Introduction
Arenavirus är en familj av hölje, enkelsträngade RNA-virus som i första hand hålls i gnagare i naturen 1-3. Även om dessa virus etablera typiskt en asymtomatisk, ihållande infektion i gnagare reservoarer 1,2, kan de orsaka svår sjukdom hos människor 3. Viktiga patogena arter är den nya världen Junin virus (JUNV) 4 och den gamla världen Lassa-virus 5, som är det etiologiska agenter argentinska hemorragisk feber i Sydamerika och Lassafeber i Afrika, respektive. Lymfocytiskt koriomeningitvirus (LCMV), den prototypiska virus av familjen 6, har en global distribution och är ansvarig för en rad olika sjukdomstillstånd, inklusive aseptisk meningit hos immunkompetenta personer 6, allvarliga fosterskador i det växande fostret 7, eller hög dödlighet hos immunosupprimerade individer efter fast organtransplantation 8,9. Bristen i Förenta StaternaFood and Drug Administration (FDA) -godkända vacciner eller effektiva antivirala läkemedel för att bekämpa dessa virus belyser den kritiska behovet av att utveckla nya strategier för att terapeutiskt rikta dessa nya / återkommande patogener.
Den arenavirus genomet består av två enkelsträngade RNA-segment, den stora (L) (~ 7,2 kb) och små (S) (~ 3,6 kb) segment 10. S-segmentet kodar det virala nukleoprotein (NP) och höljesglykoprotein (GP), medan L-segment kodar det virala polymeraset (L) och matrisprotein (Z). L och S iska RNA-segment (vRNAs) förpackas i virioner 10-12. Det första steget i arenavirus infektion är fästandet av viruspartiklar till värdceller genom en interaktion mellan den virala GP och dess motsvarande värdcellreceptorer som, för JUNV, innefattar den humana transferrinreceptorn 1 (hTfR1) 13,14. Efter bindning är JUNV partiklar tas in i cellen via clathrin-medierad endocytos 15.Partiklar trafik till den sena endosomen där den låga pH-värdet i denna avdelning utlöser aktiveringen av GP 16,17. När den är aktiverad, GP-kodade fusionspeptid skär i det endosomala membranet, initiera fusion mellan de virala och endosomala membran. Framgångsrika fusionsresulterar i frisättning av virionet förpackade vRNAs in i cytoplasman, där de tjänar som schabloner för genomisk replikation och transkription. När genereras tillräckliga mängder av virusstrukturproteiner och vRNAs, nya partiklar montera och knopp från den infekterade cellen att slutföra livscykel 18.
För att underlätta upptäckten av nya strategier för att terapeutiskt rikta patogena arenavirus, har vår grupp fokuserat på identifiering av värdfaktorer som är kritiska för virus förökning, men umbärliga för värden. I detta sammanhang är det nödvändigt att fastställa den exakta skedet (n) och den virala livscykeln som kontrolleras av sådana värdfaktorer för att styrautveckling av antivirala strategier. Häri beskriver vi en kvantitativ (q) RT-PCR-baserad analys som kan användas för att mäta arenavirus-cellbindning i syfte att identifiera huruvida utvalda värdproteiner och / eller antivirala molekyler påverka detta inledande skede av viralt inträde 19. Alternativa metoder för att mäta arenavirus-cellbindning har presenterat virioner märkta med biotin 20, fluorescerande färgämnen 21 eller radioaktiva isotoper 22. Nackdelar med dessa metoder kan innefatta krav på stora mängder av ingångs virus (t.ex. höga multipliciteter av infektion (MOI)), användning av radioaktivitet, och / eller ytterligare hanteringssteg för att förbereda ingångs virus (t.ex. koncentration och / eller märkning av virus) . I synnerhet användningen av höga MOI gör det svårt att skilja produktiv kontra icke-produktiva fäst händelser 15,23. Den QRT-PCR-baserad analys som beskrivs här kan upptäcka fäst händelser med hjälp av så få som 20 plack förming-enheter (PFU) av virus, vilket leder till en MOI av 0,0004 för en 48-brunnar. Därför är den starka känsligheten för analysen övervinner kravet på högt MOI samt eventuella virus märkning eller koncentrationssteg. Vidare kan analysen vara i) anordnade att mäta virion endocytos såväl som frisättning av virusgenomet in i cytoplasman efter fusion och ii) anpassad för användning med andra virus genom utveckling av virusspecifika QRT-PCR-reagens (för exempel, se 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Det är viktigt att det beskrivna protokollet utföras med hjälp av en strikt pre-PCR-teknik (se 28 för en utmärkt översikt om hur man ställer upp en pre-PCR laboratorium och hur man genomför experiment med hjälp av bra pre-PCR-teknik). Det är absolut nödvändigt att alla reagenser och utrustning är fria från förstärkt DNA innehållande qPCR målsekvensen och att lämpliga kontroller för att upptäcka sådan förorening. En översikt av protokollet visas i figur 1.
