Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו

doi: 10.3791/53692 Published: January 2, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. שמירה עצמית התחדשות בתאי IMOP

  1. הכן iMOP תקשורת ותרבות: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר וcarbenecillin 20 ng / ml bFGF. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP באמצעות ריאגנטים סטרילי. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    1. תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin aliquots-מעוקר מסנן במשך 5 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. להפשיר 100 מיקרוגרם aliquot / ml bFGF ב RT. הוסף 1 מיליליטר 50X B27, 10 μl של 100 מיקרוגרם / ml bFGF ו12.5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12.
  2. השתמש 3 מיליליטר של תקשורת בצלחת תרבית רקמת 60 מ"מ לתאי iMOP culturing. הוסף מדיה טרי לתרבויות בכל יום אחר על ידי הכפלת הנפח של תקשורת. ודא כי הריכוז של bFGF לא לרדת מתחת 5 ng / ml.
    1. תאי iMOP תרבות במעלות צלזיוס 37 עם CO 2. תאי מעבר של 5% לאחר 5-7 ימים בתרבות כמפורט בשלבים הבאים. העברת תרבות ל15חרוטי מיליליטר באמצעות קצה פיפטה 10 מיליליטר.
  3. הפוך 1 mM EDTA בHBSS על ידי דילול 0.1 מיליליטר של 0.5 M EDTA pH 8.0 ל50 מיליליטר של HBSS. טרום החם mM EDTA 1 עשה בHBSS באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  4. קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות. ב RT. לשקיעה הכבידה, למקם את חרוטי 15 מיליליטר המכילים תרבויות בחממת 37 ° C 5 - 10 דקות. לאחר הזמן, להתבונן otospheres לאסוף בתחתית חרוטי 15 מיליליטר.
    הערה: כוח הצנטריפוגלי מוגזם יכולה לגרום נזק לתאים.
  5. זהירות לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה מבלי להפריע תא גלולה. הוסף 0.5 מיליליטר של תמיסת 1 mM EDTA HBSS מראש חימם לתא גלולה. בעזרת פיפטה P1000, בעדינות pipet למעלה ולמטה 2 - 3 פעמים. הנח חרוטי על 37 מעלות צלזיוס ודגירה של <5 דקות כדי להקל על ניתוק לתוך תאים בודדים.
  6. מערבולת בעדינות את פתרון התא כדי לקבוע אם otospheres הם ניתקו. אם לא Otoתחומים משקעים לתחתית חרוטי, התאים הם ניתקו. זמן דגירה עשוי להשתנות.
    הערה: דגירה ממושכת עם EDTA תגרום למות תא מוגזם.
  7. הסרת תאים מ -37 מעלות צלזיוס, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת לנטרל ולדלל את EDTA. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. לשאוב את דילול EDTA בעזרת פיפטה aspirating 2 מ"ל ולהוסיף 5 מיליליטר של 1X PBS לשטוף את התאים.
  8. ספין תאים למטה ב XG 200 במשך 5 דקות על RT ולשאוב את 1X PBS באמצעות פיפטה aspirating 2 מיליליטר. Resuspend התאים בעזרת פיפטה P1000 ב0.5 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים.
  9. ספירת תאים באמצעות מונה חלקיקי microfluidic עם הקלטות המתאימות 28. צלחת ומחוברות של תאי iMOP תכיל ~ 6 X10 6 תאים. לדלל תאי 1: 100 בתקשורת ולהוסיף 75 ul של פתרון נייד לתוך הקלטת לספירה. צלחת 1 x 10 6 תאים בצלחת 6 סנטימטר בcultu iMOPמחדש תקשורת (~ 1: 10 דילול). iMOPs מעבר כל 5 - 7 ימים.
    הערה: תאים היוצרים otospheres הגדול או לצרף לתחתית צלחת תרבית הרקמה יבדיל. תאים גם ימותו אם התרבויות הן מעל ומחוברות.

2. תאי IMOP הקפאה להפשרה

  1. הכן בינוני הקפאה סינתטית על ידי הפשרה וequilibrating הפתרון ל4 מעלות צלזיוס לפני תאי הקפאה.
  2. איסוף תאים מצלחת סנטימטר ומחוברות 6 תאי iMOP. השתמש פיפטה 10 מיליליטר ותאי העברה (~ 6 - 8 x 10 6 תאים) לחרוטים 15 מיליליטר.
  3. קציר תאים על ידי שיקוע כובד או צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. אם otospheres קטן, תאים לא יסתפקו בשקיעה הכבידה. אופציונאלי: ספירת תאים באמצעות צעד 1.9 כדי לקבוע כולל מספרים סלולריים.
  4. לשאוב בילה מדיה באמצעות 2ml aspirating פיפטה תוך השארת התא גלולה הרופפת מאחורי.
  5. להוסיף 0.25 מיליליטר של תקשורת הקפאה סינתטית לresuspend לסה"נLLS בצפיפות של ~ 5 x 10 x 5 3 10 6 תאים / מיליליטר. בעדינות פיפטה תאים עם טפטפת P1000. מעבירים את ההשעיה התא לבקבוקוני קריוגני בעזרת פיפטה P1000 עם 1 מיליליטר מסונן קצה.
  6. מניחים את הבקבוקונים במכל הקפאה נטולת אלכוהול ולמקם את מיכל ההקפאה ב -80 ° C כדי להפחית את מעלות צלזיוס בטמפרטורת 1 לדקה עד לטמפרטורה מגיעה -80 ° C.
  7. לאחסון לטווח הארוך של תאים, להעביר את הבקבוקונים לשלב האדים של טנק נוזל אחסון חנקן. להפשיר את תאים לתרבות, לאזן בקבוקון המכיל תאי קירור קפוא ב -80 ° C.
  8. תקשורת ותרבות iMOP טרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  9. להפשיר את הבקבוקון הקפוא במהירות על ידי מתערבל תחתית הבקבוקון באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP מראש חימם לתאים מופשרים פעם גביש הקרח האחרון נעלם. העברת תאים לתוך חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 4 מיליליטר נוסף של תקשורת בתרבות iMOP
  10. ספין שיתוף 15 מיליליטרnical במשך 5 דקות. ב XG 200 ולשאוב התקשורת בילתה. Resuspend התאים 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות iMOP ותאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 להרחבה.

