Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53682
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

Introduction

Arenaviruses doğada 1-3, kemirgenlerde esas korunur saran, tek iplikçikli RNA virüslerinden oluşan bir ailesidir. Bu virüsler genellikle kemirgen rezervuarların 1,2 asemptomatik, kalıcı enfeksiyon kurmak olsa da, insanlarda 3 şiddetli hastalığa neden olabilir. Önemli patojenik türler Yeni Dünya Junin virüsü (JUNV) 4 ve Afrika'da Güney Amerika ve Lassa ateş Arjantin hemorajik ateş etiyolojik ajanları sırasıyla, Old World Lassa virüsü 5 içerir. Lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV), ailenin 6 prototipik virüs, dünya çapında bir dağılımına sahiptir ve bağışıklık sistemi baskılanmış olarak immün sistemi sağlıklı bireylerde 6 aseptik menenjit, gelişmekte olan fetusta 7 ciddi doğum kusurlarına veya yüksek öldürücülüğü dahil hastalık durumlarında çeşitli sorumludur solid organ transplantasyonu 8,9 aşağıdaki bireyler. Amerika Birleşik Devletleri eksikliğiGıda ve İlaç İdaresi (FDA) aşılar ya da bu virüs ile mücadele için etkili antiviral tedavi, ortaya çıkan bu / yeniden ortaya çıkan patojenleri hedef yeni stratejiler geliştirmek için kritik ihtiyacının altını çizmektedir -onaylı.

Arenavirüs genomu iki tek-şeritli RNA segmenti, büyük (L) (~ 7.2 kb) ile küçük (S), (~ 3.6 kb) segmentleri 10 oluşur. L kademeli bir viral polimeraz (L) ve matris protein (Z) kodlar ise S kademeli bir virüs nükleoprotein (NP) ve zarf glikoproteini (GP) kodlar. L ve S genomik RNA segmenti (vRNAs) virionlar 10-12 içinde ambalajlandı. Arenavirüs enfeksiyonun başlangıç ​​aşaması, viral parçacıkların ek JUNV için, insan transferin reseptörü 1 (hTfR1) 13,14 içerir viral GP ve karşılık gelen konakçı hücre reseptörleri arasındaki bir etkileşim yoluyla konakçı hücreler sağlamaktır. Bağlanmasının ardından, JUNV parçacıklar klatrin dolayımlı endositoz 15 ile hücre içine alınır.Parçacıklar bu bölmenin düşük pH GP 16,17 aktivasyonunu tetikler geç Endozom sonra trafik. Bir kez viral ve endozomal membranların arasındaki kaynaşmayı başlatarak, GP-kodlanmış füzyon peptid ekler endozomal zarı içine, aktif. Onlar genomik replikasyon ve transkripsiyon için şablon olarak hizmet sitoplazma içine viryon paketlenmiş vRNAs serbest bırakılması Başarılı füzyon sonuçları. Viral yapısal proteinler ve vRNAs yeterli miktarda üretilir, yeni parçacıkların araya ve enfekte olmuş hücreden tomurcuk ömrü 18 tamamlayın.

terapötik patojenik arenaviruses hedeflenecek yeni stratejilerin keşfini kolaylaştırmak için, bizim grup ev sahibi için virüs yayılımı için kritik, ama vazgeçilebilir olan konak faktörlerinin belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Bu bağlamda, bu gibi konakçı faktör ile kontrol virüs ömrü çevrimi kesin aşama (lar) tanımlayan kılavuz için gerekli olanAntiviral stratejilerin geliştirilmesi. Burada, seçilen konakçı proteinleri ve / veya antiviral moleküller viral giriş 19, bu ilk aşamasına etkileyen olmadığının belirlenmesi amacıyla, arenavirüs hücre eki ölçmek için kullanılabilecek bir miktar (Q), RT-PCR bazlı analiz tarif eder. Arenavirüs hücre eki ölçmek için alternatif yaklaşımlar biyotin 20, floresan boyalar 21 veya radyoaktif izotoplar 22 ile etiketlenmiş virionlar özellikli var. Bu yöntemlere dezavantajları, giriş virüsünün büyük miktarlarda radyoaktivite kullanımı (enfeksiyon (MOI) arasında örneğin yüksek çokluklar), ve / veya girdi virüs (örneğin, konsantrasyon ve / veya virüs etiketleme) hazırlanması için ek işleme adımları için gereksinimi içerebilir . Özellikle, yüksek İçişleri kullanımı zor nonprodüktif eki olayları 15,23 karşı üretken ayırt etmek yapar. Burada anlatılan QRT-PCR tabanlı tahlil kadar az 20 olarak plaket kullanılarak eki olaylarını algılayabilirMing birimleri, 48-delikli plaka için 0.0004 MOI anlamına virüs (pfus). Bu nedenle, tahlil güçlü duyarlılığı yüksek İçişleri Bakanlığı için gereksinimi yanı sıra herhangi bir virüs etiketleme ya da konsantrasyon adımları üstesinden gelir. Bundan başka, deney I) viryon endositozu ölçmek hem de sitoplazmaya virüs genomunun serbest bırakılması gibi füzyon şu şekilde uyarlanmış ii) örnekleri için virüs özel QRT-PCR geliştirilmesi yoluyla diğer virüsler ile kullanım için (özel olabilir, bkz 24-27).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: açıklanan protokol (pre-PCR laboratuvarı ve ne kadar iyi öncesi PCR tekniği kullanılarak deneyler kurmak için nasıl mükemmel bir bakış için 28 bakınız) sıkı öncesi PCR tekniği kullanılarak yapılmalıdır önemlidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. Protokolünün bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. 48-iyi Tabaklar Medya ve Tohum Hücreler hazırlayın