1. Förbered media och Seed celler i 48-brunnsplattor
- Bereda 500 ml av komplett Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 10% fetalt bovint serum, 1% penicillin-streptomycin och 1% HEPES (N-2-hydroxietylpiperazin-N-2-etansulfonsyra) buffertlösning genom tillsats av 50 ml av värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 5 ml vardera av en 100x penicillin-streptomycin och 100x HEPES-buffertlösning till en 500 ml flaska DMEM. Detta reagens kan lagras vid 476; C i flera månader.
- Seed 2,5 x 10 4 Vero E6 celler per brunn i en 48-brunnars vävnadsodlingsplatta i en slutlig volym av 500 | il fullständigt DMEM. Inkubera plattan vid 37 ° C i en fuktad inkubator innehållande 5% CO2 under 10-18 h.
- Seed plattan i slutet av arbetsdagen. Testa varje virusprov i antingen två eller tre exemplar brunnar.
Obs: Medan en 48-väl-baserad plattform för denna analys beskrivs, bör det vara möjligt att skala ner för användning analysen i 96- eller 384-brunnsplattor.
- Seed plattan i slutet av arbetsdagen. Testa varje virusprov i antingen två eller tre exemplar brunnar.
2. Genomför Virus-cell Attachment
Obs: Det virus som används i detta protokoll, JUNV stam Candid # 1 (C # 1), har framgångsrikt använts som ett levande försvagat vaccin för att förebygga JUNV sjukdom 29. JUNV C # 1 var härledd från den virulenta JUNV stammen XJ genom seriepassage både in vivo och in vitro och skiljer sig från den parentala XJ stammen genom 12 aminosyror 30. because JUNV C # 1 är en biosäkerhetsnivån (BSL) -2-rated patogen, måste det arbete som beskrivs för detta avsnitt utföras med användning av lämpliga BSL-2 praxis 31. Detta innefattar användning av personlig skyddsutrustning (t.ex. ögonskydd, laboratorierock, dubbla handskar), en klass II biosäkerhet skåp, och se till att all personal har fått den institutionella utbildning och godkännanden som krävs för att på ett säkert sätt hantera denna organism.
- Späd JUNV C # 1 prov (er) som skall testas till önskad PFU eller fokusera bildande enheter i iskallt komplett DMEM och lagra på is tills redo att lägga till varje brunn.
Obs: Som ett alternativ till utförandet av bindningsstudier med virus utspätt i fullständigt DMEM, använda en minimalt medium innehållande PBS med en reducerad serumkoncentration (2%) och en lämplig buffert för att fastställa huruvida serum kan störa virusbilaga. Liknande fäst protokoll för alternativa virus har rapporterat användning av RPMI 1640-medium utan bicarbonate innehållande 0,2% bovint serumalbumin, 10 mM (2- (morfolino) etansulfonsyra), och 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Denna bindning media kan vara överlägsen för att förhindra pH-förändringar som kan uppstå när medium avlägsnas från CO 2 -miljö av inkubatorn.- Inokulera brunnar med PFU som sträcker sig från 200 till 2000 för att begränsa icke-produktiva fäst händelser. Såsom visas i figur 2, är denna analys med förmåga att detektera bindning med användning av så få som 20 PFU (eller så många som 2 x 10 6 PFU).
- Skapa en mästare blandning av virus för ympning på celler. Varje prov virus kommer att ympas på dubbla brunnar i en volym av 50 | il per brunn. Därför, om tillsatsen av 2.000 pfu av virus per brunn önskas, utspädd 4.800 pfu i en total volym av 120 | il iskall slutföra DMEM.
