, количество клеток, собранных для экстракции РНК не должна превышать связывающую способность РНК фильтра очистки РНК. В-четвертых, очищенные вирусные образцы РНК должна быть защищена от деградации РНКазы-опосредованное за счет использования нуклеазы реагентов и оборудования, и, держа их на льду, когда оттаивают. В-пятых, диапазон стандартной кривой включены в анализе КПЦР должно быть достаточно большимчтобы захватить все значения, наблюдаемые из неизвестных образцов. В-шестых, технические повторностей должны быть включены как для крепежной части вируса-клеточного анализа, а также кПЦР отдельных образцов РНК. В- седьмых, средства управления (например , клеточные линии , которые экспрессируют hTfR1 или нет) могут быть включены для контроля за специфичность анализа. Наконец, весь персонал должен иметь соответствующую подготовку по биобезопасности и институционального утверждения для обработки инфекционное JUNV C # 1 или других патогенных аренавирусов.
Часть КПЦР протокола требует зонд КПЦР прежде всего, чтобы обеспечить специфичность продукта усиливаемого в каждой стадии ПЦР-реакции. Стоимость анализа может быть снижена, тем не менее, за счет устранения этого КПЦР зонд в пользу другой химии КПЦР , который не требует зонда (например , с использованием асимметричного красителя SYBR Green I 25) и / или за счет уменьшения объема использовали КПЦР реакционную смесь. Если зондового независимый КПЦР приложенияплотва используется, было бы важно, чтобы убедиться, что условия реакции являются достаточно жесткими, чтобы обеспечить специфичность праймеров КПЦР. Важно также , чтобы быть в курсе , что ареновирус РНК, является ли извлечены из клеток или вирионы, могут быть неспецифически грунтовкой для формирования кДНК при РТ в отсутствии вирусспецифического RT грунтовкой 12. Таким образом, число копий, обнаруженных с помощью вРНК-специальную затравку RT строго говоря, не отражают только те виды вРНК мишенью для праймера RT. Если специфичность по отношению к геному или antigenome требуется, мы сообщали средства , чтобы обойти это неспецифический грунтовочное явление за счет использования биотинилированных праймеров RT и стрептавидином бусин 12.
Важным преимуществом данного метода является его крайняя чувствительность. Другие анализы прикрепления ареновирус-клеток с участием радиоактивно меченных 22, биотинилированный 20 или флуоресцентно меченных 21 частицы требуется MÕIS 0,2, 100 или 1000, соответствующиеLY. В то время как использование радиоактивно-меченых частиц приводит к хорошей чувствительностью, это делает необходимым использование радиоактивности, что повышает материально-технические сложности и проблемы безопасности, связанные с этим конкретным анализом. Метод КПЦР на основе описанной здесь требуется всего лишь 20 БОЕ (MOI из ~ 0,0004 в 48-луночный планшет) и может надежно обнаружить вложение в широком динамическом диапазоне множественностью инфекции (например , множественностью инфекции от 0,0004 до по крайней мере , 40) (рис 3 ). Сильная чувствительность этой пробы дает возможность использовать низкую MOIS для более точного измерения продуктивных связывания событий с помощью стандартных инфекционного вируса. Высокая чувствительность также значительно снижает количество вируса , необходимые для анализа и, при этом, ограничивает дополнительные этапы обработки , которые могут повлиять на качество вирионов используется в анализе (например , полиэтилен осаждение на основе гликоля вирионов, маркируя вирионов флуорофоры или радиоактивные изотопы и / или сахароза-кольцевания virioнс). Кроме того, сам анализ КПЦР прост для выполнения, а также высокую точность и воспроизводимость.
Анализ клеточного крепление, описанное может быть модифицирован для измерения дополнительных стадий проникновения вируса, включая вирусные частицы эндоцитоза, а также на заключительном этапе вируса слияния, который является высвобождение вирусного генома в цитоплазму. Для измерения эндоцитоза частиц, одни и те же этапы протокола присоединения будет следовать через шаг 2,5, что присоединение частиц к клеткам при температуре 4 ° С. Клетки затем подогреть , чтобы вирусные частицы , которые будут эндоцитированный, с последующей обработкой с помощью протеазы , чтобы лишить каких - либо внешне связанных вирионы , которые не были эндоцитоз , как описано 22,24. Разделы 3 и 4 этого протокола затем будет следовать, чтобы извлечь вирусной РНК и количественной оценки копии геномной РНК вируса в качестве меры эндоцитоза. Для измерения генома декапсидацию следующие слияния вирусных и эндосомальных мембран, клетки будут prebound сВирус при 4 ° С, нагревают (разрешить эндоцитоз и слияние) и лишен внешних частиц, а затем собирали для анализа. В одном подходе, клетки могут быть лизированы в изотоническом буфере для сохранения внутриклеточные везикулы, а затем разделить на 2 фракции: одну , которая будет относиться с коктейлем РНКазы (без покрытия вирусной РНК подвержена деградации) , а другой , который не будет 39 , В качестве альтернативы, клетки могут быть разделены на цитозольной или эндосомальных фракций 40. В обоих случаях, QRT-ПЦР будет использоваться для количественного определения вирусного генома в цитоплазме в качестве меры вирусного генома раздевающей. Наконец, анализ QRT-ПЦР может быть легко модифицирована для изучения привязанности вируса, эндоцитоз или слияние для других вирусов , предусмотренных реагенты RT-PCR адаптированные к новому вирусу интереса (примеры см 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Маркус Thali, Натан Рой, Кристофер Ziegler, Эмили Брюс, и Бенджамин Кинг за полезные обсуждения и Национальным институтом здравоохранения для поддержки этих исследований через гранты T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), и P20RR021905 (JB) ,
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