  1. 50 ml ilave etmek suretiyle,% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin içeren tam Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde 500 ml (DMEM), ve% 1 HEPES (N-2-hidroksi-N-2-etan sülfonik asit) tampon çözeltisi hazırlayın Isı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 5 ml DMEM 500 ml'lik bir şişe için 100x penisilin-streptomisin ve 100X HEPES tampon çözeltisi, her bir. Bu reaktif 4 ° C'de saklanabilir76; ay bekletilmiştir.
  2. Tam DMEM 500 ul nihai hacimde 48 oyuklu doku kültür plakasına oyuk başına tohum 2.5 x 10 4 Vero E6 hücreleri. 10 ila 18 saat boyunca% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe plakası.
    1. gün sonunda plaka Tohum. ya çoğaltmak veya üç kuyularda her virüs örneği test edin.
      Not: Bu deney için, 48-çukurlu tabanlı bir platform tarif edilmiş olmakla birlikte, 96 veya 384 oyuklu plakalarda aşağı kullanılır tahlili büyütülebilir mümkün olmalıdır.

2. Virüs-hücre Ek Yürüten

Not: Bu protokolde kullanılan virüs JUNV soyu, makaleler, 1. (Cı # 1), başarılı bir şekilde JUNV hastalığının 29 önlenmesi için bir canlı zayıflatılmış bir aşı olarak kullanılmaktadır. JUNV Cı 1. in vivo ve in vitro olarak, her iki seri geçiş ile virülan JUNV streyn XJ türetilen 12 amino asit 30 ebeveyn XJ suşundan farklı edildi. because JUNV C # 1 biyogüvenlik düzeyi (BSL) -2-puan patojendir, bu bölüm için açıklanan çalışma, uygun BSL-2 uygulamaları 31 kullanılarak yapılmalıdır. Bu kişisel koruyucu ekipman (örneğin, göz koruma, laboratuvar mont, çift eldiven), bir sınıf II biyogüvenlik kabini kullanımını içerir ve tüm personelin kurumsal eğitim ve güvenle bu organizmayı işlemek için gerekli onayları aldık sağlamak.