- För att kontrollera specificiteten av analysen använder ett matchat par av kinesisk hamster cellinjer som antingen inte uttrycker TfR1 (TRVb) eller express hTfR1 (TRVb-1) som JUNV anslutning till dessa celler bör antingen sänkas eller inte, respektive 13,33. Alternativt behandla celler med ett proteas såsom proteinas K för att förhindra arenavirus fastsättning 34 eller inträde 35. Lösliga hTfR1 eller monocolonal antikropps ch128.1, som är specifik för hTfR1 kan också betraktas som de är kända för att blockera inträde av JUNV i celler 13,36. Dessutom kan förbehandling av celler med fri mannos 14 eller inkubation av partiklar med JUNV specifika neutraliserande antikroppar 37 hämmar virus inträde.
- Observera dock att dessa sistnämnda reagens och metoder, trots att blockera JUNV posten, inte har bekräftats att blockera kvarstad, även om detta är en trolig förklaring. Protokollet som beskrivs här kan användas för att formellt avgöra huruvida dessa olika tillvägagångssätt inverkan virion fastsättning.
- Ta plattor från 37 ° C inkubator ochplacera antingen i en 4 ° C kylskåp eller på is under 15 min för att inhibera förmågan hos de strukna cellerna att utföra endocytos.
- Därefter aspirera fullständigt DMEM från varje brunn och snabbt tvätta varje brunn två gånger med användning av 100 | il iskall PBS (fosfatbuffrad saltlösning) pH 7,4. Lägg sedan till 50 l av spätts virusprov (som framställts i steg 2,1) till de lämpliga brunnarna.
- Linda plattan i plastfolie och placera omedelbart antingen tillbaka på is eller i en 4 ° C kylskåp under 1 till 1,5 timmar för att möjliggöra virus fastsättning inträffa. Hålla plattan, tvättbuffert, och virusprov kallt på 4 ° C under hela detta steg.
- Efter slutförandet av 4 ° C inkubation, aspirera viruset inokulat och tvätta varje brunn 3 gånger med 200 | il iskall PBS.
3. Viral RNA-extraktion
- Rena viralt RNA från JUNV C # 1-partiklar bundna till monoskikten med hjälp av kommersiella kit (t.ex. RNeasy Mini kit) According tillverkarens protokoll. Specifikt följa "rening av totalt RNA från djurceller med hjälp av spin teknik protocol" på sidorna 23-28 i RNeasy Mini Handbook (4: e upplagan, april 2006) med de ändringar som anges nedan.
- Lyserar cellerna enligt anvisningarna i steg 1B genom att tillsätta 350 | il lysbuffert RLT direkt till varje brunn. Blanda bufferten flera gånger för att säkerställa cell-lys. Notera att cellerna lätt lyserar i denna buffert och fullständig lys kan verifieras genom att visa brunnar under ett inverterat mikroskop.
- Överför den resulterande cellysatet till satsen kolonnen (steg 3a) och följ resten av protokollet som beskrivs. Vid denna punkt, har viruset neutraliserades genom lysbuffert så de återstående stegen i protokollet kan göras utsidan av klass II biosäkerhet skåpet tillgänglig kit Rören inte förorenats med infektiöst virus.
- Inkludera valfria steget 9 från tillverkarens protokoll, vilket är en Additional centrifugering av spinnkolonn för att eliminera eventuell överföring buffert RPE.
- I det slutliga steget tillverkarens protokoll (steg 10), eluera det renade RNA från spinnkolonn med användning av 30 pl nukleasfritt DDH 2 O. Store RNA vid -80 ° C vid denna punkt eller använd direkt i QRT-PCR-analysen. För att förhindra nedbrytning av renade virala RNA-prover från nukleaser, använd nukleasfria reagens och utrustning och hålla upptinade RNA-prover på is.
Obs: Buffertar RLT och RW1 innehåller guanidinsalt och bör inte blandas med blekmedel. Buffert RW1 innehåller etanol.
4. QRT-PCR Mätning av virusgenom
- Att konvertera JUNV C # 1 S-segmentet RNA till cDNA för efterföljande qPCR, utsätta det virala RNA (genererad i steg 3.1.4) till RT i en total volym av 50 | il.
- För att ställa in RT-reaktionen, först skapa en huvudblandning innehållande vart och ett av följande reagens per reaktion: 6,75 il nukleas-fri DDH 2 O, 5 | il av en 2 iM lager av RT-primern S 2098- till 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), vilken är komplementär till den NP regionen av S-segmentet genom-RNA, 5 | il 10X PCR-buffert II, 11 fil av en 25 mM MgCl2 lösning, 1,25 l (62,5 enheter) RT enzym, 1 pl (0,4 enheter) av RNas-inhibitor, och 10 fil av en 500 ^ M lager av dNTP.
Obs: Under arenavirus replikering är 4 virala S-segmentet RNA species genereras: en fullängds genomiskt RNA (vRNA), en fullängds antigenom RNA (vcRNA) (som är det omvända komplementet av vRNA), och två subgenomiska mRNA kodar för de NP- och GP-gener, respektive. RT-primern som anges här är specifikt för endast S-segmentet vRNA, men inte den vcRNA, NP-mRNA, eller GP mRNA. - Blanda försiktigt RT Master Mix och sedan alikvot 40 pl i enskilda 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt 10 | il av viralt RNA till varje rör. Inkluderar i) en kontroll utan templat röret (t.ex.. Tillsätt 10 pl nukleasfria DDH 2 O till 40 pl av Master Mix) och ii) en ingen RT enzymkontroll (t.ex. tillsätt 10 pl av en känd positiva viral RNA-prov till 40 pl masterblandning som inte får någon RT enzym) för att screena för kontaminering av RT reagenser med förstärkt DNA innehållande den virala målsekvensen. Inkluderar RNA extraherat från icke-infekterade celler med det fullständiga RT Master Mix att kontrollera för analysspecificitet i närvaro av cellulärt RNA.
- Dessutom inkluderar en känd positiva viral RNA-prov till den fullständiga Master Mix för att kontrollera kvaliteten på de RT reagens. Notera att volymen av RT-reaktionen kan reduceras till 25 ^ om så behövs.
- För att ställa in RT-reaktionen, först skapa en huvudblandning innehållande vart och ett av följande reagens per reaktion: 6,75 il nukleas-fri DDH 2 O, 5 | il av en 2 iM lager av RT-primern S 2098- till 2075- (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), vilken är komplementär till den NP regionen av S-segmentet genom-RNA, 5 | il 10X PCR-buffert II, 11 fil av en 25 mM MgCl2 lösning, 1,25 l (62,5 enheter) RT enzym, 1 pl (0,4 enheter) av RNas-inhibitor, och 10 fil av en 500 ^ M lager av dNTP.
- Utsätta RT rören till följande cykelbetingelser: 25 ° C under 10 min, 48 ° C under 30 min, och 95 ° C under 5 min. Notera att proven kan förvaras vid -20 ° C vid denna punkt eller lämnades över natten i termocykler genom tillsats av en 4 ° C steg.
- Perform qPCR i en total volym av 25 | il.
- Gör en qPCR huvudblandning genom att kombinera följande: 2,5 | j, l (av en 9 pM stock) av varje framåt PCR-primer S1937 + för att 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') och reverse PCR-primer S 2001- till 1982- (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 | il (av en 2 iM lager) hos qPCR sonden S 1960+ till 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 '), och 12,5 ^ il av 2X universella qPCR herre blanda. Observera att den framåtriktade primern rapporteras här, som är specifik för JUNV C # 1, skiljer sig med en nt från ursprungligen rapporterades primersekvens 38, som riktar den virulenta JUNV stammen Romero.
- Blanda försiktigt lösningen och sedan lägga till 20 l till varje qPCR väl. Tillsätt 5 | il av varje RT-reaktionen till lämpliga qPCR brunnar. Genomför qPCR i tre exemplar för varje testat prov. Notera att PCR-reaktionsvolym kan reduceras till så lite som 12,5 pl om det behövs.
Obs: Programvaran i samband medqPCR maskinen kommer att generera absoluta kopietal av JUNV C # 1 S-segmentet genom-RNA genom att jämföra värdet för varje okänt prov till en serie av standardspädningar av plasmid som kodar för JUNV C # 1 NP-genen, som är målet för den qPCR-primer och probuppsättning. QPCR analysen kan bara ge kvantifiering för värden som faller inom området för standardkurvan. Av denna anledning omfattar följande kvantiteter av plasmid (i trippelbrunnar): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 och 5 x 10 7 kopior per brunn.
- Ladda qPCR plattan i termocykler och kör följande reaktionsbetingelser: 95 ° C under 10 min och 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 1 min.
- Samla in och analysera data för att bestämma mängden viralt RNA närvarande i varje prov enligt tillverkarens protokoll.
- Att etablera en standardkurva med hjälp av en nyligen renat prov av plasmid innehållande qPCR tjärafå sekvens, först bestämma plasmiden kopietal i denna lösning.
- Beräkna molekylvikten för plasmiden. Om sekvensen av hela plasmiden är känd, beräkna detta med hjälp av följande formel: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Kom ihåg att inkludera det totala antalet av en speciell nukleotid som finns på varje sträng av den dubbelsträngade plasmiden.
- Om storleken av plasmiden är känd men dess exakta sekvensen inte är det, beräkna MW under antagandet att varje dsDNA baspar har en molekylvikt av 600.
Obs! PCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmid som används här har en molekylvikt av 4,2 x 10 6. - När väl MW av plasmiden har fastställts, beräkna hur många kopior per | il är närvarande i mälden plasmiden lösning.
- Först beräkna den totala ig plasmid i lösningen, sedan konvertera detta till moler plasmid (t.ex. om 69 ^ g av plasmid finns i 300 | il vatten, sedan 6,9 x 10 -5 g av plasmid * 1 mol / 4,2 x 10 6 g av plasmid = 1,6 x 10 -11 mol plasmid), som kan omvandlas för att kopiera nummer (t.ex. 1,6 x 10 -11 mol plasmid * 6,022 x 10 23 molekyler / mol = 9,8 x 10 12 molekyler (eller kopior)).
- Dividera det totala antalet kopior av plasmiden i plasmiden lösning med volymen av denna lösning för att få kopior per il (t.ex. 9,8 x 10 12 kopior / 300 pl = 3,28 x 10 10 kopior).
- Späd denna lösning på lämpligt sätt, så att 5 il volymer kan laddas på PCR-plattan för att leverera de olika kopietal nödvändiga för att etablera standardkurvan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera känsligheten och det dynamiska omfånget av qPCR analysen var kända mängder av en plasmid som kodar för NP-genen av JUNV C # 1 (intervall 5-5 x 10 7 kopior) utsattes för qPCR som beskrivs i avsnitt 4 i protokollet. Analysen är känslig och kan på ett tillförlitligt sätt detektera så få som 5 kopior av målnukleinsyran (Figur 2). Vidare är det dynamiska området för analysen stora och, såsom visas i figur 2, kan täcka minst 7 loggar av mall. Fastän det inte visas, har vi upptäckt så många som 5 x 10 9 kopior av nukleinsyra.
För att illustrera användbarheten av analys för mätning av JUNV C # 1 fäst partikel framställdes olika mängder JUNV C # 1 prebound till Vero E6-celler såsom beskrivs i protokollet. Efter borttvättning av obundna partiklar, lyserades cellerna för RNA-rening och de resulterande RNA-prover underkastades QRT-PCR. Såsom visas i fig 3, kan analysen detektera virala fäst händelser med användning av så få som 20 eller så många som 2 x 10 6 PFU, som översätts till molekyler av intresse av 0,0004 och 40, respektive.
Såsom visas i figur 4, är det möjligt att modifiera protokollet för att inte bara mäta viral fastsättning, utan även graden av amplifiering av genomet som finns i de inkommande virala partiklar över tiden. Denna modifierade metod kan användas som ett surrogat för att avgöra om ytterligare fel i de återstående stegen i viralt inträde (t.ex. partikel endocytos och / eller fusion och frisättning av virusgenom i cytoplasman) kan förekomma. Intressant nog verkar den mängd virala genomet för att minska under den första 6 h efter bindning, vilket tyder på att en del av den inkommande virala genomet är nedbruten. Detta skulle kunna hända med partiklar som inte tas in i cellen och bryts ned i extracellular utrymme eller kanske på grund av nedbrytning inom endolysosomal nätverket. De data som visas visar att 12 eller 18 h efter infektion skulle vara optimala tider för att screena för aktiva genomreplikation.
Figur 1:. Återgivningen av protokoll arbetsflöde De primära stegen i virus-cellvidhäftningsanalysen är en) inkubering av viruspartiklar med celler vid 4 ° C för att tillåta virus-cellbindning att inträffa, följt av tvättningar för att avlägsna obundet virus, 2) rening av viralt RNA från cellerna, 3) omvänd transkription (RT) för att konvertera JUNV S-segmentet genomiskt RNA (vRNA) till cDNA, och 4) qPCR att räkna upp kopior av JUNV S vRNA som ett mått på viruscellvidhäftning. klicka här att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. QPCR analys för detektion av JUNV S-segmentet genomet är känslig och kan användas över ett stort dynamiskt område Den JUNV S-segmentet qPCR primer-prob uppsättning testades med avseende på dess förmåga att exakt mäta kända kvantiteter (5, 16,6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5, eller 5 x 10 7 kopior) av en DNA-standardstyr plasmid som kodar för målsekvensen. Avbildad är förstärknings tomter (A) och standardkurvan passnings linjer (B). R2, korrelationskoefficient av primer-prob set. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: JUNV-cellvidhäftningsanalys tillförlitligt åtgärderpartikelfästet med så få som 20 PFU. Vero E6 celler prebound med kända mängder JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5, eller två x 10 6 PFU) i 1,5 h vid 4 ° C. Obundna partiklar avlägsnades genom tvättning lyserades cellerna för RNA-extraktion, och de resulterande RNA-prover utsattes för QRT-PCR för att detektera JUNV C # 1 S-segmentet vRNA som ett mått på partikel fastsättning på Vero E6 celler. Data representerar medelvärdet kopietal per brunn från dubbla brunnar ± SEM.
Figur 4:. Kinetik för JUNV C # 1 genomreplikation efter infektion Vero E6 celler inkuberades med 2 x 10 3 PFU av JUNV C # 1 (MOI på 0,04) under 1,5 h vid 4 ° C. Efter flera tvättar i iskall PBS, cellerna antingen skörd omedelbart (0 h tidpunkt)eller värms till 37 ° C under de angivna tiderna före samlingen. I varje enskilt fall, extraherades totalt RNA från celler och utsattes för QRT-PCR för att detektera JUNV C # 1 S-segmentet vRNA. Värdena anges som medelvärden kopior per brunn från dubbla brunnar ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet vi beskriver är enkel och robust under förutsättning att följande kritiska överväganden observeras. Först måste strikt pre-PCR-teknik användas (se 28 för en utmärkt översyn). Det är absolut nödvändigt att alla reagenser och utrustning är fria från förstärkt DNA innehållande qPCR målsekvensen och att lämpliga kontroller för att upptäcka sådan förorening. För det andra, för viruscellfäst delen av protokollet, virus, celler och media måste hållas vid 4 ° C för att förhindra endocytos av ytbundna virioner. För det tredje måste den mängd celler som samlats in för RNA-extraktion inte överstiga det RNA-bindande kapaciteten av RNA reningsfiltret. Fjärde, renade virala RNA-prover måste skyddas från ribonukleas-medierad nedbrytning genom användning av nukleasfria reagens och utrustning och genom att hålla dem på is när tinas. För det femte området för standardkurvan som ingår i qPCR analysen måste vara tillräckligt storatt fånga upp alla värden som observerades från de okända proverna. Sjätte bör tekniska replikat inkluderas för både virus-cell-fästparti av analysen liksom qPCR av individuella RNA-prov. Sjunde, kontroller (t.ex. cellinjer som uttrycker hTfR1 eller ej) kan inkluderas för att styra för specificiteten av analysen. Slutligen måste all personal ha lämplig biosäkerhet utbildning och institutionellt godkännande att hantera smitt JUNV C # 1 eller andra patogena arenavirus.
QPCR delen av protokollet efterlyser en qPCR sond i första hand för att säkerställa specificiteten hos den produkt som amplifieras under varje etapp av PCR-reaktionen. Kostnaden för analysen skulle kunna minskas dock genom att eliminera detta qPCR sond till förmån för en annan qPCR kemi som inte kräver en sond (t.ex. användning av den asymmetriska färgämnet SYBR Green I 25) och / eller genom att minska volymen av qPCR reaktionsblandning som används. Om en sond oberoende qPCR appenmört används, skulle det vara viktigt att kontrollera att reaktionsbetingelserna är tillräckligt stränga för att säkerställa specificitet qPCR primers. Det är också viktigt att vara medveten om att arenavirus RNA, om extraheras från celler eller virioner, kan ospecifikt trimmade för att bilda cDNA under RT i frånvaro av ett virusspecifikt RT primer 12. Därför kopiera nummer detekteras med hjälp av en vRNA specifik RT primer inte exakt återspeglar bara vRNA arter som omfattas av RT primer. Om specificitet för genom eller antigenom krävs, har vi rapporterat ett medel att kringgå detta icke-specifik priming fenomen genom användning av biotinylerade RT-primrar och streptavidinpärloma 12.
En viktig styrka med denna analys är dess extrema känslighet. Andra arenavirus-cellvidhäftningsanalyser terar radioaktivt märkt 22, biotinylerad 20 eller fluorescensmärkt 21 partiklar har krävt MOIs av 0,2, 100, eller 1000, respektively. Medan användningen av radioaktivt märkta partiklar resulterar i god känslighet, nödvändiggör det användning av radioaktivitet, vilket ökar de logistiska komplexitet och oro för säkerheten i samband med denna speciella analys. QPCR-baserad metod som beskrivs här kräver så lite som 20 PFU (MOI av ~ 0,0004 i en 48-brunnar) och kan på ett tillförlitligt sätt detektera fastsättning över ett stort dynamiskt område av molekyler av intresse (t.ex. MOI från 0,0004 till åtminstone 40) (Figur 3 ). Den starka känslighet denna analys gör det möjligt att använda låg MOI för mer noggrann mätning av produktiva bindande händelser genom standard smittsamt virus. Den höga känsligheten minskar också avsevärt mängden virus som behövs för analysen, och därigenom begränsar ytterligare hanteringssteg som kan påverka kvaliteten på virioner som används i analysen (t.ex. polyetylenglykol-baserade utfällning av virioner, märkning virioner med fluoroforer eller radioaktiva isotoper och / eller sackaros-bandning av virions). Dessutom är qPCR analysen själv enkelt att utföra samt mycket noggrann och reproducerbar.
Den cellvidhäftningsanalysen beskriven kan modifieras för att mäta ytterligare stadier av viralt inträde inklusive viruspartikel endocytos såväl som det sista steget i virusfusions, som är frisättning av viralt genom in i cytoplasman. För att mäta partikel endocytos, skulle samma steg i den bifogade filen protokoll följas genom steg 2,5, vilket är fästandet av partiklarna till celler vid 4 ° C. Celler skulle sedan värmas för att tillåta virala partiklar som skall endocytoseras, följt av behandling med ett proteas för att skala eventuella externt bundna virioner som inte endocyteras såsom beskrivits 22,24. Avsnitt 3 och 4 i detta protokoll skulle sedan följas för att extrahera viralt RNA och kvantifiera kopior av viralt genomiskt RNA som ett mått på endocytos. För att mäta genom uncoating efter fusion av virala och endosomala membran, skulle cellerna prebound medvirus vid 4 ° C, värmdes (för att tillåta endocytos och fusion) och befriades från externa partiklar, och sedan tas för analys. I ett tillvägagångssätt kan celler lyseras i en isotonisk buffert för att bevara de intracellulära vesiklar, och sedan delas upp i 2 fraktioner: en som skulle behandlas med en cocktail av RNaser (obestruket virala RNA är känslig för nedbrytning) och den andra som inte skulle 39 . Alternativt kan cellerna separeras i cytosoliska eller endosomala fraktionerna 40. I båda fallen skulle QRT-PCR användas för att kvantifiera viralt genom i cytoplasman som ett mått på virusgenom uncoating. Slutligen kan QRT-PCR-analys enkelt modifieras för att studera virus kvarstad, endocytos, eller fusion för andra virus som RT-PCR-reagens är anpassade till det nya viruset av intresse (se till exempel 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, och Benjamin kung för hjälpsamma diskussioner och National Institutes of Health för stöd av dessa studier genom bidrag T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), och P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