3. ההתמיינות תאי IMOP לחושית epithelia

  1. הכן 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP: DMEM / F12, תוספת 1X B27, 25 מיקרוגרם / מיליליטר carbenecillin. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית iMOP. לחמם 49 מיליליטר של DMEM / F12 בחרוטי 50 מיליליטר באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. תוספת ההפשרה 50X B27 ו- 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin aliquots במשך 5 דקות. באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מיליליטר 50X B27 ו12.5 μl של 100 מ"ג / מיליליטר carbenecillin לDMEM / F12.
  2. תאים למסוק, לנתק, גלול ולספור חזרו על שלבים 1.4-1.9
  3. 1 x 10 6 תאי צלחת בצלחת 6 סנטימטר ביום -3 באמצעות iMOP תקשורת ותרבות. ביום 0, תרבויות העברה באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לחרוטי 15 מיליליטר. לאסוף את Otoתחומים על ידי שקיעה הכבידה כאמור בשלב 1.6. לשאוב בילה מדיה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres בתחתית חרוטי.
  4. בעדינות להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת בידול epithelia החושית. העברת otospheres לצלחת 6 סנטימטר בעזרת פיפטה מיליליטר גדולה נשא 10.
    הערה: גז מכאני מpipetting הקשה יכול לנתק תאים מotospheres.
  5. הוסף 2 מיליליטר של תקשורת בידול אפיתל החושית הטרי לתרבויות בכל יום אחר. במידת צורך, ניתן לאסוף תאים על ידי שיקוע כובד ותקשורת הוחלף.
  6. לאסוף otospheres ביום 10 על ידי העברה לחרוטי 15 מ"ל ומאפשר לotospheres משקע כאמור בשלב 1.6.Aspirate התקשורת בילתה באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולהשאיר otospheres באין מפריע.
  7. תקן otospheres ידי דוגרים בפורמלין 4% ב1X PBS במשך 15 דקות ב RT. הסר פתרון פורמלדהיד, לשטוף otospheres עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1.
    1. החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל 0.1% בכפוף Triton X-100 otosphere לimmunostaining 27. העברת otospheres ל1X PBS וotospheres מקום לתליית תקשורת בשקופית זכוכית בעזרת פיפטה P1000. שים coverslip על המדגם ולאפשר תקשורת הרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס.
  8. לרכוש תמונות epifluorescence באמצעות התקנת מיקרוסקופ הפוכה מצוידות במצלמת 16 ביט CCD וגם אוויר 20X 0.75 או אובייקטיבי טבילת שמן NA 40X 1.3. לאסוף הקרינה מערוצי צבע שונים באמצעות רשום (העירור ופליטה) אורכי גל: כחולה (377 ± 25 ננומטר / 447 ± 30 ננומטר), ירוק (475 ± 25 ננומטר / 540 ± 25 ננומטר), אדום (562 ± 20nm / ו625 20nm ±) ואינפרא-אדום (628 ± 20nm / ו692 ± 20ננומטר).

4. Assaying edu התאגדות

  1. ביום -3, צלחת 1 x 10 6 תאי iMOP בצלחת 6 סנטימטר. שלושה ימים לאחר מכן ביום 0, קציר, לנתק, גלול ולספור תאים על ידי חזרה על שלבי 1.4-1.9.
  2. צלחת 2.5 x 10 5 תאים בתקשורת ותרבות iMOP ו -5 5 תאים x10 בתקשורת בידול epithelia החושית בבארות שונות של צלחת 6 היטב.
  3. לקבוע את אחוז התאים בשלב S ידי התאגדות edu ביום 3 באמצעות assay התאגדות edu
    1. להוסיף מניית edu ישירות לתרבויות iMOP להשיג ריכוז סופי של 1 מיקרומטר edu בתקשורת והתרבות.
    2. דגירה edu בתרבויות iMOP לשעה 2 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. קציר, תאים לנתק ולאסוף לחזור על שלבים 1.4-1.9. להוסיף בפורמלדהיד 4% ב1X PBS במשך 15 דקות. ב RT לתקן תאים. קציר תאים על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות על RT. הסר פתרון פורמלדהיד וproperly להיפטר.
    3. גרעיני תווית של תאים עם Hoechst ושולבו edu עם צבע-אזיד הקרינה ירוקה על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: כל שטיפות נעשות עם 1X PBS, תאי Tween 20. לשטוף 3 BSA% ו -0.1% עם 1X PBS פעמיים.
    4. תאי הר בשקופית באמצעות antifade מגיב ולמקם את זכוכית 1.5 כיסוי על המדגם. לרכוש תמונות ניאון של תאים שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence.

5. ההתמיינות נוירונים הנגזר IMOP

  1. לעשות 50 מיליליטר של תקשורת בידול העצבית: תקשורת Neurobasal, תוסף B27 1X, 2 מ"מ L- גלוטמין. בקבוק הפשרה של 50X B27 ו -200 המ"מ L- גלוטמין 37 ° C אמבט מים במשך 5 דקות. הוסף 1ml 50X B27 ו 0.5 מיליליטר 200 המ"מ L- גלוטמין ל48.5 מיליליטר של תקשורת Neurobasal.
  2. coverglass מעיל על ידי הצבת 12 מ"מ עגול 1.5 coverslips זכוכית בצלחת 10 סנטימטר סטרילי ולהוסיף 70% EtOH לצלחת לעיקור ולנקות את coverslips.
  3. בעדינות להתסיס את המפרץrslips כדי להבטיח שהם מכוסים באתנול. השאר את הצלחת במשך 10 דקות ב RT. יש לשטוף את coverslips 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS לשטוף את אתנול נותר. יש לשטוף את coverslip פעם עם סטרילי H 2 0 לשטוף את שנותר 1X PBS.
  4. לשאוב H 2 0 באמצעות 2 מיליליטר aspirating פיפטה ולתת את coverslips יבש. לחשוף את coverslips לאור UV בברדס בתרבית רקמה במשך 15 דקות. חנות coverslips בסביבת סטרילית, אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
  5. מניחים coverslip אחד 12 מ"מ עגול בכל טוב של צלחת 24 היטב. לנער את צלחת בעדינות כדי להבטיח שcoverslips לשכב על תחתית הבאר.
  6. הפשרת 2 מ"ג / מיליליטר poly-D- ליזין פתרון מניות ב RT ולדלל את ריכוז פולי-D ליזין / מיליליטר 10 מיקרוגרם ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 פולי-D ליזין UG / מיליליטר לבארות. השאר את הצלחת בחממת 37 ° C עבור שעה 1.
  7. לשטוף את הבארות 3 פעמים עם סטרילי 1X PBS. הפשרת 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות laminin ב RT ולדלל עד 10 מיקרוגרם / מ 'l ב1X PBS. להוסיף 0.25 מיליליטר של 10 מיקרוגרם laminin מיליליטר / עובד פתרון לטוב יחידה של מנה 24 רב גם. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס חממה. לשאוב את פתרון laminin בעזרת פיפטה aspirating 2 מיליליטר.
  8. לשטוף את coverslip 3 פעמים עם 1X PBS על ידי הוספת 1 מיליליטר של 1X PBS עם פיפטה P1000 והסרת PBS 1X ידי aspirating עם 2 מיליליטר aspirating פיפטה. השאר 1X PBS מלשטוף אחרון בבאר עד תאים מוכנים להיות מצופה. ליזום בידול עצבי על ידי קציר, מתנער וספירת תאים בשלבים 1 x 10 6 תאי 1.4-1.9.Plate בצלחת 6 סנטימטר ביום -3.
  9. ביום 0, קציר, לנתק ולספור תאים על ידי חזרה על 1.4-1.9. זרעים 1 x 10 5-1.5 x 10 5 תאי iMOP ל0.5 מיליליטר תקשורת עצבית בידול מחומם מראש לכל גם בצלחת רב גם 24. לשאוב ולהוסיף מדיה בידול עצבית מחוממת מראש לתרבויות בכל יום אחר.
  10. תקן נוירונים נגזר iMOP בפורמלין 4% במשך 15 דקות. אלא RT על פתרון פורמלדהיד 7. הסר יום, לשטוף נוירונים נגזר iMOP עם חיץ לשטוף (1X PBS המכיל 0.1% TritonX-100) לפני דוגרים בחסימת חיץ (1X PBS המכיל 10% עזים בסרום נורמלי ושל 0.1% Triton X-100) במשך שעה 1.
    1. החלף חיץ דגירה דגימות בחסימת חיץ עם נוגדן מדולל. דגירה על 4 מעלות צלזיוס. לשטוף דגימות עם 1X PBS המכיל טריטון X-100 תאים כפופים 0.1% לimmunostaining 27. שטוף את coverglass עם 1X PBS לפני הצבה על גבי מדיה הרכבה. לאפשר תקשורת ההרכבה לייבוש על 4 מעלות צלזיוס לפני רכישת תמונות epifluorescence כפי שמופיע בשלב 3.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

bFGF נסיגת ירידות הפצת נשק בתאי IMOP

כדי להקטין את יכולת השגשוג של תאי iMOP וליזום התמיינות של תאי iMOP, bFGF הוסר ממדפי התרבויות. כדי לוודא שנסיגת גורם גדילה יורדת התפשטות, התאגדות edu הועסקה כassay התפשטות. אחוז התאים ששולבו edu מotospheres תרבותי עם תקשורת ותרבות iMOP (המכיל bFGF) וotospheres תרבותי בתקשורת epithelia החושית (ללא bFGF) הושווה. תרבויות Otosphere היו פעמו עם אנלוגי נוקלאוטיד edu, שנקטפו וקבוע. נוקלאוטידים Incorporated edu היו שכותרתו fluorescently עם אזיד Alexafluor 488 באמצעות לחיצת כימיה. תאים מotospheres גדל בהעדר bFGF הראו ירידת התאגדות של קרוב המשפחה edu לתאים בתרבית עם bFGF (איור 1 א-ו). כo הגודלו otosphere גדל, זה היה קשה יותר ויותר לדמיין את כל התאים מotosphere עם מיקרוסקופ epifluorescent. כדי לטפל בזה, תאים היו ניתקו ורכובים כך שהם יכולים להיות דמיינו באופן חד משמעי en המוני. גם לאחר ניתוק וקיבעון, התאים מחדש מצטברים. כדי לשמור על התאים במצב מנותק, חומרי ניקוי שמנעו מהתאים מחדש צבירה נבדקו. Tween 20 היה אחד מחומרי הניקוי שמנע מחדש אגרגציה של התאים. תאים ניתק נשטפו עם 0.1% Tween 20 ורכובים על גבי שקופיות. תאי שכותרת edu היו דמיינו לאחר מכן על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (איור 1G, H). נציגי תוצאות מניסויים בודדים (n = 5) הראו ירידה משמעותית באחוז edu שכותרתו תאים מ -48% ל -19% לאחר 3 ימים לאחר נסיגת bFGF (p <0.005). תוצאות אלו לאשר ירידה דרמטית באחוז תאי שלב S ופוטנציאל שגשוג של תאי iMOP לאחר נסיגת bFGF.

הנגזר IMOP החושית epithelia Express Cdkn1b וצג מורפולוגי שינויים

ציר זמן של פרוטוקול בידול epithelia החושי iMOP מוצג (איור 2 א). Otospheres מתרבויות שגשוג היה ניתק לתוך תאים בודדים ואיפשר להתאושש במשך 3 ימים בתקשורת תרבות iMOP. שיטה זו מסייעת להעשיר לתאים מתרבים ובוחר נגד תאים לאחר mitotic בתרבויות החל אלה. לאחר 3 ימים, otospheres חדש שנוצר היו זרע בתקשורת בידול epithelia החושית ואיפשר לעבור התמיינות בלתי מונחת במשך 10 ימים. תמונות שדה מוארת של תרבויות טיפוסיות מכילות otospheres בנקודות זמן שונה לאחר הזריעה הראו ירידה ראשונית בגודל לפני otospheres להתחיל להגדיל בגודל (איור 2 ב-ה).

GE = "1"> מאז מיקרוסקופיה brightfield לא יכולה לחשוף רב של השינויים המתרחשים במהלך ההתמיינות של תאי iMOP, immunostaining עם סמנים מולקולריים שימשה כדי להדגיש תכונות מורפולוגיות ומולקולריות של תאי הבדיל 27. כדי לקבוע אם ביטוי של Cdkn1b (בקרנ p27) יכול לשמש כסמן לבידול, otospheres מתרבויות iMOP epithelia מובחן שגשוג או חושיות הושווה. סמני ניאון היו דמיינו ונתפסו על ידי מיקרוסקופ epifluorescence. נציג תמונות של otospheres מתרבויות שגשוג הראו ביטוי נמוך של Cdkn1b מחוץ לגרעינים כמעט ללא מכתים phalloidin (איור 3 לספירה). Otospheres התרבותי בתקשורת בידול epithelia החושית מוצג גדל ביטוי של נלווה Cdkn1b הגרעיני עם הופעתו של תיוג phalloidin בקצוות ההיקפיים של תאים (איור 3 EH). בotospheres iMOP מתרבים, Cdh1 (E-cadherin) וphalloidin מסומנים בחולשה (איור 3 IL). בotospheres iMOP המובחן, phalloidin הבולט ותיוג Cdh1 להדגיש את השינויים מורפולוגיים בסיביים אקטין ואזורים של תאי תאי הידבקות (איור 3 MP), דומה לתוצאות קודמות 27. במהלך התמיינות epithelia חושית, השינויים מורפולוגיים בסיביים אקטין במקביל להופעה של ביטוי Cdh1 באתרי הידבקות בין תאים. בפרוטוקול זה, העלייה בביטוי Cdkn1b יחד עם השינויים בphalloidin וCdh1 לשרת אינדיקטורים מוקדמים לבידול epithelia החושי בתאי iMOP.

נוירונים Express Cdkn1b וTubb3 נגזר IMOP

סכמטי של פרוטוקול בידול עצבי iMOP מוצג (איור 4 א). בדומה לפרוטוקול האמור, תאי iMOP היו ניתקו ואלגעיתי להתאוששות במשך 3 ימים בתקשורת תרבות iMOP. Otospheres נקצרו, ניתק לתוך תאים בודדים וזורע על פולי-D ליזין וcoverslips laminin מצופה. התאים הורשו להבדיל למשך 7 ימים. תמונות שדה בהירות נציג בנקודות זמן מוצג שינויים מורפולוגיים מתקדמים כפי שהם מובחנים לתוך הנוירונים נגזר iMOP (איור 4-ה). על ידי יום 7, ניתן לראות neurites הארוכה המשתרעת מגופי תא (ראשי חץ איור 4E). כדי לקבוע את השינויים ברמות ביטוי של Cdkn1b במהלך התמיינות עצבית, תאים מתרבים iMOP ונוירונים נגזר iMOP הושוו. Otospheres תויגו עם נוגדני Hoechst וCdkn1b. תאי iMOP מotospheres מתרבים היו כמה תאים עם ביטוי Cdkn1b גרעיני נמוך (איור 4 FH). יתר על כן, הנוירונים נגזר iMOP הראו עלייה במספר התאים עם ביטוי Cdkn1b גרעיני 7 ימים לאחר התמיינות עצבית (איור 4IK). כדי לקבוע אם תאי Cdkn1b היו אימוץ שושלת עצבית, תיוג של נוירונים נגזר iMOP עם הסמן העצבי Tubb3 נעשה. נציג תמונות של נוירונים נגזר iMOP הראו שיתוף תיוג של Cdkn1b וTubb3 (איור AD 5). הגדלה וכימות של neurites מהתאים אלה הראו 1.5 neurites ממוצעת משויכת לכל Tubb3 שכותרתו תא (n = 60) (איור 5 EG). בפרוטוקול שלנו עצבי בידול, immunostaining עם Cdkn1b וTubb3 יכול לשמש כאינדיקציה לבידול לתאי עצב שמקורם בiMOP דו קוטבי או פסאודו-חד קוטבי.