  1. İstenen pfus test edilecek JUNV C # 1 örnek (ler) seyreltin veya buz gibi soğuk komple DMEM oluşturan birimler odak ve her kuyuya eklemek için hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
    Not: Tüm DMEM içinde seyreltilmiş virüs bağlama çalışmaları yapmak için alternatif bir serum virüsü eki ile girişime neden olup olmadığını belirlemek için, düşük serum konsantrasyonu (% 2) ve uygun bir tampon maddesi ile PBS içeren bir minimal ortamda kullanmak gibi. Alternatif virüsler benzer bağlanma protokolleri bicarbo olmayan RPMI 1640 ortam maddesinin kullanımını bildirmiştir% 0.2 sığır serum albümini, 10 mM (2- (morfolino) etansülfonik asit) ihtiva eden Nate, ve 10 mM HEPES, pH 6.8 32. Bu bağlanma ortamı ortam kuluçka CO2-çevre çıkarıldığında ortaya çıkabilir, pH değişiklikleri önlemek için üstün olabilir.
    1. nonprodüktif eki olayları sınırlamak için 200 2,000 arasında değişen pfus ile kuyu inoküle edin. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu deney kadar az 20'ye PFU (veya en çok 6 10 x 2 PFU) ile ek saptayabilir.
    2. hücreleri üzerine aşılama için virüs ana karışımı oluşturun. Her bir virüs örneği göz başına 50 ul hacim içinde suret kuyu üzerine inoküle edilir. oyuk başına virüs 2.000 pfus eklenmesi isteniyorsa, bu nedenle, DMEM tam soğuk buz 120 ul toplam hacmine 4800 pfus seyreltin.
      1. testin özelliğini kontrol etmek için, her iki TfR1 (TRVb) veya EXP ifade yoktur Çin hamsteri yumurtalık hücresi hatları eşleşen bir çift kullanımıbu hücrelere JUNV eki olarak Arş hTfR1 (TRVb-1) düşük ya da sırasıyla 13,33 olmalıdır, ya. Alternatif olarak, arenavirüs eki 34 veya girişi 35 engellemek için böyle proteinaz K gibi bir proteaz hücreleri davranın. Hücrelerle 13,36 içine JUNV girişini engellemek için bilindiği gibi hTfR1 için spesifik olan çözünür hTfR1 ya monocolonal antikor ch128.1, aynı zamanda kabul edilebilir. Ayrıca, serbest manoz 14 veya JUNV spesifik nötralize edici antikorlar 37 partikül inkübasyon hücrelerin ön-muamele virüs girişi inhibe edebilir.
      2. Bu olası bir açıklama olmasına rağmen JUNV girişini engelleme rağmen bu son reaktifler ve yaklaşımlar, eki engellemek için teyit edilmemiş olması, ancak unutmayın. Burada açıklanan protokol resmen bu çeşitli yaklaşımlar darbe virion eki olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.
  2. 37 ° C inkübatör plakaları çıkarın veyer ya da 4 ° C buzdolabı ya da 15 dakika endositoz gerçekleştirmek için kaplama hücrelerinin yeteneğini inhibe etmek için buz üzerinde.
  3. Daha sonra, her bir gözden bitmiş DMEM aspire hızla buz soğukluğunda PBS (fosfat tamponlu tuz), pH 7.4, 100 ul kullanılarak iki kez her bir yıkama. Daha sonra uygun oyuklara (adım 2.1 hazırlanmış) öncesi seyreltilmiş virüs örneklerinin 50 ul ekleyin.
  4. plastik wrap plaka sarın ve hemen geri buz üzerinde veya virüs eki meydana gelmesine izin için 1 saat 1.5 için bir 4 ° C buzdolabında ya yerleştirin. Bu adımı boyunca, 4 ° C'de soğuk plaka tutun yıkama tamponu ve virüs örnekleri.
  5. 4 ° C'de inkübasyonun tamamlanmasından sonra, virüs inokulum aspirat ve buz soğukluğunda PBS 200 ul her bir göze 3 kez yıkayın.

3. Viral RNA Ekstraksiyon

  1. (Örneğin, RNeasy Mini kiti) Accor ticari kit kullanılarak JUNV C # mono tabakaları bağlı 1 parçacıkların viral RNA arındırmaküreticinin protokolüne ding. Özellikle, aşağıda listelenen değişikliklerle RNeasy Mini El Kitabı'nda sayfa 23-28 (4. Baskı, Nisan 2006) üzerine "spin teknolojisi protokolünü kullanarak hayvan hücrelerinden toplam RNA'nın saflaştırılması" izleyin.
    1. Lyse her kuyuya doğrudan lizis tamponu RLT 350 ul ekleyerek adım 1B belirtildiği gibi hücreler. Hücre lizizi sağlamak için bir tampon birkaç kez karıştırılır. hücreleri kolayca bu tamponda parçalanmayabilir ve tam lizis ters mikroskop altında kuyu görüntüleyerek kontrol edilebilir unutmayın.
    2. Kit kolonu (adım 3a) elde edilen hücre lizatının aktarın ve açıklandığı gibi protokol kalanını izleyin. protokol kalan adımları sınıf II biyo-güvenlik kabininin dışında yapılan kiti borular bulaşıcı bir virüs ile kontamine değil sağlanabilir, böylece, bu noktada, virüs lizis tamponu ile nötralize edilmiştir.
    3. Bir addit olan üreticinin protokolüne gelen isteğe bağlı adım 9 DahilSpin sütunun ional santrifüj Tampon RPE olası taşınmasını ortadan kaldırmak için.
    4. Son adımda üreticinin protokolü (adım 10), nükleaz içermeyen GKD 2 O. 30 ul kullanarak spin kolon saflaştırılmış RNA Zehir Mağaza bu noktada 80 ° C'de RNA veya QRT-PCR deneyinde doğrudan kullanımı. nükleazlar tarafından saflaştırılmış viral RNA örnekleri bozulmasını önlemek için, nükleaz içermeyen reaktifler ve ekipman kullanımı ve buz üzerinde eritildi RNA örnekleri tutun.
      Not: Tamponlar RLT ve RW1 guanidin tuzu içeren ve ağartıcı ile karıştırılmamalıdır. Tampon RW1 etanol içerir.

Viral genomunun 4. QRT-PCR Ölçümü

  1. daha sonra qPCR cDNA'ya JUNV Cı 1. S kademeli bir RNA dönüştürmek için 50 ul bir toplam hacim içinde oda sıcaklığına (adım 3.1.4 üretilen), viral RNA tabi.
    1. nuclease 6.75 ul: RT reaksiyonu kurmak için, öncelikle reaksiyon başına aşağıdaki reaktiflerin her içeren bir master karışımı oluşturmakiçermeyen GKD 2, O, RT primer G 2 uM stokunun 5 ul 2098- 2075- S kademeli bir genomik RNA'nın NP bölgesi, 5 ul bir tamamlayıcı olan (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), 10X PCR tampon II, 25 mM MgCl2 çözeltisi 11 ul RT enziminin, RNaz inhibitörü 1 ul (0.4 ünite), 1.25 ul (62.5 Birimleri) ve dNTP 500 uM stokunun 10 ul.
      Not: arenavirüs replikasyon esnasında, 4, viral S kademeli bir RNA türlerinin oluşturulur: tam boy bir genomik RNA (vRNA), tam uzunluklu antigenomik RNA (vcRNA) (diğer bir deyişle vRNA ters tamamlayıcı olan) ve iki alt-genomik mRNA sırasıyla PN ve GP genlerini kodlayan. Burada yer alan RT primeri sadece S segmenti vRNA için spesifik olan, ancak vcRNA NP mRNA veya GP mRNA.
    2. Yavaşça RT ana karışımı karıştırın ve daha sonra tek tek 0.2 ml PCR tüplerine 40 ul bölmeyin. Her tüpe, viral RNA 10 ul ekle. Dahil i) hiçbir şablon kontrol tüpü (örn. Nükleaz içermeyen GKD 2 O 40 ana karışımı uL) ve ii) herhangi bir RT enzim karşılaştırma 10 ul (örneğin almadı ana karışımı 40 ul, bilinen bir pozitif viral RNA numunesinin 10 ul ekle bir RT enzim), viral bir hedef sekansı içeren amplifiye DNA RT reaktiflerin kirlenme taranması için. hücresel RNA mevcudiyetinde deney özgüllük için kontrol tamamına RT ana karışımı ile enfekte olmamış hücrelerden çıkarılan RNA içerir.
    3. Buna ek olarak, RT reaktiflerin kalitesini doğrulamak için tam ana karışımı bilinen pozitif viral RNA örnek sayılabilir. gerektiğinde RT reaksiyon hacmi 25 ul indirgenebilir unutmayın.
  2. Aşağıdaki bisiklet koşulları RT tüpler Konu: 25 ° C, 10 dakika, 30 dakika boyunca 48 ° C, 5 dakika için 95 ° C. Numuneler 4 ° C'de adım eklenmesi ile bu noktada -20 ° C'de saklandı veya PCR gece boyunca bırakılabilir unutmayın.
  3. P25 ul bir toplam hacimde erform qPCR.
    1. Aşağıdaki birleştirerek bir qPCR ana karışımı yapmak: her S1937 + 1958+ ileri PCR primeri (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') (9 uM stoklar) 2.5 ul ve ters PCR primeri G 2001 için 1982 (5 için qPCR prob S 1960+ arasında '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2 uM stokunun 2.5 ul () 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') ve 2X genel qPCR ana 12.5 ul karıştırın. JUNV C # 1 için spesifik burada bildirilen ileri primer, nt öldürücü JUNV zorlanma Romero hedef başlangıçta bildirilen primer dizisinin 38 dan 1 ile farklı olduğunu unutmayın.
    2. Yavaşça çözüm karıştırmak ve sonra her bir qPCR 20 ul ekleyin. Uygun QPCR çukurlara, her bir RT reaksiyonu 5 ul ekle. Test edilen her bir numune için üç kopya halinde qPCR yürütün. Gerekirse PCR reaksiyon hacmi az 12.5 olduğu ul indirgenebilir unutmayın.
      Not: ile bağlantılı yazılımqPCR makinesi QPCR primer hedef JUNV Cı 1. NP genini kodlayan plasmid standart seyreltilmiş bir dizi her bilinmeyen numune değerinin karşılaştırılmasıyla JUNV Cı 1. S kademeli bir genomik RNA'nın mutlak kopya sayıları üretir ve sonda ayarlayın. qPCR testi sadece standart eğri aralığı içinde değerleri kantitatif sağlayabilir. 5, 50 x 10 3 5, 5 x 10 5, 5 x 10 7 adet çukur başına Bu nedenle, aşağıdaki gibidir (üçlü kuyucuklara) plazmidinin miktarlarını içerir.
  4. ısıl olarak qPCR plaka yükleme ve aşağıdaki reaksiyon koşulları çalıştırın: 95 ° C, 10 dakika, 15 saniye, 1 dakika için 60 ° C, 95 ° C, 40 çevrim için.
    1. Toplama ve üreticinin protokolüne uygun olarak, her numune viral RNA mevcut miktarını belirlemek için veri analizi.
  5. qPCR katran ihtiva eden plazmit, bir yeni saflaştınldı numune kullanılarak bir standart eğri oluşturmak içindizisi olsun, öncelikle bu çözelti içinde plazmid kopya sayısını belirlemek.
    1. plazmidin moleküler ağırlığı hesaplamak. Tüm plazmidin dizisi biliniyorsa, aşağıdaki formülü kullanarak bu hesaplayın: MW = ([A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61,13). çift ​​sarmallı plazmid her iplikçik üzerinde bulunan belirli bir nükleotid toplam sayısını eklemeyi unutmayın.
    2. plazmid büyüklüğü bilinen ama onun tam sırası değil ise, her dsDNA baz çifti 600 MW vardır varsayımı altında MW hesaplayın.
      Not: Burada kullanılan pCAGGS-JUNV C # 1 NP plazmid 4.2 x 10 6 Bir MW vardır.
    3. plazmidin MW belirlendikten sonra, ul başına çok sayıda kopya plazmid hazır çözelti içinde mevcut olduğunu hesaplayabilir.
    4. İlk çözelti içinde plazmid toplam ug hesaplamak, daha sonra plazmid mol bu dönüştürmek (plazmid 69 mikrogram daha sonra su 300 ul, 6,9 x 1 içerdiği, örneğin eğerKopya sayısı dönüştürülebilir plazmid * 1 mol 0 5 g / plazmid 4.2 x 10 6 g = plazmid 1.6 x 10 -11 mol), (örneğin, plazmid 1.6 x 10 -11 mol * 6,022 x, 10'dan 23 moleküller / mol = 9.8 x 10 12 molekülleri (veya kopya)).
    5. Ul başına kopya elde etmek için bu çözeltinin hacimce plazmid çözeltisi plazmidin toplam kopyalarını bölün (örneğin 9.8 x 10 12 kopya / 300 ul = 3.28 x 10 10 kopya).
    6. 5 ul hacim standart eğri oluşturmak için gerekli kopyalama sayı aralığı sağlamak için PCR plakasına yerleştirilir, böylece uygun bir şekilde, bu solüsyon ile seyreltilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokol bölüm 4'te tarif edildiği gibi qPCR tahlilin hassasiyetini ve dinamik aralığını göstermek için, JUNV Cı 1. (aralık 5-5 x 10 7 kopya) NP genini kodlayan bir plazmid bilinen miktarlarda qPCR tabi tutuldu. Deney hassastır ve güvenilir bir şekilde, hedef nükleik asidin 5 kopya (Şekil 2) gibi birkaç algılayabilir. Şablonun en az 7 günlükleri kapsayabilir, Şekil 2'de de gösterildiği gibi, tahlilin dinamik aralık, büyük ve. Gösterilmemiş olsa da, biz nükleik asidin birçok 9 10 x 5 olarak nüsha olarak tespit ettik.

protokolde tarif edildiği gibi JUNV Cı 1. Parçacık bağlanma ölçümü için tahlil yararlılığını göstermek için, JUNV C # 1, çeşitli miktarlarda Vero E6 hücreleri ön bağlıdır edildi. Bağlanmamış parçacıkları yıkandıktan sonra, hücreler, RNA saflaştırma için lize edildi ve elde edilen RNA numuneleri qRT tabi tutuldu-PCR. Şekil 3'te gösterildiği gibi, deney kadar az 20 ya da sırasıyla, 0.0004 ve 40 arasında Mõis çevirir kadar 10 x 2 6 PFU kullanılarak viral bağlanma olaylarını algılayabilir.

Şekil 4'te gösterildiği gibi, virüs eki ölçmek için sadece protokolü değiştirmek mümkündür, ancak, aynı zamanda, zaman içinde, gelen, viral parçacıklar içinde bulunan genom amplifikasyonu oranı. Bu modifiye yaklaşım, viral giriş (örneğin, parçacık endositoz ve / veya füzyon ve sitoplazma içine viral genomun serbest) kalan adımları de kusurlar meydana olabilir olup olmadığını belirlemek için bir vekil olarak kullanılabilir. İlginç bir şekilde, viral genomun miktarı gelen, viral genomun bir bölümü bozulmuş olduğunu göstermektedir, ilk 6 saat takip bağlanma sırasında azaltmak için görünür. Bu extracell hücre içine alınacak başarısız ve aşağılamak parçacıkların olabilirdinitlerin boşluk veya belki de endolysosomal ağı içinde bozulmaya. Gösterilen veriler 12 veya 18 saat sonrası enfeksiyon aktif genom replikasyonu için taranması için en uygun zamanlar olacağını göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. Protokol iş akışının Tasvir virüs-hücre bağlanma tahlili birincil adım 1) 4 ° C'de hücrelerle virüs parçacıklarının inkübasyon bağlanmamış virüs virüs-hücre bağlanma yıkama yapılmıştır yapılmasına izin vermek için olan, 2), saflaştırma, hücrelerinden viral RNA'nın, 3) ters transkripsiyon (RT) JUNV S kademeli bir genomik RNA (cDNA'ya vRNA) ve 4) qPCR virüs-hücre eki bir ölçüsü olarak JUNV S vRNA kopyalarını numaralandırmak dönüştürmek. burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.


Şekil 2:. JUNV S kademeli bir genomunun saptanması için qPCR deney duyarlıdır ve geniş bir dinamik aralık üzerinde kullanılabilir JUNV S kademeli qPCR primer prob seti doğru bilinen miktarlarını ölçmek yeteneği için test edilmiştir (5, 16.6, 50, hedef sekansı kodlayan bir DNA standart kontrol plazmidinin x 10 3 5, 5 x 10 5, ya da 5 x 10 7 kopya). Amplifikasyon araziler (A) ve standart eğri fit hatları (B) Tasvir. R2, primer-prob seti korelasyon katsayısı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: JUNV hücre bağlanma tahlili güvenilir önlemlergibi az 20 kadar PFU. Vero E6 hücreleri kullanılarak partikül bağlanma JUNV C # bilinen miktarlarda 1 (2 x 10 1 ön bağlıdır x 10 2 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 X 10 5, veya 2 edildi x 10 6 pfu), 4 ° C'de 1.5 saat karıştırıldı. Bağlanmamış parçacıklar yıkanarak uzaklaştırılmış, hücreler RNA ekstraksiyonu için lize edildi ve elde edilen RNA numuneleri Vero E6 hücreleri parçacık ek bir önlem olarak JUNV Cı 1. S kademeli vRNA tespit etmek için QRT-PCR tabi tutuldu. Veri ± SEM yinelenen kuyulardan kuyu başına ortalama kopya sayısını temsil.

Şekil 4,
Şekil 4:. Enfeksiyondan sonra JUNV Cı 1. genom replikasyonu kinetiği Vero E6 hücreleri, 4 ° C'de 1.5 saat boyunca 2 x 10 3 PFU JUNV C # 1 (0.04 MOI) inkübe edilmiştir. buz soğukluğunda PBS içinde bir kaç yıkamadan sonra hücreler ya hemen hasat edilmiştir (0 saat zaman noktasında)veya toplanmadan önce belirtilen zamanlarda boyunca 37 ° C'de ısıtıldı. Her bir durumda, toplam RNA, hücrelerden ekstrakte edildi ve JUNV Cı 1. S kademeli vRNA tespit etmek için QRT-PCR işlemine tabi tutulur. Değerler ± SEM yinelenen kuyulardan kuyu başına ortalama kopya listelenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

biz tarif protokol basittir ve sağlam aşağıdaki kritik hususlar görülmektedir sağladı. İlk olarak, sıkı öncesi PCR tekniği (mükemmel bir inceleme için 28 bakınız) istihdam edilmelidir. Tüm reaktifler ve ekipmanlar qPCR hedef sekansı içeren amplifiye DNA içermeyen ve uygun kontrol gibi kirlenmesini tespit etmek için bir yerde olması önemlidir. İkinci olarak, iletişim kuralı, virüs, hücreler ve ortamın virüs-hücre bağlanma bölümü için yüzeyine bağlı viryonlann endositoz önlemek için 4 ° C'de tutulmalıdır. Üçüncü olarak, RNA ekstraksiyonu için toplanan hücrelerin miktarı RNA saflaştırma filtre RNA bağlama kapasitesi aşmamalıdır. Dördüncü olarak, saflaştınlmış viral RNA numuneleri nükleaz içermeyen reaktifler ve ekipman kullanılarak ve eritildiğinde buz üzerinde tutarak ribonükleaz aracılı bozulmaya karşı korunmalıdır. Beşinci olarak, standart eğrinin aralığı yeterince büyük olmalıdır qPCR deneye dahilBilinmeyen örneklerden gözlemlenen tüm değerleri yakalamak için. Altıncı olarak, teknik çoğaltır tahlilin virüs-hücre bağlanma bölümü gibi bireysel RNA örneklerinin qPCR hem dahil edilmelidir. Yedinci olarak, kontrol (hTfR1 ifade ya da örneğin hücre hatları) testin özelliğini kontrol etmek için dahil edilebilir. Son olarak, tüm personelin uygun biyogüvenlik eğitimi ve bulaşıcı JUNV C # 1 ya da diğer patojenik arenaviruses işlemek için kurumsal onayını almalıdır.

Bir qPCR prob öncelikle ürünün özgünlüğü PCR reaksiyonu her aşamasında yükseltilen sağlamak için protokol qPCR bölümü çağırır. Tahlilinde maliyeti (örneğin asimetrik boya SYBR Green I 25 kullanılması) ve / veya hacmini azaltarak bir sonda gerektirmeyen bir qPCR kimya lehine bu qPCR prob ortadan kaldırarak, bununla birlikte, azaltılabilir qPCR reaksiyon karışımı kullanılır. Bir sonda bağımsız qPCR app varsaRoach reaksiyon koşulları qPCR primerleri özgüllüğünü sağlayacak kadar katı olduğunu doğrulamak için önemli olacaktır, kullanılır. Arenavirüs RNA hücrelere veya virionlar ekstre olup, spesifik olmayan bir virüs özel RT primer 12 yokluğunda RT sırasında cDNA oluşturmak için astarlanabilir farkında olması da önemlidir. Bu nedenle, kesinlikle RT astar tarafından hedef sadece vRNA türleri yansıtmamaktadır bir vRNA özgü RT primeri kullanılarak tespit numara kopyalamak. Genom için özellik veya antigenome gerekli olduğu için, biyotinile edilmiş RT primerleri ve streptavidin boncuk 12 aracılığıyla, bu non-spesifik hazırlama fenomen aşmak için bir araç rapor var.

Bu testin önemli bir gücünü aşırı duyarlılığıdır. Içeren diğer arenavirüs hücre bağlanma tahlilleri, ilgili 20 biyotinile edilmiş veya 21 partiküller 0.2 Mõis, 100, ya da 1000 gerektirmiştir floresan etiketli, 22 radyoaktif ile etiketlenmişly. İyi duyarlılıkta radyoaktif etiketli partiküller sonuçların kullanımı olsa da, bu özel tahlil ile ilgili lojistik karmaşıklığı ve güvenlik endişeleri artırmaktadır radyoaktivite kullanımını zorunlu kılmaktadır. Burada açıklanan qPCR göre yöntem, az (48-çukurlu plaka içinde 0.0004 ~ MOI) PFU 20 olarak ve güvenilir Mõis geniş bir dinamik aralık üzerinde ek algılayabilir (0.0004 örn Mõis için en az 40) (Şekil 3, ). Bu testte güçlü duyarlılığı sayesinde, standart bulaşıcı bir virüs üretici bağlama etkinlikleri Daha kesin ölçüm düşük Mõis kullanımı kolaylaştırır. Yüksek hassasiyet de önemli ölçüde ile virionlar etiketleme, tahlil için gerekli virüs miktarını azaltır ve bunu yaparken, virionlarına kalitesini etkileyebilir ek işleme adımları (deneyde virionlar örneğin polietilen glikol bazlı yağış kullanılan sınırlar flüoroforlar veya radyoaktif izotopları ve / veya virio sükroz-bantns). Buna ek olarak, qPCR tahlil kendisi son derece doğru ve tekrarlanabilir yanı sıra gerçekleştirmek için basittir.

tarif edilen hücre-bağlanma deneyi, viral partikül endositoz olarak sitoplazmaya viral genomun sürümüdür virüs füzyonu ve son aşamada, aşağıdakileri içeren viral giriş ek aşamaları ölçmek için modifiye edilebilir. Parçacık endositoz ölçmek için, bağlanma protokolü aynı adımlar 4 ° C'de hücrelere parçacıkların eki olan adım 2.5, ile takip edilecektir. Hücreler daha sonra, viral partiküller 22,24 tarif edildiği gibi endocytosed değil, herhangi bir dıştan bağlı virionlar şerit bir proteaz ile muamele edilir, endositoz izin ısıtıldı olacaktır. Bölüm 3 ve bu protokolün 4 sonra viral RNA ayıklamak ve endositoz bir ölçüsü olarak viral genomik RNA'nın kopyalarını ölçmek için takip edilecektir. viral ve endozomal membran füzyonu, aşağıdaki genom olmama ölçmek için, hücreler ön bağlıdır olacaktır4 ° C'de virüs (endositoz ve füzyon izin vermek için) ısıtıldı ve bu dış parçacıkların ayrıştırılmış ve daha sonra analiz için toplanmıştır. Bir yaklaşımda, hücre içi veziküller korumak ve daha sonra 2 bölüme bölünmüş bir izotonik tampon maddesi içinde lize edilebilir: (kaplanmamış viral RNA'nın bozunmaya hassas olan) RNases bir kokteyli ile tedavi edilebilecektir diğeri bu olmaz 39 . Seçenek olarak ise, hücreler, sitosolik veya endozomal kesirler 40 ayrılabilir olabilir. Her iki durumda da, QRT-PCR viral genomun olmama bir ölçüsü olarak sitoplazmada viral genomu miktarını belirlemek için kullanılır. Son Mah-PCR yöntemi kolayca (örnekler 24-27 bakınız) ilgi yeni virüs uyarlanır RT-PCR reaktifler sağlanan diğer virüsler için virüs eki, endositoz, ya da füzyon incelemek için modifiye edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Biz hibe T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB), ve P20RR021905 aracılığıyla bu çalışmaların destek için yararlı tartışmalar ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (JB) için Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce ve Benjamin Kral teşekkür .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Life Technologies 11965-118
Penicillin-Streptomycin Life Technologies 15140-163 100x
HEPES Buffer Solution Life Technologies 15630-130 100x
PBS pH 7.4 Life Technologies 10010-023 1x
Vero E6 cells American Type Culture Collection CRL-1586
Costar 48-well plate Corning 3548
RNeasy mini kit Qiagen 74106 do not mix buffers RLT or  RW1 with bleach
QIAshredder homogenizer Qiagen 79654
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4326614
Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) Life Technologies 4311235
dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) Life Technologies N808-0260
GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution Life Technologies N808-0010
RNase Inhibitor (5000U/100 µl) Life Technologies N808-0119
RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’		 Integrated DNA Technologies 250 nmol DNA oligo standard desalting
Forward qPCR primer  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ Life Technologies 4304971 standard desalting
TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ Life Technologies 4316033 HPLC purified
MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) Life Technologies 4346906
StepOnePlus Real-Time PCR System Life Technologies 4376598 or other qPCR instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
  2. Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
  3. Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
  4. Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
  5. Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
  6. Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
  7. Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
  8. Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
  9. Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
  10. Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
  11. Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
  12. Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
  13. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
  14. Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
  15. Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. Characterization of Junin arenavirus cell entry. J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).
  16. Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
  17. Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
  18. Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
  19. Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
  20. Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
  21. Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
  22. Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
  23. Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
  24. Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
  25. Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
  26. Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
  27. Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
  28. Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
  29. Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
  30. Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
  31. Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
  32. White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
  33. McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
  34. Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
  35. Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
  36. Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
  37. Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
  38. Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
  39. Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
  40. Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).

Tags

İmmünoloji Sayı 109 arenavirüs Junin virüsü lenfositik koryomenenjit virüsü virüs hücre eki bağlayıcı virüs hücre virüs eki viral partikül eki kantitatif RT-PCR düşük İçişleri Bakanlığı yüksek hassasiyet virüs girdi
Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klaus, J. P., Botten, J. Highly… More

Klaus, J. P., Botten, J. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (109), e53682, doi:10.3791/53682 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter