Protocol
1. Fastholdelse af Self-fornyelse i IMOP Cells
- Forbered iMOP dyrkningsmedier: DMEM / F12, 1 x B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin og 20 ng / ml bFGF. Lav 50 ml iMOP dyrkningsmedier hjælp sterile reagenser. Varm op 49 ml DMEM / F12 i et 50 ml konisk i et 37 ° C vandbad.
- Thaw 50X B27 supplement og filtersteriliserede 100 mg / ml carbenecillin portioner i 5 minutter i et 37 ° C vandbad. Tø 100 ug / ml bFGF alikvot ved stuetemperatur. Tilsæt 1 ml 50X B27, 10 pi 100 ug / ml bFGF og 12,5 pi 100 mg / ml carbenecillin i DMEM / F12.
- Brug 3 ml medium i en 60 mm vævskulturskål til dyrkning iMOP celler. Føj frisk medier til kulturer hver anden dag ved at fordoble mængden af medier. Sørg for, at koncentrationen af bFGF ikke falder til under 5 ng / ml.
- Kultur iMOP celler ved 37 ° C med 5% CO 2. Passage celler efter 5 - 7 dage i kultur som anført i nedenstående trin. Overførsel kultur til en 15ml konisk anvendelse af en 10 ml pipette tip.
- Lav 1 mM EDTA i HBSS ved at fortynde 0,1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 i 50 ml HBSS. Pre-varme 1 mM EDTA fremstillet i HBSS i et 37 ° C vandbad.
- Harvest celler ved hjælp af tyngdekraften sedimentering eller centrifugering ved 200 x g i 5 min. ved stuetemperatur. For tyngdekraft sedimentering, placere 15 ml konisk indeholder kulturer i 37 ° C inkubator i 5 - 10 min. Efter den tid, observere otospheres samles i bunden af 15 ml konisk.
BEMÆRK: Overdreven centrifugalkraft kan forårsage celleskader. - Forsigtigt aspireres brugt medier ved anvendelse af en 2 ml pipette opsugning uden at forstyrre cellepelleten. Tilsæt 0,5 ml forvarmet 1 mM EDTA HBSS løsning cellepellet. Ved hjælp af en P1000 pipette forsigtigt pipetteres op og ned 2 - 3 gange. Placer konisk ved 37 ° C og inkuberes i <5 min at lette dissociation i enkelte celler.
- Vend forsigtigt cellen løsning til at afgøre, om otospheres dissocieres. Hvis der ikke otokugler sedimenterer til bunden af den koniske cellerne dissocieres. Inkubationstiden kan variere.
BEMÆRK: Langvarig inkubation med EDTA vil resultere i overdreven celledød. - Fjerne celler fra 37 ° C, tilsættes 2 ml medium at neutralisere og fortyndede EDTA. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer ud fortyndet EDTA under anvendelse af en 2 ml pipette og opsugning tilsættes 5 ml 1 x PBS at vaske cellerne.
- Spin celler ned ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og aspireres ud 1X PBS under anvendelse af en 2 ml pipette opsugning. Resuspender cellerne under anvendelse af en pipette P1000 i 0,5 ml iMOP dyrkningsmedier ved forsigtigt at pipettere op og ned 2 - 3 gange.
- Tæl celler ved hjælp af en mikrofluid partikeltæller med de relevante kassettebånd 28. En sammenflydende plade af iMOP celler vil indeholde ~ 6 X10 6 celler. Fortynd celler 1: 100 i medier og tilsæt 75 ul af celle opløsningen i kassetten til tælling. Plade 1 x 10 6 celler i en 6 cm skål i iMOP culture medier (~ 1: 10-fortynding). Passage iMOPs hver 5 - 7 dage.
BEMÆRK: celler, der danner store otospheres eller fastgøres på bunden af vævskulturskål vil differentiere. Celler vil også dø, hvis kulturerne er over sammenflydende.
2. nedfrysning og optøning IMOP Cells
- Forbered syntetisk frysning medium ved optøning og ækvilibrere opløsningen til 4 ° C før frysning celler.
- Indsamle celler fra et konfluent 6 cm skål af iMOP celler. Anvend en 10 ml pipette og overførsel celler (~ 6 - 8 x 10 6 celler) i et 15 ml konisk.
- Harvest celler ved hjælp af tyngdekraften sedimentering eller centrifugering ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Hvis otospheres er lille, vil cellerne ikke nøjes med tyngdekraft sedimentering. Valgfrit: Tæl celler ved hjælp trin 1.9 til bestemmelse af samlet celle numre.
- Aspirer brugte medier ved hjælp af en 2 ml pipette opsugning samtidig med at løse cellepellet bag.
- Tilføj 0,25 ml af syntetiske frysning medier til at resuspendere ceLLS ved en densitet på ~ 5 x 10 5 til 3 x 10 6 celler / ml. Pipettere Forsigtigt celler med en P1000 pipette. Overfør cellesuspensionen til kryogene hætteglas ved hjælp af en pipette P1000 med 1 ml filtreret tip.
- Placer hætteglassene i en alkohol fri kølecontaineren og placere kølecontaineren ved -80 ° C for at reducere temperaturen 1 ° C per minut, indtil temperaturen når -80 ° C.
- For langtidsopbevaring af celler, overføre hætteglassene til dampfasen af en flydende nitrogen lagertank. At tø op celler til kultur, i ligevægt kryogene hætteglas indeholdende frosne celler ved -80 ° C.
- Pre-varme iMOP kulturmedier i et 37 ° C vandbad.
- Optø den frosne hætteglas hurtigt ved at hvirvle bunden af hætteglasset i et 37 ° C vandbad. Tilsæt 1 ml forvarmet iMOP kulturmedier til optøede celler, når den sidste is krystal forsvinder. Overfør celler i en 15 ml konisk og tilføje yderligere 4 ml iMOP dyrkningsmedier
- Spin 15 ml conisk i 5 minutter. ved 200 xg og aspireres de brugte medier. Resuspender cellerne i 2 ml iMOP dyrkningsmedier og plade celler i en 6 cm skål. Inkuber kulturer ved 37 ° C med 5% CO2 i ekspansion.
3. Differentiering IMOP celler i Sensory epitel
- Forbered 50 ml iMOP sensoriske epithel differentiering medier: DMEM / F12, 1X B27 supplement, 25 ug / ml carbenecillin. Lav 50 ml iMOP sensoriske epithel differentiering medier. Varm op 49 ml DMEM / F12 i et 50 ml konisk i et 37 ° C vandbad. Thaw 50X B27 supplement og 100 mg / ml carbenecillin portioner i 5 minutter. i et 37 ° C vandbad. Tilsæt 1 ml 50X B27 og 12,5 pi 100 mg / ml carbenecillin i DMEM / F12.
- At høste, dissocierer, resuspender og tælle celler Gentag trin 1,4-1,9
- Plade 1 x 10 6 celler i en 6 cm skål på dag -3 hjælp iMOP kulturmedier. På dag 0, kulturer transfer anvendelse af en 10 ml pipette i et 15 ml konisk. Opsaml otokugler af gravitationssedimentation som angivet i trin 1.6. Aspirer ud brugt medier ved anvendelse af en 2 ml pipette og opsugning forlade otospheres på bunden af den koniske.
- Tilføje forsigtigt i 2 ml sensoriske epithel differentiering medier. Overførsel otospheres til en 6 cm skål med en stor boring 10 ml pipette.
BEMÆRK: Mekanisk klipning fra barske pipettering kan dissociere celler fra otospheres. - Tilsæt 2 ml frisk sensoriske epitheldifferentiering medier til kulturer hver anden dag. Hvis det er nødvendigt, kan cellerne blive indsamlet ved hjælp af tyngdekraften sedimentation og medier udskiftes.
- Saml otospheres på Dag 10 ved at overføre til en 15 ml konisk og lade otospheres til sediment som angivet i trin 1.6.Aspirate det brugte medie ved hjælp af en 2 ml opsugning pipette og forlade otospheres uforstyrret.
- Fix otospheres ved inkubation i 4% formaldehyd i 1X PBS i 15 minutter ved stuetemperatur. Fjern formaldehydopløsning, vask otospheres med vaskebuffer (PBS 1X indeholdende 0,1% Triton X-100) før inkubering i blokeringsbuffer (1X PBS indeholdende 10% normalt gedeserum og 0,1% Triton X-100) i 1 time.
- Erstat puffer og inkuberes prøver i blokeringsbuffer med fortyndet antistof. Der inkuberes ved 4 ° C. Vask prøver med 1X PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 Emne otosphere til immunfarvning 27. Overfør otospheres i 1X PBS og placere otospheres i montering medier på et objektglas ved hjælp af en P1000 pipette. Sæt et dækglas over prøven og tillade montering medier tørre ved 4 ° C.
- Acquire epifluorescens billeder ved hjælp af et inverteret mikroskop setup udstyret med en 16 bit CCD-kamera og enten en 20X 0,75 luft eller en 40X 1.3 NA oliebestandighedsobjektets. Saml fluorescens fra forskellige farvekanaler ved hjælp af den opført (excitation og emission) bølgelængder: blå (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), grøn (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rød (562 ± 20 nm / og 625 ± 20 nm) og infrarød (628 ± 20 nm / og 692 ± 20nm).
4. En analyse Edu Indbygning
- På dag -3, plade 1 x 10 6 iMOP celler i en 6 cm skål. Tre dage senere på dag 0, høst, dissocierer, resuspender og tælle celler ved at gentage trin 1,4-1,9.
- Plade 2,5 x 10 5 celler i iMOP dyrkningsmedier og 5 x10 5 celler i sensorisk epithel differentiering medier i forskellige brønde i en 6-brønds skål.
- Bestem procentdelen af celler i S-fasen Edu inkorporering på dag 3 ved hjælp af en Edu inkorporering assay
- Tilføj edu lager direkte til iMOP kulturer for at opnå en slutkoncentration på 1 uM edu i dyrkningsmedierne.
- Inkuber edu i iMOP kulturer i 2 timer og inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2. Høst, dissocierer og indsamle celler gentage trin 1,4-1,9. Tilføj i 4% formaldehyd i 1X PBS i 15 minutter. ved stuetemperatur til at fastsætte celler. Harvest celler ved centrifugering ved 200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern formaldehydopløsning og properly disponere.
- Label kerner af celler med Hoechst og indarbejdet Edu med grøn fluorescens farvestof-azid ifølge producentens protokol.
BEMÆRK: Alle vaske er færdig med 1X PBS, 3% BSA og 0,1% Tween 20. Vask cellerne med 1X PBS to gange. - Mount celler på et dias ved hjælp antifade reagens og placere et 1,5 dækglas over prøven. Erhverve fluorescerende billeder af mærkede celler under anvendelse af en epifluorescensmikroskopi.
5. Differentiering IMOP-afledte neuroner
- Lav 50 ml neuronal differentiering medierne: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-glutamin. Thaw flaske 50X B27 og 200 mM L-glutamin i 37 ° C vandbad i 5 minutter. Tilføj 1 ml 50X B27 og 0,5 ml 200 mM L-glutamin til 48,5 ml Neurobasal media.
- Coat dækglas ved at placere 12 mm runde dækglas 1,5 i en steril 10 cm plade og tilføje 70% EtOH til pladen til steriliseret og rengøre dækglassene.
- Ryst forsigtigt Noretrslips at sikre, at de er dækket i ethanol. Efterlad pladen i 10 minutter ved stuetemperatur. Skyl dækglas 3 gange med sterilt 1X PBS til at vaske ud den resterende ethanol. Skyl dækglasset gang med sterilt H 2 0 at udvaske resterende 1X PBS.
- Aspirer H 2 0 ved hjælp af en 2 ml pipette opsugning og lad dækglassene tørre. Udsætte dækglas for UV-lys i vævskultur hætte i 15 minutter. Opbevar dækglas i et sterilt miljø, hvis ikke umiddelbart anvendes.
- Placer en 12 mm runde dækglas i hver brønd i en 24 brønd fad. Ryst pladen forsigtigt for at sikre, at dækglassene ligge fladt på bunden af brønden.
- Tø 2 mg / ml poly-D-lysin-stamopløsning ved stuetemperatur og fortyndes til en 10 ug / ml poly-D-lysin koncentration i 1X PBS. Tilføj 0,25 ml 10 ug / ml poly-D-lysin til brøndene. Efterlad pladen i 37 ° C inkubator i 1 time.
- Vask brøndene 3 gange med sterilt 1X PBS. Thaw 10 mg / ml laminin stamopløsning ved RT og fortyndes til 10 ug / ml i 1X PBS. Tilføj 0,25 ml 10 ug / ml laminin arbejdsopløsning i en enkelt brønd i en 24-brønds multi skålen. Inkubér pladen ved 37 ° C inkubator. Aspirer ud laminin opløsning under anvendelse af en 2 ml pipette opsugning.
- Vask dækglasset 3 gange med 1X PBS ved tilsætning i 1 ml 1X PBS med en P1000 pipette og fjernelse af 1X PBS ved sugning med en 2 ml pipette opsugning. Efterlad 1X PBS fra sidste vask i brønden, indtil cellerne er klar til at blive belagt. Indled neuronal differentiering ved høst, dissociering og tælle celler i trin 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm skål på dag -3.
- På dag 0, høst, dissociere og tælle celler ved at gentage 1,4-1,9. Seed 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 iMOP celler i 0,5 ml foropvarmet neuronal differentiering medier per brønd i en 24-brønds multi skålen. Aspirer og tilføj foropvarmet neuronal differentiering medier til kulturer hver anden dag.
- Fix iMOP-afledte neuroner i 4% formaldehyd i 15 minutter. -entRT på dag 7. Fjern formaldehydopløsning, vask iMOP-afledte neuroner med vaskebuffer (PBS 1X indeholdende 0,1% Triton X-100), før inkubering i blokeringsbuffer (1X PBS indeholdende 10% normalt gedeserum og 0,1% Triton X-100) i 1 time.
- Erstat puffer og inkuberes prøver i blokeringsbuffer med fortyndet antistof. Der inkuberes ved 4 ° C. Vask prøver med 1X PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 angående celler til immunfarvning 27. Vask dækglas med 1X PBS før du placerer på montering medier. Lad monteringsmedie tørre ved 4 ° C før erhverve epifluorescens billeder som anført i trin 3.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
bFGF Tilbagetrækning Fald spredning i IMOP Cells
For at formindske proliferative kapacitet iMOP celler og initiere differentiering af iMOP celler blev bFGF trukket fra kulturerne. For at bekræfte, at tilbagetrækning vækstfaktor nedsætter spredning, blev Edu inkorporering ansat som proliferationsanalyse. Procentdelen af celler, som indarbejdet edu fra otospheres dyrket med iMOP dyrkningsmedier (indeholdende bFGF) og otospheres dyrket i sensorisk epithel medier (uden bFGF) blev sammenlignet. Otosphere kulturer blev pulseret med nukleotidanalogen edu, høstet og fast. Incorporated edu nucleotider blev fluorescensmærket med AlexaFluor 488 azid ved hjælp af klik-kemi. Celler fra otospheres dyrket i fravær af bFGF viste nedsat inkorporering af edu forhold til celler dyrket med bFGF (figur 1A-F). Som størrelsen of otosphere steg, var det stadig vanskeligere at visualisere alle cellerne fra otosphere med en epifluorescensmikroskop. For at løse dette, blev celler dissocieret og monteret således, at de kan entydigt visualiseres en masse. Selv efter dissociation og fiksering, cellerne igen sammen. For at opretholde cellerne i en dissocieret tilstand blev rengøringsmidler, der forhindrede cellerne fra re-aggregerende testet. Tween 20 var en af de detergenter, der forhindrede fornyet aggregering af cellerne. Dissocierede celler blev vasket med 0,1% Tween 20 og monteret på objektglas. Edu mærkede celler blev derefter visualiseret ved epifluorescensmikroskopi (figur 1G, H). Repræsentative resultater fra individuelle forsøg (n = 5) viste et signifikant fald i andelen af edu mærkede celler fra 48% til 19% efter 3 dage efter bFGF tilbagetrækning (p <0,005). Disse resultater bekræfter et dramatisk fald i procentdelen af celler i S-fase og proliferative potentiale iMOP celler efterbFGF tilbagetrækning.
IMOP-afledte Sensory epitel Express Cdkn1b og Show morfologiske ændringer
En tidslinje for iMOP sensorisk epithel differentiering protokol er vist (figur 2A). Otospheres fra proliferative kulturer blev dissocieret til enkelte celler og lov til at komme sig i 3 dage i iMOP kulturmedier. Denne metode hjælper berige for prolifererende celler og vælger mod post-mitotiske celler i disse udgangsmaterialer kulturer. Efter 3 dage blev nydannede otospheres podet i sensorisk epithel differentiering medier og fik lov til at gennemgå unguided differentiering i 10 dage. Lysfelt billeder af typiske kulturer indeholdende otospheres på forskellige tidspunkter efter podning viste en indledende nedgang i størrelse, før otospheres begynde at stige i størrelse (figur 2B-E).
27. For at bestemme om ekspression af Cdkn1b (p27 KIP) kan anvendes som en markør for differentiering, blev otospheres fra proliferative eller sensoriske epiteler differentieret iMOP kulturer sammenlignes. Fluorescerende markører blev visualiseret og fanget af epifluorescensmikroskopi. Repræsentative billeder af otospheres fra proliferative kulturer viste lav ekspression af Cdkn1b uden kernerne med næsten ingen phalloidin-farvning (figur 3 AD). Otospheres dyrket i sensorisk epithel differentiering medier har forøget ekspression af nuklear Cdkn1b samtidig med fremkomsten af phalloidin mærkning i de perifere kanter af celler (figur 3 EH). Ved prolifererende iMOP otospheres, CDH1 (E-cadherin) og phalloidin er svagt mærket (figur 3 IL). I differentierede iMOP otospheres, udtalt phalloidin og CDH1 mærkning fremhæve de morfologiske ændringer i actinfilamenter og regioner i celle-celle adhæsion (Figur 3 MP), svarende til tidligere resultater 27. Under sensoriske epithel differentiering, de morfologiske ændringer i actinfilamenter parallelt udseendet af CDH1 ekspression i adhæsionssteder mellem celler. I denne protokol, stigningen i Cdkn1b udtryk sammen med ændringerne i phalloidin og CDH1 tjene som tidlige indikatorer for sensoriske epithel differentiering i iMOP celler.
IMOP-afledte Neuroner Express Cdkn1b og Tubb3
En skematisk gengivelse af iMOP neuronal differentiering protokol er vist (figur 4A). Svarende til den førnævnte protokol blev iMOP celler dissocieret og alfulgt for nyttiggørelse i 3 dage i iMOP kulturmedier. Otospheres blev høstet, dissocieres i enkeltceller og podet på poly-D-lysin og lamininovertrukne dækglas. Cellerne fik lov til at differentiere i 7 dage. Repræsentative lyse felt billeder på tidspunkter viste progressive morfologiske ændringer, som de differentieret i iMOP-afledte neuroner (figur 4B-E). På dag 7, kan lange neuritter ses strækker sig fra cellelegemer (fig 4E pilespidser). For at bestemme ændringerne i ekspressionsniveauer af Cdkn1b under neuronal differentiering, prolifererende celler iMOP og iMOP-afledte neuroner blev sammenlignet. Otospheres blev mærket med Hoechst og Cdkn1b antistoffer. iMOP celler fra prolifererende otospheres havde nogle celler med lav nukleare Cdkn1b udtryk (Figur 4 FH). Endvidere viste iMOP-afledte neuroner en stigning i antallet af celler med nuklear Cdkn1b ekspression 7 dage efter neuronal differentiering (Figur 4IK). At afgøre, om de Cdkn1b cellerne blev vedtage en neuronal afstamning, blev mærkning af iMOP-afledte neuroner med neuronal markør Tubb3 gjort. Repræsentative billeder af iMOP-afledte neuroner viste co-mærkning af Cdkn1b og Tubb3 (figur 5 e.Kr.). Forstørrelse og kvantificering af neuritter fra disse celler viste en gennemsnitlig 1,5 neuritter forbundet med hver Tubb3 mærket celle (n = 60) (figur 5 EG). I vores neuronal differentiering protokol immunfarvning med Cdkn1b og Tubb3 kan anvendes som en indikator for differentiering til bipolære eller pseudo-unipolære iMOP-afledte neuroner.
Nuklear Cdkn1b Expression stiger efter start Differentiering
De morfologiske ændringer i otospheres viser kvalitative ændringer i iMOP celler som de gennemgår differentiering. For at opnå kvantitative resultater fra IMMUnofluorescence billeder at betegne tidlige differentiering begivenheder, nuklear fluorescens intensitet Cdkn1b fra individuelle prolifererende iMOP celler (n = 239) og iMOP celler undergår sensorisk epithel differentiering (n = 246) blev målt. At normalisere Cdkn1b fluorescens signaler fra uafhængige forsøg, blev forholdet mellem Cdkn1b Hoechst fluorescens fra enkelte celler bestemmes. Histogrammer af det normaliserede fluorescens intensitet Cdkn1b fra prolifererende celler iMOP (sort) og sensoriske epithel differentierende iMOP celler (rød) blev afbildet (figur 6A). En stigning i antallet af høje Cdkn1b udtrykkende celler iagttoges som et skift mod højre i histogrammet for sensoriske epithel differentiering (rød) i forhold til histogrammet for prolifererende celler iMOP (sort). At bestemme stigningen i procentdelen af celler, der udtrykker Cdkn1b, en tærskel for normaliserede Cdkn1b fluorescens intensitet enheder (0,65) blev sat (pilespids) og procentdelen af celler Abo ve tærsklen blev bestemt. Efter sensoriske epithel differentiering, vises iMOP celler en stigning fra 25,3% til 67,1% af celler, der udtrykker Cdkn1b (figur 6B). Det samme kvantitative analyse blev anvendt til iMOP-afledte neuroner. Når man sammenligner proliferative iMOP celler (n = 525) og 7 dages iMOP-afledte neuroner (n = 583) en højregående forskydning i histogrammet forbundet med iMOP-afledte neuroner blev observeret i forhold til histogrammet for prolifererende iMOP celler (figur 6C). Bestemmelse af procentdelen af celler over tærsklen afslørede en stigning i Cdkn1b udtrykkende celler fra 23,5% til 85,5% (figur 6D). Anvendelse af de beskrevne protokoller, kvantitativ analyse af Cdkn1b ekspression bekræftes en stigning i antallet af celler, som opregulerer Cdkn1b under sensoriske epithel og neuronal differentiering. De øgede antal Cdkn1b udtrykkende celler kan anvendes til at bekræfte differentiering af iMOP celler i disse protokoller.
jove_content "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1. Edu Inkorporering som et assay til bestemmelse proliferativ stat IMOP Cultures. IMOP-afledte otospheres dyrket i nærvær af bFGF. Kerner af celler blev mærket med (A) Hoechst og (B) Edu AlexaFluor 488. (C) Merged billede af Hoechst og Edu fluorescens. Otospheres dyrket 3 dage i medierne mangler bFGF. Celler fra kulturer blev mærket med (D) Hoechst og (E) Edu AlexaFluor 488. (F) Flettede billeder af Hoechst og Edu mærkning. Flettede fluorescensbilleder af Hoechst (magenta) og edu (grøn) mærkede celler efter dissociering otospheres og vask med 1X PBS indeholdende 0,1% Tween 20. Celler blev fra otospheres dyrkede (G) i nærvær af bFGF eller (H) fravær af bFGF. Længde på skalaensøjler er 10 um medmindre andet er angivet. (I) Procent af edu mærkede celler fra iMOP celler dyrket i nærvær eller fravær af bFGF. Antallet af individuelle celler analyseret blev betegnet inden søjlediagrammet og fejlsøjler blev afbildet som standardfejl af middelværdien (SEM). Celletal var fra n = 5 uafhængige eksperimenter. Den t-test blev udført for at bestemme statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Generelle Skematisk af Sensory epithel Differentiering. (A) Tidslinje til differentiering iMOP celler i sensoriske epithel. Linjen graf betegner tidspunktet for celledissociering og medieændringer. (B) Typisk fasekontrastbilleder af otospheres på dag 0, (c) 3, (D) 7 og (E) 10 under unguided sensoriske epithel differentiering. Længde på skalaen bar er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Angivelse af markører vejledende af cellecyklusstandsning og differentiering i IMOP-afledte Sensory epitel. Otosphere af iMOP celler dyrket i iMOP kulturmedier. Kerner af celler blev mærket med (A) Hoechst og (B) Cdkn1b antistof. Filamentøs actin blev mærket med (C) phalloidin. (D) Den fusionerede billede af en typisk otospheres indeholder prolifererende iMOP celler. Otospheres fra iMOP celler blev dyrket i sensorisk epithelia kulturmedier til 10 dage. Celler fra otopsheres blev markeret med (E) Hoechst, (F) Cdkn1b og (G) phalloidin. (H) Merged billede af otospheres viser forøget Cdkn1b og phalloidin mærkning. Prolifererende otospheres blev mærket med (I) Hoechst, (J) CDH1, (K) phalloidin. (L) Den fusionerede billede viser svag fluorescens fra disse markører. Otospheres differentieret i sensoriske epithel blev også mærket med (M) Hoechst, (N) CDH1, (O) phalloidin. (P) Den fusionerede billede viser typisk stærke CDH1 og phalloidin mærkning. Længde på skala barer er 10 um medmindre andet er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Generelt Skematisk af neuronal differentiering. (A) Tidslinje til differentiering iMOP celler til neuroner. Fasekontrast billeder af iMOP celler, der undergår neuronal differentiering ved (B) Dag 1, (C) 3, (D) 5 og (E) 7. Pilespidser peger på neuritter. Fluorescens billeder af iMOP celler dyrket som otospheres i iMOP dyrkningsmedier mærket med (F) Hoechst og (G) Cdkn1b. (H) flettede billede af celler mærket med Hoechst og Cdkn1b. Fluorescensbilleder af iMOP celler efter 7 dages dyrkning i neuronal differentiering medier. Kerner af celler blev mærket med (I) Hoechst og (J) Cdkn1b. (K) flettede billede af celler mærket med Hoechst og Cdkn1b. Længde på skala barer er 10 um, medmindre noteret. about / filer / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Angivelse af molekylære markører Vejledende af Cell Cycle Exit og neuronal differentiering. IMOP celler 7 dage efter neuronal differentiering. Kerner blev mærket med (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronal β-tubulin) antistoffer for at fremhæve cellemorfologi og (C) Cdkn1b antistoffer. (D) flettede billede med mærkning af Cdkn1b og Tubb3 i individuelle celler. Længde på skalaen bar er 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
Figur 6. Single Cell Kvantitativ fluorescensintensitet Analyse af Cdkn1b. (A) Normalized fluorescensintensitet Cdkn1b ekspression blev bestemt ved at beregne forholdet mellem Cdkn1b og Hoechst fluorescensintensitet fra enkelte celler. Den normaliserede fluorescensintensitet blev afbildet i forhold til celleantal som et histogram. Normaliseret fluorescens intensitet Cdkn1b fra prolifererende iMOP celler dyrket i nærvær af bFGF (sort) og iMOP otospheres differentieret i sensoriske epithel (SE) (rød) er vist. En tærskel blev fastsat til 0,65 normaliserede fluorescens intensitet enheder (pilespids) (B) Procentdel af iMOP celler, der udtrykker Cdkn1b over tærskelværdien, fra prolifererende (sort) og sensoriske epiteler differentierede kulturer (rød). (C) Merged fluorescerende billede af sensoriske epiteler differentierede iMOP celler mærket med Hoechst og Myo6 antistoffer. (D (E) Procentdel af iMOP celler, der udtrykker Cdkn1b fra prolifererende (sort) og neuronale differentiere kulturer (rød). Individuelle celler, der anvendes til analyse blev betegnet i hvert søjlediagram. Resultater blev indsamlet fra forskellige eksperimenter (n = 3) og fejlsøjler afbildet som SEM. Student t-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. (F) Merged fluorescerende billede af bipolar eller pseudo-unipolære iMOP-afledte neuroner mærket med Hoechst og Tubb3. Længde på skala barer er 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Celledyrkningsbeholderen | Surface Samarbejdsområde (cm2) | Antal Celler seedede for regelmæssig vedligeholdelse | Antal Celler Udsåede for Sanse epitel Differentiering | Antal Celler seedede for neuronal differentiering | Skalering Factor forhold til 60 mm skål | Volumen af anvendte medier (ml) | |
| Multwell Plader | |||||||
| 96 | 0,3 | 10.000 | 20.000 | 10.000-50.000 | 0,015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 90.000 | 180.000 | 100.000-150.000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180.000 | 360.000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| Fade | |||||||
| 35 mm | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500.000 | 0.500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1.000.000 | 2.000.000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2.500.000 | 5.000.000 | 2,500,000- 3.000.000 | 3.000 | 8 | |
Tabel 1. Cell Numbers til vedligeholdelse af Differentiering af IMOP Celler i Varskellige vævskulturplade formater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overvågning IMOP Cultures
En protokol til opretholdelse selvfornyelse og fremme differentiering af en hidtil ukendt iMOP cellelinie er beskrevet og yderligere plating formater er inkluderet (tabel 1). Flere kritiske trin, der hjælper med rutinemæssig ekspansion og differentiering af iMOP celler er noteret. Svarende til pluripotente stamceller cellekulturer, iMOP celler teoretisk set have en ubegrænset levetid. For at sikre at cellelinier er ordentligt vedligeholdt, er iMOP kulturer rutinemæssigt overvåges for celle levedygtighed, selv-fornyelse og differentiering potentiale. For at bestemme cellelevedygtighed efter dissociation, beskæftiger vi farvning med trypanblåt. Generelt over 70% af cellerne er levedygtige efter dissociation. For at overvåge selvfornyelse i iMOP celler, immunfarvning med c-Myc og Sox2 antistoffer er gjort. Under proliferative dyrkningsbetingelser, iMOP celler har en fordoblingstid på ~ 18 timer. Ændringer i ekspressionen af selvfornyelse markører eller gøreubling tid er potentielle indikatorer for ændrede selv-fornyelse. At overvåge differentieringen potentiale iMOP celler, cellecyklus exit og ekspression af stage markører tidligt for sensorisk epitel- eller neuroner anvendes til at vurdere differentieringspotentialet af cellerne. Hvis iMOP celler ikke passere en af de criterions beskrevet ovenfor, vil det være tilrådeligt at opsige kulturer.
Variabler, der påvirker IMOP Cultures
Et afgørende skridt i dyrkning iMOP celler er at opretholde en aktiv koncentration af bFGF i kulturerne til at fremme selv-fornyelse. bFGF er efter sigende meget labil ved 37 ° C, når dyrkning af celler 29,30. Vækst af kulturer kan blive væsentligt påvirket af spontan differentiering på grund af bFGF ustabilitet. I den nuværende protokol, er frisk medium konstant leveret til kulturerne for at opretholde bFGF niveauer over 5 ng / ml. Stabilisering af bFGF niveauer ved hjælp af kontrolleret frigivelse fraglykolsyre og mælkesyre polyester mikrosfærer kunne reducere hyppigheden af ændringer medier er nødvendige for at opretholde stabile niveauer af bFGF i medierne 31. Tilsætning af den stadigt kan frigøres bFGF vil mindske behovet for ofte tilføje medier til at opretholde bFGF niveauer i iMOP kulturer.
Et andet afgørende skridt i at bevare levedygtigheden af iMOP celler er at begrænse eksponeringen for dissociation reagenser og mekanisk klipning. I den nuværende protokol, er dissociation opnås ved inkubation med 1 mM EDTA. Begrænse overdreven inkubationstid med EDTA, hvilket reducerer overdreven mekanisk forskydning forårsaget af kraftig pipettering og begrænse flere centrifugeringstrin ved passage iMOP celler vil bidrage til at øge cellernes levedygtighed. Opmærksomhed på disse trin effektivt kan opretholde levedygtigheden af et stort antal celler under udvidelse af kulturer.
Under den rutinemæssige kultur af iMOP celler, blev flere forskellige metoder til at dissociere cellerne testet. Mechanical klipning af pipettering kan anvendes til at dissociere otospheres, men ikke ensartet eller konsekvent producerer enkelte celler. Anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser til cellulær dissociation af iMOP celler effektivt kan generere enkelte celler fra otospheres, men disse reagenser påvirker klæbende egenskaber af celler til at reformere otospheres og at holde sig til behandlede overflader. For at kunne bruge kommercielle reagenser, blev flere gange vask kræves for at fjerne dissociation reagenser før ansætte differentiering protokoller.
I den nuværende differentiering protokoller, både sensoriske epiteler og neuronal differentiering betingelser resulterede i celledød, der blev observeret i form af enkelte celler eller klumper af døde celler. Apoptotisk celledød kunne være på grund af manglen på passende differentiering eller overlevelse signaler under den langvarige kultur in vitro. Begge differentiering betingelserne B27 supplement til at fremme overlevelsen af celler. Selvom B27 supplement har vist sig at fremme overlevelsen af primære hippocampusneuroner 32, kan det ikke være tilstrækkeligt til at fremme overlevelsen af iMOP celler. Tilsætning af forbindelser såsom ROCK inhibitor kan bidrage til at bevare og øge overlevelsen af iMOP celler under rutinemæssig kultur og in vitro differentiering. ROCK inhibitor har været udbredt hos pluripotente stamceller cellekulturer til at fremme overlevelsen af celler i serumfrit kulturer uden at påvirke differentieringen 33. Tilsætning af ROCK inhibitor til dyrkningsmediet kan bidrage til at øge celleoverlevelse under lange differentiering protokoller uden at påvirke differentieringen potentiale iMOP celler. Øget celleoverlevelse vil tillade udvikling af protokoller til effektivt frembringe store antal modne hårceller eller SGNs.
Øget Cdkn1b Expression som en tidlig markør for IMOP Differentiering
I den tidlige cochlear udvikling, den initiale tilfælde af cellecyklus exit forud differentiering for hårceller, der støtter celler og SGNs 34. Terminal mitose af neuronale progenitorceller breder sig i en bølge begynder fra bunden og fremskridt i retning af spidsen af cochlea 35. I en modstående gradient, terminal mitose af prosensory stamceller, der giver anledning til hårceller og støtteceller går fra toppunktet til bunden af cochlea 34,36. Selvom den tidsmæssige ekspression af Cdkn1b korrelerer godt til post-mitotisk tilstand, er det sandsynligvis ikke den eneste faktor, der fremmer cellecyklus exit i udviklingslandene cochlea. Til støtte for dette, kan Cdkn1b mutant dyr stadig udvikle post-mitotiske hårceller 37. I stedet kan Cdkn1b anvendes som en tidlig indikator for at markere begyndelsen af differentiering. I ustyrede iMOP differentiering kulturer, vil en tidlig markør for differentiering bistå med at udvikle protokoller for at fremme tidlige stadier af differentiering før åbenlyse morfologiske træk kan observeres. </ p>
Svarende til otisk udvikling, indleder cyklus exit differentiering og resulterer i forhøjet Cdkn1b niveauer i iMOP celler. Ved prolifererende iMOP celler, kan observeres kun lavt niveau udtryk for Cdkn1b. Andre cyclinafhængige kinaseinhibitorer såsom Cdkn1a (p21 CIP) kan være ansvarlig for den normale cellecyklusprogression i iMOP celler. Under sensoriske epithel og neuronale differentiering af iMOP celler, enkelt celle kvantitativ analyse viste et undersæt af celler med øget ekspression af Cdkn1b til differentiering iMOP kulturer (figur 6A, C). Ekspression af Cdkn1b i disse celler er en indikation af iMOP celler, som undergår terminal differentiering.
IMOP celler som en Cellular platform for at studere Cell Fate Bestemmelse
Da iMOP celler kan skifte fra en stamfader tilstand til forskellige otiske slægter in vitro, kan de anvendes til at studere øreinfusion celleskæbnebestemmelse. I øjeblikket er den beskrevne protokol anvendes unguided differentiering procedurer for at generere forskellige øre- celletyper. Det iMOP systemet giver mulighed for tilsætning af bioaktive molekyler, forbindelser og definerede gener, der styrer iMOP celler mod den modne hår celle, støtte celle og SGN slægter. En anvendelse af iMOP cellulære platform er at teste for ansøgerlandene transskriptioner faktorer (TF), der fremmer differentiering. Ekspression af nøglen TF kan anvendes til at drive hår celle eller neuronal differentiering. Ekspression af Cdkn1b sammen med etablerede markører eller morfologiske træk af hårceller og SGNs kan anvendes til at bestemme bidraget af kandidat TF'er til særskilte otiske slægter 38,39.
Kandidatlande TF'er såsom Atoh1 er afgørende for hår celle udvikling og er blevet repurposed at fremme hår celledifferentiering i den beskadigede cochlea 40,41. Indførelse af Atoh1 i iMOP celler kan bidrage til at fremme hår celledifferentiering. I developing cochlea, begge Ngn1 og NeuroD1 kræves for korrekt SGN differentiering in vivo 42-44. Ekspression af Ngn1 eller NeuroD1 i iMOP celler kan fremme SGN differentiering. Disse eksperimenter svarer til generering af inducerede neuronale celler (In), hvor ekspression af TFS individuelt eller i kombination kan konvertere fibroblaster eller pluripotente stamceller til neuroner 45-48. Indførelse af TF'er, der normalt udtryk under udviklingen af hårceller eller SGNs er en god strategi til at lede iMOP celler mod håret celle eller SGN afstamning.
Forhold, der fremmer differentiering af et stort antal iMOP-afledte hårceller og SGNs vil give en robust cellulær platform for sygdom modellering, lille molekyle screening og toksikologi test, der kan udføres hurtigt og omkostningseffektivt før arbejdskraftintensive test i gnavere indledes . Den beskrevne protokol præsenterer en enkel og alsidigt system, som kan udnyttes til studying otisk stamfader differentiering og er modtagelig for stor skala eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
- Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
- Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
- Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
- Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
- Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
- Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
- Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
- Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314 (2013).
- Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
- Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
- Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
- Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
- Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
- Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
- Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289 (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
- Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
- Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
- Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
- Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
- Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).