רמות ביטוי הגרעיני Cdkn1b להגדיל לאחר ייזום בידול

השינויים מורפולוגיים בotospheres להראות שינויים איכותיים בתאי iMOP כפי שהם עוברים התמיינות. כדי להשיג תוצאות כמותיות מאימונוגלובולינתמונות nofluorescence כדי לציין אירועי בידול מוקדמים, עוצמת הקרינה גרעינית של Cdkn1b מתאי בודדים iMOP מתרבה (n = 239) ותאי iMOP עוברים התמיינות epithelia חושית (n = 246) נמדדו. לנרמל אותות הקרינה Cdkn1b מניסויים בלתי תלויים, היחס של Cdkn1b לקרינת Hoechst מהתאים בודדים נקבע. היסטוגרמות של עוצמת הקרינה המנורמלת של Cdkn1b מהתאים מתרבים iMOP (שחורה) וepithelia החושית הבחנה תאי iMOP (אדום) היו זממה (איור 6 א). עלייה במספר תאי Cdkn1b גבוהים להביע נצפתה כתזוזה ימינה של ההיסטוגרמה לבידול epithelia החושית יחסי (אדום) להיסטוגרמה לתאים מתרבים iMOP (שחור). כדי לקבוע את העלייה באחוז התאים לבטא Cdkn1b, סף ליחידות עוצמת הקרינה מנורמלות Cdkn1b (0.65) נקבע (ראש חץ) ואחוז התאים ABO יש הסף נקבע. לאחר התמיינות epithelia חושית, תאי iMOP מוצג עלייה מ25.3% ל67.1% של תאים לבטא Cdkn1b (איור 6). אותו הניתוח כמותי היה מוחל על נוירונים נגזר iMOP. כאשר משווה תאי iMOP שגשוג (n = 525) ותאי עצב שמקורם בiMOP 7 יום (n = 583) תזוזה ימינה בהיסטוגרמה קשורה עם תאי עצב שמקורם בiMOP נצפתה ביחס להיסטוגרמה לתאים מתרבים iMOP (איור 6 ג). קביעת אחוז התאים מעל הסף חשפה עלייה בתאים המבטאים Cdkn1b מ23.5% ל85.5% (איור 6 ד). שימוש בפרוטוקולים תיארו, ניתוח כמותי של ביטוי Cdkn1b אישר עלייה במספר התאים שupregulate Cdkn1b במהלך epithelia החושית והבחנה עצבית. המספרים מוגברים של תאים לבטא Cdkn1b ניתן להשתמש כדי לאשר התמיינות של תאי iMOP בפרוטוקולים אלה.

jove_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 "> איור 1
otospheres איור 1. edu ההתאגדות כAssay לקביעת שגשוג מדינת תרבויות IMOP. iMOP נגזר בתרבית בנוכחות bFGF. גרעינים של תאים תויגו עם () Hoechst ו( B) edu Alexafluor 488. (ג) תמונה הממוזגת של הקרינה Hoechst וedu. Otospheres תרבית 3 ימים בתקשורת חסרת bFGF. תאים מתרבויות תויגו עם (ד) Hoechst ו( E) edu Alexafluor 488. (F) תמונות ממוזגות של תיוג Hoechst וedu. תמונות הקרינה התמזגו של Hoechst (מגנטה) וedu ​​(ירוק) תאים שכותרתו לאחר מתנער otospheres וכביסה עם 1X PBS המכיל 0.1% Tween 20. תאים מotospheres תרבותי (G) בנוכחות או היעדר bFGF (H) של bFGF. אורכו של קנה המידהברים הם 10 מיקרומטר, אלא אם כן צוין אחוז. (I) של edu שכותרתו תאים מהתאים בתרבית iMOP הנוכחות או עדר של bFGF. מספר התאים הבודדים ניתחו היה מסומן בברי גרף העמודות וטעייה תוארו כסטיית התקן של הממוצע (SEM). ספירת תאים היו מn = 5 ניסויים בלתי תלויים. מבחן t של הסטודנט נעשה כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. כלליים סכמטי של חושי epithelia בידול. (א) ציר זמן להבחנת תאי iMOP לepithelia חושית. גרף הקו מציין את הזמן של ניתוק תא ושינויי תקשורת. לעומת שלב אופייני (B)תמונות של otospheres ביום 0, (ג) 3, (ד) 7 ו( E) 10 במהלך התמיינות epithelia חושית בלתי מונחת. אורכו של סרגל קנה מידה הוא 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
ביטוי 3. איור של סמנים המעידים על מעצר סלולארי מחזור ובידול בנגזרות IMOP החושי epithelia. Otosphere של תאים בתרבית iMOP תקשורת תרבות iMOP. גרעינים של תאים תויגו עם () Hoechst ונוגדנים (ב) Cdkn1b. אקטין פילמנטיות תויגה עם phalloidin (C). התמונה הממוזגת של otospheres טיפוסי מכיל תאי iMOP מתרבה (ד '). Otospheres מתאי iMOP היו בתרבית בepith החושיתתקשורת והתרבות אליה במשך 10 ימים. תאים מotopsheres סומנו ב( E) Hoechst, (F) Cdkn1b וphalloidin (G). תמונה (H) מוזגה של otospheres הראה מוגבר Cdkn1b ותיוג phalloidin. otospheres מתרבים תויגו עם phalloidin (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K). (L) התמונה הממוזגת תערוכות הקרינה חלשה מסמנים אלה. Otospheres המובחן לepithelia החושית גם תויגו עם (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) phalloidin. (P) התמונה הממוזגת מציגה תיוג Cdh1 וphalloidin חזק אופייני. אורכו של ברים בקנה מידה הוא 10 מיקרומטר אלא אם כן צוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

alt = G "איור 4" src = "/ קבצים / ftp_upload / 53,692 / 53692fig4.jpg" />
איור 4. כלליים סכמטי של עצבי בידול. (א) ציר זמן להבחנת תאי iMOP לתוך הנוירונים. בניגוד שלב תמונות של תאי iMOP עוברים התמיינות עצבית ביום 1 (ב), (ג) 3, (ד) 5 (ה) 7. ראשי חץ להצביע לneurites. תמונות הקרינה של תאים בתרבית iMOP כotospheres בתקשורת ותרבות iMOP שכותרתו עם (F) Hoechst ו( G) Cdkn1b. תמונה הממוזגת של תאים שכותרתו עם Hoechst וCdkn1b (H). תמונות הקרינה של תאי iMOP לאחר 7 ימים של תרבות בתקשורת בידול העצבית. גרעינים של תאים תויגו עם (אני) Hoechst ו( J) Cdkn1b. תמונה (K) ממוזג של תאים שכותרתו עם Hoechst וCdkn1b. אורכו של ברים בקנה מידה הוא 10 מיקרומטר אלא אם צוין. אום קבצים / ftp_upload / 53,692 53692fig4large.jpg "target =" / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. ביטוי של סמנים מולקולריים אינדיקטיבי של יציאה תא מחזור ועצבי בידול. IMOP תאים 7 ימים לאחר התמיינות עצבית. גרעינים תויגו עם () Hoechst, (ב) Tubb3 (β-טובולין העצבי) נוגדנים כדי להדגיש מורפולוגיה תאית ונוגדנים (C) Cdkn1b. תמונה הממוזגת עם תיוג של Cdkn1b וTubb3 בתאים בודדים (ד '). אורכו של סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

OAD / 53,692 / 53692fig6.jpg "/>
איור 6. תא בודד ניתוח עוצמה כמותי הקרינה של Cdkn1b. () עוצמת הקרינה מנורמלת ביטוי Cdkn1b נקבעה על ידי חישוב היחס של עוצמת הקרינה Cdkn1b וHoechst מהתאים בודדים. עוצמת הקרינה המנורמלת הייתה להתוות ביחס למספרים סלולריים כמו היסטוגרמה. עוצמת הקרינה מנורמלת של Cdkn1b מתאים מתרבים iMOP תרבית בנוכחות bFGF (שחור) וotospheres iMOP המובחנת לepithelia החושית (SE) (אדום) מוצגת. סף נקבע על 0.65 יחידות מנורמלות עוצמת הקרינה (ראש חץ) (ב) אחוז תאי iMOP להביע Cdkn1b מעל ערך הסף, ממתרבה (שחור) ותרבויות חושיות epithelia המובחנת (אדום). (ג) מוזגו תמונת ניאון של תאי iMOP החושיים epithelia הבדיל שכותרתו עם נוגדני Hoechst וMyo6. (D (ה) אחוז תאי iMOP להביע Cdkn1b ממתרבה (שחור) ותרבויות עצביות הבחנה (אדום). תאים בודדים המשמשים לניתוח היו מצוינים בכל גרף עמודות. תוצאות לוקטו מניסויים שונים (n = 3) וברים שגיאה מתואר כSEM. מבחן t הסטודנטים שימש כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטיות. (F) מוזגו תמונת ניאון של דו קוטבי או נוירונים הנגזר iMOP פסאודו-חד קוטביים שכותרתו עם Hoechst וTubb3. אורכו של ברים בקנה מידה הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כלי תרבות תא סופינת rface (2 סנטימטר) מספר התאים שנזרע לתחזוקה שגרתית מספר התאים שנזרעו לתחושתי epithelia בידול מספר התאים שנזרע לבידול עצבי יחסית גורם קנה מידה לצלחת 60 מ"מ נפח של מדיה משומשת (מיליליטר)
צלחות Multwell
96 0.3 10,000 20,000 10,000-50,000 0.015 0.1
24 2 90,000 180,000 100,000-150,000 0.100 0.5
12 4 180,000 360,000 300,000 0.200 1
6 10 500,000 1,000,000 500,000-750,000 0.500 2
כלי אוכל
35 מ"מ 10 500,000 1,000,000 500,000 0.500 2
60 מ"מ 20 1,000,000 2,000,000 1,000,000-1,500,000 1.000 3
100 מ"מ 60 2,500,000 5,000,000 2,500,000- 3,000,000 3.000 8

מספרים סלולריים טבלה 1. לתחזוקה של התמיינות של תאי IMOP בVarפורמטי תרבות צלחת רקמות ious.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניטור תרבויות IMOP

פרוטוקול לשמירה על התחדשות עצמית וקידום הבידול של שורת תאי iMOP רומן מתואר ופורמטי ציפוי נוספים כלולים (טבלה 1). כמה שלבים קריטיים המסייעים בהרחבה והתמיינות של תאי iMOP שגרה הם ציינו. בדומה לתרביות תאי גזע pluripotent, יש תאי iMOP תיאורטי תוחלת חיים בלתי מוגדרת. כדי להבטיח שנשמרות שורות תאים כראוי, תרבויות iMOP מנוטרות באופן שיגרתי לכדאיויות תא, התחדשות עצמית ופוטנציאל התמיינות. כדי לקבוע כדאיות תא לאחר ניתוק, אנחנו מעסיקים צביעת trypan כחולה. באופן כללי, מעל 70% מתאי קיימא לאחר ניתוק. לעקוב אחר התחדשות עצמית בתאי iMOP, immunostaining עם c-Myc ונוגדני Sox2 נעשה. בתנאי תרבות שגשוג, תאי iMOP יש זמן הכפלה של ~ 18 שעות. שינויים בביטוי של סמני התחדשות עצמית או לעשותubling זמן הם אינדיקטורים פוטנציאל של התחדשות עצמית שונה. כדי לפקח על פוטנציאל ההתמיינות של תאי iMOP, יציאת מחזור התא וביטוי של סמני שלב מוקדם לאפיתל או נוירונים חושיים משמשים כדי להעריך את פוטנציאל ההתמיינות של התאים. אם תאי iMOP לא עוברים כל אחד מהקריטריונים שתוארו לעיל, יהיה זה רצוי לסיים את התרבויות.

משתנים המשפיעים על תרבויות IMOP

שלב קריטי אחד בתאי culturing iMOP הוא לשמור על ריכוז פעיל של bFGF בתרבויות לקדם התחדשות עצמית. bFGF הוא מדווח יציב מאוד על 37 מעלות צלזיוס, כאשר תאי culturing 29,30. צמיחה של תרבויות יכולה להיות מושפעת באופן משמעותי על ידי בידול ספונטני בשל חוסר יציבות bFGF. בפרוטוקול הנוכחי, תקשורת טרי מסופקת כל הזמן לתרבויות על מנת לשמור על רמות bFGF מעל 5 ng / ml. ייצוב רמות bFGF באמצעות שחרור מבוקר מגליקולית והחומצה לקטית microspheres פוליאסטר יכולים להפחית את התדירות של שינויי תקשורת הנדרשים כדי לשמור על רמת סוכר קבועה של bFGF בתקשורת 31. תוספת של bFGF בהתמדה releasable תפחית את הצורך בתדירות גבוהה להוסיף מדיה כדי לשמור על רמות bFGF בתרבויות iMOP.

עוד צעד קריטי בשמירה על הכדאיות של תאי iMOP הוא להגביל את החשיפה לחומרים כימיים וניתוק גז מכאני. בפרוטוקול הנוכחי, ניתוק נעשה על ידי דגירה עם 1 mM EDTA. בלימת זמן דגירה מוגזמת עם EDTA, הפחתת גז מכאני מוגזם נגרמים על ידי pipetting הנמרץ והגבלת צעדי צנטריפוגה מרובות כאשר passaging תאי iMOP יעזור להגדיל את כדאיות תא. תשומת לב ניתנה לשלבים הבאים יכולה למעשה לשמור על יכולת קיום של מספר הגדול של תאים במהלך ההתרחבות של תרבויות.

במהלך התרבות השגרתית של תאי iMOP, מספר שיטות לdissociating התאים נבדקו. Mechanגז iCal מpipetting יכול לשמש כדי לנתק otospheres, אבל לא באופן אחיד או באופן עקבי לייצר תאים בודדים. שימוש בחומרים כימי זמינים המסחרית לניתוק סלולארי של תאי iMOP יכול למעשה ליצור תאים בודדים מotospheres, אבל ריאגנטים אלה משפיעים על מאפייני ההדבקה של תאים לרפורמה otospheres ולדבוק במשטחים שטופלו. כדי להשתמש בחומרים כימיים מסחריים, שטיפות מרובות נדרשו להסיר את ריאגנטים הניתוק לפני העסקת פרוטוקולי בידול.

בפרוטוקולים הבידול הנוכחיים, שני תנאי epithelia והבחנה עצבית התחושתיים הסתיימו במוות תא שנצפו בצורה של תאים או גושים של תאים מתים אחד. המוות של תאים אפופטוטיים יכול להיות בגלל חוסר רמזי בידול או הישרדות המתאימים במהלך התרבות הממושכת במבחנה. שני תנאי הבידול הכילו תוסף B27 כדי לקדם את ההישרדות של תאים. למרות supplem B27אף אוזן גרון הוכח לקדם הישרדות של תאי עצב בהיפוקמפוס העיקרי 32, זה עלול שלא להספיק לקידום הישרדות של תאי iMOP. תוספת של תרכובות כגון מעכבי ROCK עשוי לעזור לשמור ולהגדיל את הישרדותם של תאי iMOP במהלך תרבות שגרתית ובבידול מבחנה. מעכב ROCK כבר נעשה שימוש נרחב בתרביות תאי גזע pluripotent לקדם הישרדות של תאים בתרביות סרום ללא מבלי להשפיע על בידול 33. תוספת של מעכב ROCK לתרבות התקשורת יכולה לעזור להגביר את הישרדות תא בפרוטוקולי בידול ארוכים מבלי להשפיע על פוטנציאל ההתמיינות של תאי iMOP. הישרדות תא מוגברת תאפשר פיתוח של פרוטוקולים לייצר ביעילות מספר גדול של תאי שיער בוגרים או SGNs.

ביטוי Cdkn1b גדל כמרקר מוקדם של בידול IMOP

במהלך פיתוח שבלול מוקדם, האירוע הראשוני של תאיציאת מחזור מקדימה בידול לתאי שיער, תאי תמיכה וSGNs 34. מיטוזה מסוף של אבות עצביים מתפשטת בגל מתחיל מהבסיס והתקדמות לקראת שיאו של השבלול 35. בשיפוע נגדי, מיטוזה מסוף של אבות prosensory שיוצרים תאי שיער ותאי תומכים מתקדם מהקודקוד לבסיס של השבלול 34,36. למרות שהביטוי הזמני של Cdkn1b קושר היטב למצב שלאחר mitotic, זה כנראה לא הגורם היחיד שמקדם יציאת מחזור התא בשבלול המתפתח. בתמיכה לכך, בעלי חיים שעברו מוטציה Cdkn1b עדיין יכולים לפתח תאי שיער לאחר mitotic 37. במקום זאת, Cdkn1b יכול לשמש כאינדיקטור מוקדם כדי לסמן את תחילתה של בידול. בתרבויות בידול iMOP מונחות, סמן מוקדם לבידול יסייע בפיתוח פרוטוקולים לקידום של בידול שלבים מוקדמים לפני יכולות להיות שנצפו תכונות מורפולוגיות ברורות. </ P>

בדומה להתפתחות otic, יציאת מחזור יוזמת בידול ותוצאות ברמות Cdkn1b מוגברים בתאי iMOP. בתאים מתרבים iMOP, רק ביטוי ברמה נמוך של Cdkn1b ניתן לצפות. מעכבים אחרים cyclin תלויים קינאז כגון Cdkn1a (CIP p21) עשויים להיות אחראים להתקדמות מחזור התא נורמלית בתאי iMOP. במהלך epithelia החושית והבחנה עצבית של תאי iMOP, ניתוח כמו תא בודד גילה קבוצת משנה של תאים עם ביטוי גידול של Cdkn1b בהבחנת תרבויות iMOP (איור 6 א, ג). ביטוי של Cdkn1b בתאים אלה הם אינדיקציה של תאי iMOP עוברים התמיינות מסוף.

תאי IMOP כפלטפורמה סלולרית ללימוד קביעת גורל תא

מאחר ותאי iMOP יכולים לעבור ממדינה לאב שושלות otic שונות במבחנה, הם יכולים להיות מנוצלים כדי ללמוד גורל תא oticדבקות במטרה. נכון לעכשיו, הפרוטוקול המתואר משמש נהלי בידול מונחים ליצור סוגי תאים שונים otic. המערכת מאפשרת לiMOP תוספת של מולקולות ביו, תרכובות וגנים מוגדרים המנחים את תאי iMOP כלפי תא השיער הבוגר, תאי תמיכה ושושלות SGN. השתמש באחת מהפלטפורמה הסלולרית iMOP הוא לבדוק לגורמי תעתיקי מועמד (TF) המקדמים בידול. ביטוי של TF מפתח ניתן להשתמש בכונן תא שיער או בידול עצבי. ביטוי של Cdkn1b יחד עם סמנים הוקמו או תכונות מורפולוגיות של תאי שיער וSGNs ניתן להשתמש כדי לקבוע את התרומה של TFS המועמד לשושלות otic שונים 38,39.

TFS מועמד כגון Atoh1 הם חיוניים להתפתחות תאי שיער וכבר לשנות את ייעודו לקידום התמיינות תאי שיער בשבלול 40,41 הפגום. מבוא של Atoh1 לתאי iMOP עשוי לעזור לקדם התמיינות תאי שיער. בdeveloping שבלול, שני Ngn1 וNeuroD1 נדרשים לבידול SGN נכון in vivo 42-44. ביטוי של Ngn1 או NeuroD1 בתאי iMOP עשוי לקדם בידול SGN. ניסויים אלה דומים לתאים לייצר מושרה עצביים (ב), שבו ביטוי של TFS בנפרד או בשילוב יכול להמיר fibroblasts או תאי גזע pluripotent לתוך הנוירונים 45-48. מבוא של TFS שבדרך כלל לידי ביטוי בהתפתחותם של תאי שיער או SGNs הוא אסטרטגיה טובה למנחת תאי iMOP כלפי תא השיער או שושלת SGN.

תנאים המקדמים בידול של מספר גדול של תאי שיער הנגזר iMOP וSGNs יספק פלטפורמה סלולרית חזקה לדוגמנות מחלה, הקרנת מולקולה קטנה ובדיקות רעלים שניתן להשיג במהירות וביעילות לפני בדיקות עתירות עבודה במכרסמים הם יזמו . הפרוטוקול המתואר מציג מערכת פשוטה ורבות-תכליתית שיכול להיות מנוצלת ליםtudying בידול אב otic וניתן לניסויים בקנה מידה גדולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers BioCision BCS-405
Cryogenic Vials (2 ml)  Corning 430654
1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) Electron Microscopy Sciences 72230-01
DMEM/F12 Life Technologies 11320-082
Neurobasal Medium Life Technologies 21103
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 Life Technologies 10010-023
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14025-092
B27 Supplement (50X) Serum Free Life Technologies 17504-044 Stored as 1 ml aliquots
L-Glutamine(200 mM)  Life Technologies 25030-081 Stored as 5 ml aliquots
Natural Mouse Laminin Life Technologies 23017-015 Stored as 1 mg/ml aliquots
Click-iT EdU Alexa Fluor 488  Life Technologies C10337
Synth-A-Freeze Cryopreservation Media Life Technologies A12542-01
Prolong Gold Antifade Mountant Life Technologies 47743-736 Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Moxi Z Mini Automated Cell Counter Orflo  MXZ001
Moxi Z Cassette Type S Orflo  MXC002
Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) Peprotech 450-33 Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots
Poly-D-Lysine Sigma P7886 Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots
Carbenicillin, Disodium Salt Thermo Fisher Scientific BP2648-1 Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots
5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811D
10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) Thermo Fisher Scientific 1367811E
Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130188
Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate Thermo Fisher Scientific 130184 
Tissue Culture Treated 6 cm Dish Thermo Fisher Scientific 130181 
EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm Thermo Fisher Scientific SLGV033RS
TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip USA Scientific 1120-3810
TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip USA Scientific 1120-1810
TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl  filter tip USA Scientific 1120-8810
TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip USA Scientific 1126-7810
15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1475-0511
50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) USA Scientific 1500-1211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12, (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29, (45), 14077-14085 (2009).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26, (7), 2115-2123 (2006).
  4. Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
  5. Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12, (6), 679-685 (2009).
  6. Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235, (4), 434-446 (2010).
  7. Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16, (1), 4-18 (2012).
  8. Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30, (1), 69-74 (2012).
  9. Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490, (7419), 278-282 (2012).
  10. Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. (2013).
  11. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141, (4), 704-716 (2010).
  12. Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10, (2), 173-190 (2009).
  13. Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091, (1), 282-288 (2006).
  14. Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272, (2), 432-447 (2004).
  15. Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68, (5), 669-684 (2008).
  16. Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
  17. Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21, (4), 763-771 (2012).
  18. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (8), a008409 (2012).
  19. Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8, (7), e69314 (2013).
  20. Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32, (46), 16424-16434 (2012).
  21. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, (7), 1687-1697 (2005).
  22. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, (24), 4405-4415 (2007).
  23. Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138, (4), 735-744 (2011).
  24. Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9, (6), 444-453 (2009).
  25. Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434, (7036), 1031-1035 (2005).
  26. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30, (2), 714-722 (2010).
  27. Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4, (1), 47-60 (2015).
  28. Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
  29. Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24, (3), 568-574 (2006).
  30. Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (36), 13409-13414 (2008).
  31. Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8, (2), e56289 (2013).
  32. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, (5), 567-576 (1993).
  33. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, (6), 681-686 (2007).
  34. Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. Suppl 220. 1-44 (1967).
  35. Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234, (3), 633-650 (2005).
  36. Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133, (15), 2817-2826 (2006).
  37. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126, (8), 1581-1590 (1999).
  38. Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137, (6), 1287-1307 (1997).
  39. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
  40. Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284, (5421), 1837-1841 (1999).
  41. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11, (3), 271-276 (2005).
  42. Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128, (3), 417-426 (2001).
  43. Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14, (22), 2839-2854 (2000).
  44. Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1, (2), 129-143 (2000).
  45. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, (7359), 220-223 (2011).
  46. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, (7284), 1035-1041 (2010).
  47. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, (5), 785-798 (2013).
  48. Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18, (1), 25-35 (2015).
ייזום בידול בתאי multipotent otic אב הונצחו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).More

Azadeh, J., Song, Z., Laureano, A. S., Toro-Ramos, A., Kwan, K. Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (107), e53692, doi:10.3791/53692 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter