Protocol
1. Mantenere auto-rinnovamento nelle celle IMOP
- Preparare IMOP cultura dei media: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mg / ml carbenecillin e 20 ng / ml bFGF. Fai 50 ml di IMOP coltura utilizzando reagenti sterili. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d'acqua a 37 °.
- Disgelo 50X B27 supplemento e 100 mg / ml carbenecillin aliquote sterilizzate per filtrazione, per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Scongelare 100 mg / ml bFGF aliquota a temperatura ambiente. Aggiungere 1 ml 50X B27, 10 pl di 100 ug / ml bFGF e 12,5 ml di 100 mg / ml in DMEM carbenecillin / F12.
- Utilizzare 3 ml di media in un piatto di coltura di tessuti 60 mm per le cellule di coltura IMOP. Aggiungere mezzi freschi a culture ogni altro giorno raddoppiando il volume del supporto. Assicurarsi che la concentrazione di bFGF non scenda sotto i 5 ng / ml.
- Cultura cellule IMOP a 37 ° C con 5% di CO 2. Le cellule Passage dopo 5 - 7 giorni in coltura elencati nella procedura riportata di seguito. Cultura Trasferire in un 15ml conica utilizzando un puntale 10 ml.
- Rendere EDTA 1 mM in HBSS diluendo 0,1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 in 50 ml di HBSS. Preriscaldare 1 mM EDTA fatto in HBSS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 min. a RT. Per gravità sedimentazione, posizionare la conica 15 ml contenente le culture del C incubatore 37 ° per 5-10 minuti. Dopo tale tempo, osservare le otospheres raccolgono sul fondo del cono 15 ml.
NOTA: la forza centrifuga eccessiva può causare danni alle cellule. - Attentamente aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta senza disturbare il pellet. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di pre-riscaldato 1 mM EDTA HBSS alla cella pellet. Usando una pipetta P1000, delicatamente pipettare su e giù 2 - 3 volte. Posizionare conica a 37 ° C e incubare per <5 min a facilitare la dissociazione in cellule singole.
- Agitare delicatamente la soluzione di cellule per determinare se otospheres sono dissociate. Se no otosfere sedimentare sul fondo del cono, le cellule sono dissociate. Il tempo di incubazione può variare.
NOTA: prolungata incubazione con EDTA provoca la morte delle cellule eccessivo. - Rimuovere le cellule da 37 ° C, aggiungere 2 ml di mezzi per neutralizzare e diluire l'EDTA. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare diluito EDTA utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta e aggiungere 5 ml di PBS 1X per lavare le cellule.
- Spin giù le cellule a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare fuori 1X PBS usando una pipetta 2 ml aspirazione. Risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 0,5 ml di IMOP cultura mediatica pipettando gentilmente su e giù 2 - 3 volte.
- Contare le cellule utilizzando un contatore di particelle microfluidica con le cassette appropriate 28. Un piatto confluenti di cellule IMOP conterrà ~ 6 X10 6 celle. Diluire le cellule 1: 100 in media e aggiungere 75 ul di soluzione di cellule nel cassetto per il conteggio. Piastra 1 x 10 6 cellule in un piatto di 6 cm di IMOP culture dei media (~ 1: 10 diluizione). IMOPs Passage ogni 5 - 7 giorni.
NOTA: Le cellule che formano grandi otospheres o si attaccano al fondo del piatto di coltura tissutale saranno differenziare. Le cellule saranno anche morire se le culture sono sopra confluenti.
2. gelo e disgelo Celle IMOP
- Preparare medio di congelamento scongelamento e sintetico, per equilibrare la soluzione a 4 ° C prima di cellule congelamento.
- Raccogliere le cellule da un cm piatto di cellule IMOP confluenti 6. Utilizzare una pipetta da 10 ml e cellule di trasferimento (~ 6 - 8 x 10 6 celle) in una conica da 15 ml.
- Celle di raccolta di sedimentazione per gravità o centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Se i otospheres sono piccole, le cellule non si depositano per gravità sedimentazione. Opzionale: Contare le cellule utilizzando passo 1.9 per determinare il numero di cellule totali.
- Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2ml aspirazione pipetta lasciando il pellet sciolto dietro.
- Aggiungere 0,25 ml di media congelamento sintetici di riattivare cells ad una densità di 5 x 10 ~ 5 a 3 x 10 6 cellule / ml. Pipettare delicatamente le cellule con una pipetta P1000. Trasferire la sospensione cellulare di fiale criogeniche con una pipetta P1000 con 1 ml di filtrati punta.
- Porre le fiale in un contenitore di congelamento senza alcool e posizionare il contenitore di congelamento a -80 ° C per ridurre la temperatura di 1 ° C al minuto fino a quando la temperatura raggiunge i -80 ° C.
- Per la conservazione a lungo termine delle cellule, trasferire i flaconi alla fase vapore di un serbatoio di stoccaggio azoto liquido. Per scongelare le cellule per la cultura, equilibrare fiala criogenico contenente cellule congelate a -80 ° C.
- Terreni di coltura IMOP Pre-caldo in un bagno di 37 ° C Acque.
- Scongelare il flacone congelato rapidamente agitando il fondo della provetta in un bagno di acqua 37 ° C. Aggiungere 1 ml di terreni di coltura pre-riscaldato IMOP alle cellule scongelate una volta che il cristallo glaciale scompare. Trasferire le cellule in un ml conica 15 e aggiungere un ulteriore 4 ml di IMOP cultura mediatica
- Gira la 15 ml conico per 5 min. a 200 xg e aspirare i media spesi. Risospendere le cellule in 2 ml di terreni di coltura e le cellule IMOP piastra in un piatto 6 cm. Incubare culture a 37 ° C con 5% di CO 2 per l'espansione.
3. differenziazione delle cellule IMOP in epiteli sensoriali
- Preparare 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali: DMEM / F12, 1X B27 supplemento, 25 mcg / ml carbenecillin. Fai 50 ml di IMOP supporti differenziazione epiteli sensoriali. Warm up 49 ml di DMEM / F12 in una conica da 50 ml in un bagno d'acqua a 37 °. Supplemento B27 disgelo 50X e 100 mg / ml carbenecillin aliquote per 5 min. in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 12,5 ml di 100 mg / ml carbenecillin in DMEM / F12.
- Per raccogliere, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetere i passaggi 1,4-1,9
- Piastra 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Giorno -3 utilizzando IMOP coltura. Il giorno 0, culture di trasferimento con una pipetta 10 ml in una conica da 15 ml. Raccogliere il otosfere di gravità sedimentazione a quanto dichiarato nella fase 1.6. Aspirare trascorso multimediale utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres sul fondo del cono.
- Aggiungere delicatamente in 2 ml di mezzi differenziazione sensoriale epiteli. Trasferimento otospheres a un piatto 6 centimetri con un grande foro da 10 ml pipetta.
NOTA: tosatura meccanica da duro pipettaggio può dissociarsi cellule dagli otospheres. - Aggiungere 2 ml di fresco supporti differenziazione epiteliale sensoriale culture ogni altro giorno. Se necessario, le cellule possono essere raccolte mediante sedimentazione gravità e supporti sostituito.
- Raccogliere otospheres al giorno 10 con il trasferimento ad un ml conica 15 e permettendo ai otospheres di sedimentare, come indicato al punto 1.6.Aspirate media spesi utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i otospheres indisturbati.
- Fissare otospheres incubando a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione di formaldeide, lavare otospheres con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente 10% siero di capra normale e 0,1% Triton X-100) per 1 ora.
- Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l'anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 soggetti la otosphere dell'immunocolorazione 27. Trasferire otospheres in PBS 1X e luogo otospheres in mezzo di montaggio su un vetrino con una pipetta P1000. Mettere un vetrino sul campione e permettono mezzi di montaggio a secco a 4 ° C.
- Acquisire immagini epifluorescenza utilizzando una configurazione microscopio rovesciato dotato di una fotocamera CCD a 16 bit e di un aereo o di un 20X 0,75 NA obiettivo 40X 1.3 immersione in olio. Raccogliere la fluorescenza da diversi canali di colore utilizzando la elencati (di eccitazione e di emissione) le lunghezze d'onda: blu (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), verde (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), rosso (562 ± 20 nm / e 625 20nm ±) e infrarossi (628 ± 20 nm / e 692 ± 20nm).
4. Saggio EdU Costituzione
- Il giorno -3, piastra 1 x 10 6 cellule IMOP in un piatto di 6 centimetri. Tre giorni dopo il giorno 0, vendemmia, dissociarsi, risospendere e contare le cellule ripetendo i passi 1.4-1.9.
- Piatto 2,5 x 10 5 cellule in mezzi di coltura IMOP e 5 x10 5 cellule in sensoriale mezzi differenziazione epiteli in diversi pozzetti di un piatto 6 bene.
- Determinare la percentuale di cellule in fase S di Edu incorporazione il giorno 3 utilizzando un saggio di incorporazione EdU
- Aggiungere EdU magazzino direttamente alle culture IMOP per ottenere una concentrazione finale di 1 micron EdU nei mezzi di coltura.
- Incubare EdU nelle culture IMOP per 2 ore e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2. Harvest, dissociare e raccogliere le cellule ripetere i punti 1.4-1.9. Aggiungere a 4% formaldeide in PBS 1X per 15 min. a RT per riparare le cellule. Celle di raccolta per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di formaldeide e properly smaltire.
- Etichetta nuclei di cellule con la Hoechst e incorporati EdU con verde fluorescente dye-azide secondo il protocollo del produttore.
NOTA: Tutti i lavaggi sono fatti con PBS 1X, 3% BSA e lo 0,1% di cellule Tween 20. Lavare con PBS 1X due volte. - Montare le cellule su un vetrino utilizzando antifade reagenti e posizionare un bicchiere di 1,5 copertura sul campione. Acquisire le immagini fluorescenti di cellule marcate con un epifluorescenza.
5. Differenziare neuroni IMOP-Derived
- Fai 50 ml di media differenziamento neuronale: Neurobasal multimediali, 1X B27 supplemento, 2 mM L-glutammina. Bottiglia disgelo di 50X B27 e 200 mm L-glutammina in 37 ° C bagnomaria per 5 min. Aggiungere 1 ml 50X B27 e 0,5 ml 200 mm L-glutammina a 48,5 ml di mezzi Neurobasal.
- Cappotto coprioggetti mettendo 12 mm rotonde 1,5 vetrini in un piatto sterile, 10 centimetri e aggiungere il 70% EtOH al piatto per sterilizzare e pulire le lamelle.
- Agitare delicatamente la baiarslips per assicurarsi che sono coperti in etanolo. Lasciare la piastra per 10 minuti a RT. Lavare i coprioggetti 3 volte con sterili 1X PBS per lavare l'etanolo residuo. Sciacquare il vetrino una volta con H 2 0 sterili per lavare rimanente PBS 1X.
- Aspirare il H 2 0 utilizzando un 2 ml aspiranti pipetta e lasciare i coprioggetti asciutto. Esporre i coprioggetti alla luce UV nella cappa coltura tissutale per 15 min. Conservare coprioggetto in un ambiente sterile, se non utilizzato immediatamente.
- Posizionare vetrino uno 12 millimetri rotonda in ogni pozzetto di un piatto 24 bene. Agitare gentilmente piastra per garantire che i coprioggetti sdraiarsi sul fondo del pozzo.
- Scongelare 2 mg / ml di soluzione di lisina poli-D-at RT e diluire a 10 ug / ml concentrazione poli-D-lisina in 1X PBS. Aggiungere 0,25 ml di 10 ug / ml di poli-D-lisina ai pozzetti. Lasciare la piastra nel 37 ° C incubatore per 1 ora.
- Lavare i pozzetti 3 volte con sterili 1X PBS. Thaw / ml di soluzione laminina magazzino 10 mg a temperatura ambiente e portare a 10 mg / ml in PBS 1X. Aggiungere 0,25 ml di 10 mg / ml soluzione di lavoro laminina in un singolo pozzetto di un piatto 24 multi-pozzo. Incubare la piastra a 37 ° C incubatore. Aspirare la soluzione laminina utilizzando un 2 ml aspirazione pipetta.
- Lavare il coprioggetto 3 volte con PBS 1X aggiungendo in 1 ml di PBS 1X con una pipetta P1000 e rimuovendo il 1X PBS aspirando con 2 ml aspiranti pipetta. Lasciare PBS 1X da ultimo lavaggio del bene fino a quando le cellule sono pronte per essere placcato. Avviare la differenziazione neuronale per la raccolta, dissociandosi e il conteggio delle cellule nei passaggi 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 cellule in una capsula di 6 cm in Day -3.
- Il giorno 0, vendemmia, dissociarsi e contare le cellule ripetendo 1,4-1,9. Seed 1 x 10 5-1,5 x 10 5 cellule IMOP in 0,5 ml di pre-riscaldato multimediali differenziamento neuronale per bene in un piatto multi-pozzo 24. Aspirare e aggiungere pre-riscaldato supporti differenziamento neuronale a culture ogni altro giorno.
- Fissare neuroni IMOP derivati a 4% di formaldeide per 15 min. unt RT il giorno di soluzione di formaldeide 7. Rimuovere, lavare i neuroni IMOP derivati con tampone di lavaggio (1X PBS contenente 0,1% TritonX-100) prima di incubazione in tampone di bloccaggio (1X PBS contenente il 10% di siero normale di capra e lo 0,1% Triton X-100) per 1 ora.
- Sostituire buffer e incubare i campioni in tampone di bloccaggio con l'anticorpo diluito. Incubare a 4 ° C. Lavare i campioni con 1X PBS contenente 0,1% Triton X-100 cellule soggette a immunocolorazione 27. Lavare il coprioggetti con PBS 1X prima di mettere su un supporto di montaggio. Lasciare i supporti di montaggio a secco a 4 ° C prima di acquisire immagini epifluorescenza come indicato al punto 3.8.
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Representative Results
bFGF Ritiro Decrementi proliferazione in cellule IMOP
Per diminuire la capacità proliferativa delle cellule IMOP e avviare la differenziazione delle cellule IMOP, bFGF è stato ritirato dalle culture. Per confermare che il fattore di crescita ritiro diminuisce la proliferazione, EdU incorporazione è stato impiegato come un saggio di proliferazione. La percentuale di cellule che incorporava EdU da otospheres coltivate con terreni di coltura IMOP (contenenti bFGF) e otospheres coltivate nei media epiteli sensoriali (senza bFGF) è stato confrontato. Culture Otosphere state pulsate con l'analogo nucleotidico EdU, raccolte e fissa. Nucleotidi Incorporated EdU stati fluorescente con AlexaFluor 488 azide tramite click-chimica. Le cellule di otospheres cresciute in assenza di bFGF mostrava diminuita incorporazione di EdU rispetto alle cellule in coltura con bFGF (Figura 1A-F). Come la dimensione of il otosphere aumentato, era sempre più difficile da visualizzare tutte le cellule dal otosphere con un microscopio epifluorescente. A questo scopo, le cellule sono state dissociate e montati in modo che possano essere inequivocabilmente visualizzate in massa. Anche dopo la dissociazione e la fissazione, le cellule ri-aggregato. Per mantenere le cellule in uno stato di dissociazione, detersivi che impedivano le cellule da ri-aggregante sono stati testati. Tween 20 è stato uno dei detergenti che impedivano riaggregazione delle cellule. Cellule dissociate sono state lavate con 0,1% di Tween 20 e montate su vetrini. Cellule etichettate EdU sono state poi visualizzati mediante microscopia in epifluorescenza (Figura 1G, H). Risultati rappresentativi dei singoli esperimenti (n = 5) hanno mostrato una significativa diminuzione della percentuale di cellule EdU etichettato dal 48% al 19% dopo 3 giorni dopo la sospensione bFGF (p <0.005). Questi risultati confermano un drastico calo della percentuale di cellule in fase S e potenziale proliferativo di cellule IMOP doporitiro bFGF.
IMOP di derivazione sensoriale epiteli espresso CDKN1B e Mostra morfologica modifiche
Una cronologia di IMOP sensoriale protocollo differenziazione epiteli è mostrato (Figura 2A). Otospheres di culture proliferativa sono dissociate in singole cellule e ha permesso di recuperare per 3 giorni di coltura IMOP mezzi. Questo metodo contribuisce ad arricchire di cellule proliferanti e seleziona contro le cellule post-mitotiche in queste culture di partenza. Dopo 3 giorni, otospheres neoformati sono state seminate in sensoriale mezzi differenziazione epiteli e lasciati differenziarsi unguided per 10 giorni. Immagini in campo chiaro delle culture tipiche contenenti otospheres in diversi momenti dopo la semina ha mostrato un calo iniziale nel formato prima di iniziare otospheres aumento delle dimensioni (Figura 2B-E).
27. Per determinare se l'espressione di CDKN1B (p27 KIP) può essere utilizzato come marcatore per la differenziazione, sono stati confrontati otospheres da epiteli differenziata culture IMOP proliferativo o sensoriali. Marcatori fluorescenti sono stati visualizzati e catturati mediante microscopia in epifluorescenza. Immagini rappresentative della otospheres provenienti da culture proliferative mostrato bassa espressione di CDKN1B fuori dei nuclei con quasi nessuna falloidina colorazione (Figura 3 dC). Otospheres coltivate in mezzi sensoriali differenziazione epiteli visualizzata aumentata espressione di CDKN1B concomitante nucleare con la comparsa di etichettatura falloidina nei bordi periferici delle cellule (Figura 3 EH). In proliferanti otospheres IMOP, CDH1 (E-cadherin) e phalloidin sono debolmente etichettati (Figura 3 IL). In otospheres IMOP differenziate, falloidina pronunciato ed etichettatura CDH1 evidenziano le alterazioni morfologiche filamenti e nelle regioni di adesione cellula-cellula (Figura 3 MP), simili ai risultati precedenti 27 actina. Durante la differenziazione epiteli sensoriali, le alterazioni morfologiche filamenti di actina parallelo la comparsa di espressione CDH1 in siti di adesione tra le cellule. In questo protocollo, l'aumento di espressione CDKN1B insieme con i cambiamenti nella falloidina e CDH1 servire come indicatori precoci di differenziazione epiteli sensoriali nelle cellule IMOP.
IMOP di derivazione neuroni espresso CDKN1B e Tubb3
Uno schema di IMOP protocollo differenziazione neuronale è mostrato (Figura 4A). Simile al protocollo di cui sopra, le cellule sono state IMOP dissociate e allowed di recupero per 3 giorni di coltura IMOP mezzi. Otospheres sono state raccolte, dissociate in singole cellule e seminate su poli-D-lisina e laminina rivestite coprioggetto. Le cellule sono state permesso di differenziare per 7 giorni. Immagini in campo chiaro rappresentativi a intervalli di tempo visualizzati cambiamenti morfologici progressivi mentre differenziate in neuroni IMOP-derivati (Figura 4B-E). By Day 7, lunghi neuriti può essere visto che si estende da corpi cellulari (punte di freccia Figura 4E). Per determinare i cambiamenti nei livelli di espressione di CDKN1B durante la differenziazione neuronale, cellule proliferanti IMOP e neuroni IMOP derivati sono stati confrontati. Otospheres sono stati etichettati con anticorpi Hoechst e CDKN1B. cellule IMOP da otospheres proliferanti avevano poche cellule con bassa espressione CDKN1B nucleare (Figura 4 FH). Inoltre, i neuroni IMOP derivati hanno mostrato un aumento del numero di cellule con espressione CDKN1B nucleare 7 giorni dopo la differenziazione neuronale (Figura 4IK). Per determinare se le cellule sono state CDKN1B adottando una linea neuronale, l'etichettatura dei neuroni IMOP derivati con il marcatore neuronale Tubb3 è stato fatto. Immagini rappresentative di neuroni IMOP derivati hanno mostrato co-etichettatura dei CDKN1B e Tubb3 (Figura 5 dC). Ingrandimento e quantificazione dei neuriti da queste cellule hanno mostrato una media di 1,5 neuriti associati ad ogni Tubb3 etichettati cellule (n = 60) (Figura 5 EG). Nel nostro protocollo differenziazione neuronale, immunocolorazione con CDKN1B e Tubb3 può essere utilizzato come indicatore di differenziazione in neuroni IMOP derivato bipolare o pseudo-unipolari.
Livelli di espressione nucleare CDKN1B aumentare dopo l'inizio della differenziazione
I cambiamenti morfologici otospheres mostrano cambiamenti qualitativi nelle cellule IMOP mentre subiscono differenziazione. Per ottenere risultati quantitativi del Immuimmagini nofluorescence per indicare eventi di differenziazione precoce, intensità di fluorescenza nucleare di CDKN1B da singole cellule proliferanti IMOP (n = 239) e le cellule in fase di differenziazione IMOP epiteli sensoriali (n = 246) sono stati misurati. Per normalizzare CDKN1B segnali di fluorescenza da esperimenti indipendenti, il rapporto di CDKN1B alla Hoechst fluorescenza da cellule individuali è stato determinato. Istogrammi l'intensità di fluorescenza normalizzato di CDKN1B dalle cellule proliferanti IMOP (nero) e epiteli sensoriali di differenziazione delle cellule IMOP (rosso) sono state tracciate (figura 6A). Un aumento del numero di cellule che esprimono alti CDKN1B stato osservato uno spostamento verso destra dell'istogramma di differenziazione epiteli sensoriali (rosso) rispetto alla istogramma cellule proliferanti IMOP (nero). Per determinare l'aumento della percentuale di cellule che esprimono CDKN1B, una soglia per unità di intensità di fluorescenza normalizzato CDKN1B (0.65) è stato impostato (freccia) e la percentuale di cellule ABO ve la soglia è stata determinata. Dopo la differenziazione epiteli sensoriali, le cellule IMOP esposti un aumento dal 25,3% al 67,1% di cellule che esprimono CDKN1B (Figura 6B). La stessa analisi quantitativa è stata applicata ai neuroni IMOP derivati. Quando si confrontano le cellule proliferative IMOP (n = 525) e 7 giorni neuroni IMOP-derivato (n = 583) uno spostamento a destra nell'istogramma associata con i neuroni IMOP-derivati è stato osservato rispetto alla istogramma cellule proliferanti IMOP (Figura 6C). Determinazione della percentuale di cellule sopra la soglia rivelato un aumento delle cellule esprimenti CDKN1B dal 23,5% al 85,5% (Figura 6D). Utilizzando i protocolli descritti, analisi quantitativa dell'espressione CDKN1B confermato un aumento del numero di cellule che upregulate CDKN1B durante epiteli sensoriali e differenziazione neuronale. Le aumento del numero di cellule che esprimono CDKN1B possono essere usati per confermare la differenziazione delle cellule IMOP in questi protocolli.
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Figura 1. EdU Costituzione come un test per determinare proliferativa Stato delle Culture IMOP. IMOP di derivazione otospheres coltivati in presenza di bFGF. I nuclei di cellule sono state etichettate con (A) Hoechst e (B) EdU AlexaFluor 488. (C) immagine fusa di Hoechst e EdU fluorescenza. Otospheres coltivati 3 giorni nei media privi bFGF. Le cellule ottenute da colture sono state marcate con (D) e Hoechst (E) EdU AlexaFluor 488. (F) le immagini unite l'etichettatura Hoechst e EdU. Immagini di fluorescenza unite di Hoechst (magenta) e EdU (verde) cellule marcate dopo dissociazione otospheres e lavaggio con 1X PBS contenente 0,1% di Tween 20. Le cellule sono state coltivate da otospheres (G) in presenza di bFGF o (H) assenza di bFGF. Lunghezza di scalabar sono 10 micron, se non indicato. (I) Percentuale EdU etichettato cellule da cellule IMOP coltivate in presenza o assenza di bFGF. Il numero delle singole cellule analizzate è stato indicato all'interno delle barre grafico a barre e di errore sono stati raffigurato come errore standard della media (SEM). Conta delle cellule sono stati da n = 5 esperimenti indipendenti. T-test di Student è stato fatto per determinare la significatività statistica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema generale di differenziazione sensoriale epiteli. (A) Timeline per la differenziazione delle cellule IMOP in epiteli sensoriali. Il grafico a linee rappresenta il momento della dissociazione delle cellule e dei cambiamenti dei media. (B) contrasto di fase tipicaimmagini di otospheres al giorno 0, (C) 3, (D) e 7 (E) 10 durante il differenziamento non guidato epiteli sensoriali. Lunghezza della barra della scala è di 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'espressione di marcatori indicativi di arresto del ciclo cellulare e la differenziazione in IMOP di derivazione sensoriale epiteli. Otosphere di cellule coltivate in coltura IMOP IMOP dei media. I nuclei di cellule sono state etichettate con (A) e Hoechst anticorpo (B) CDKN1B. Actina filamentosa è stato etichettato con (C) falloidina. (D) L'immagine risultante dalla fusione di un tipico otospheres contenenti cellule proliferanti IMOP. Otospheres dalle cellule IMOP sono state coltivate in epith sensorialeelia terreni di coltura per 10 giorni. Le cellule sono state contrassegnate da otopsheres con (E) Hoechst, (F) CDKN1B e (G) falloidina. (H) immagine unita di otospheres mostrando aumento CDKN1B ed etichettatura falloidina. Otospheres proliferanti sono stati etichettati con (I) Hoechst, (J) CDH1, (K) falloidina. (L) L'immagine risultante dalla fusione mostra fluorescenza debole da questi marcatori. Otospheres differenziate in epiteli sensoriali sono stati etichettati con (M) Hoechst, (N) CDH1, (O) falloidina. (P) L'immagine risultante dalla fusione mostra forte etichettatura tipico CDH1 e falloidina. Lunghezza di barre di scala sono 10 micron a meno indicato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Schema generale di differenziazione neuronale. (A) Timeline per la differenziazione delle cellule IMOP in neuroni. Immagini a contrasto di fase di cellule IMOP sottoposti differenziamento neuronale in (B) 1 ° giorno, (C) 3, (D) 5 e (E) 7. frecce indicano neuriti. Immagini di fluorescenza di cellule in coltura come otospheres IMOP in terreni di coltura IMOP contrassegnati con (F) e Hoechst (G) CDKN1B. (H) immagine unita di cellule marcate con Hoechst e CDKN1B. Immagini di fluorescenza di cellule IMOP dopo 7 giorni di coltura in mezzi differenziamento neuronale. I nuclei di cellule sono state etichettate con (I) e Hoechst (J) CDKN1B. (K) immagine unita di cellule marcate con Hoechst e CDKN1B. Lunghezza di barre di scala sono 10 micron a meno che celebre. om / files / ftp_upload / 53.692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. L'espressione di marcatori molecolari indicativo di Exit ciclo cellulare e la differenziazione neuronale. IMOP cellule 7 giorni dopo la differenziazione neuronale. I nuclei sono stati etichettati con (A) Hoechst, (B) Tubb3 (β-tubulina neuronale) anticorpi per evidenziare la morfologia cellulare e anticorpi (C) CDKN1B. (D) immagine unita con l'etichettatura di CDKN1B e Tubb3 in singole cellule. Lunghezza della barra della scala è di 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. cellulare Singola intensità quantitativa fluorescenza Analisi di CDKN1B. (A) di fluorescenza normalizzato di intensità dell'espressione CDKN1B è stata determinata calcolando il rapporto tra CDKN1B e Hoechst fluorescenza da cellule singole. L'intensità di fluorescenza normalizzato stata stampata relative ai numeri di cellule come un istogramma. Sono presenti intensità di fluorescenza normalizzato di CDKN1B da cellule proliferanti IMOP coltivate in presenza di bFGF (nero) e otospheres IMOP differenziato in epiteli sensoriali (SE) (rosso). Una soglia è stata fissata a 0.65 normalizzati unità di intensità di fluorescenza (punta di freccia) (B) Percentuale di cellule che esprimono IMOP CDKN1B sopra il valore di soglia, la proliferazione (nero) e epiteli differenziata culture sensoriali (rosso). (C) uniti immagine fluorescente sensoriali epiteliali differenziate cellule IMOP etichettati con anticorpi Hoechst e Myo6. (D (E) la percentuale di cellule che esprimono IMOP CDKN1B proliferazione (nero) e neuronali differenziare le culture (rosso). Le singole celle utilizzati per l'analisi sono stati indicati in ogni grafico a barre. I risultati sono stati compilati da diversi esperimenti (n = 3) e le barre di errore raffigurati come SEM. Il test t di Student è stato utilizzato per determinare la significatività statistica. (F) uniti immagine fluorescente bipolare o neuroni IMOP di derivazione pseudo-unipolare etichettati con la Hoechst e Tubb3. Lunghezza di barre di scala sono 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Coltura cellulare Vessel | Surfaccia Area (cm 2) | Numero di cellule seminate per la manutenzione ordinaria | Numero di cellule seminate per sensoriale epiteli Differenziazione | Numero di cellule seminate per la differenziazione neuronale | Fattore di scala relativa a 60 mm Dish | Volume di supporto Serve (ml) | |
| Piastre Multwell | |||||||
| 96 | 0.3 | 10.000 | 20.000 | 10,000-50,000 | 0,015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 90.000 | 180.000 | 100.000-150.000 | 0.100 | 0.5 | |
| 12 | 4 | 180.000 | 360.000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| Piatti | |||||||
| 35 mm | 10 | 500.000 | 1.000.000 | 500.000 | 0.500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1.000.000 | 2.000.000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2.500.000 | 5.000.000 | 2,500,000- 3.000.000 | 3.000 | 8 | |
Tabella 1. numero di cellule per la manutenzione di differenziazione delle cellule IMOP in VarFormati Cultura piastra tessuto ious.
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Discussion
Monitoraggio Culture IMOP
Un protocollo per mantenere auto-rinnovamento e promuovere la differenziazione di una linea cellulare IMOP romanzo è descritto e formati placcatura aggiuntivi sono inclusi (Tabella 1). Diversi passaggi critici che aiutano con l'espansione di routine e la differenziazione delle cellule IMOP sono noti. Simile a colture di cellule staminali pluripotenti, le cellule IMOP teoricamente hanno una durata indefinita. Per garantire che le linee cellulari siano adeguatamente mantenuti, culture IMOP sono regolarmente monitorati per la vitalità cellulare, l'auto-rinnovamento e potenziale di differenziazione. Per determinare la vitalità cellulare dopo la dissociazione, ci avvaliamo di trypan colorazione blu. In generale, più del 70% delle cellule sono vitali dopo la dissociazione. Per monitorare auto-rinnovamento delle cellule IMOP, immunostaining con c-Myc e anticorpi di Sox2 è fatto. In condizioni di coltura proliferative, le cellule IMOP hanno un tempo di raddoppio di ~ 18 ore. Alterazioni nell'espressione di marcatori di auto-rinnovamento o faretempo ubling sono potenziali indicatori di alterata auto-rinnovamento. Per monitorare il potenziale differenziazione delle cellule, IMOP uscita ciclo cellulare e l'espressione dei marcatori fase iniziale in epiteliali o neuroni sensoriali sono utilizzati per valutare il potenziale di differenziazione delle cellule. Se le cellule IMOP non passano uno qualsiasi dei criteri sopra descritti, sarebbe opportuno interrompere le culture.
Le variabili che influenzano le culture IMOP
Un passo fondamentale nella coltura di cellule IMOP è quello di mantenere una concentrazione attiva di bFGF nelle colture di promuovere l'auto-rinnovamento. bFGF è riferito altamente labile a 37 ° C quando la coltura cellule 29,30. La crescita delle culture può essere significativamente influenzato da differenziazione spontanea a causa di bFGF instabilità. Nel protocollo corrente, mezzi freschi è costantemente alimentata alle culture, al fine di mantenere i livelli di bFGF superiori 5 ng / ml. Stabilizzazione dei livelli di bFGF utilizzando rilascio controllato daglicolico e acido lattico microsfere di poliestere potrebbero ridurre la frequenza delle variazioni di mezzi necessari per mantenere livelli stabili di bFGF nei media 31. Aggiunta del costantemente rilasciabile bFGF ridurrà la necessità di aggiungere frequentemente media per mantenere i livelli di bFGF nelle culture IMOP.
Un altro passo fondamentale nel mantenimento della vitalità delle cellule IMOP è quello di limitare l'esposizione ai reagenti di dissociazione e taglio meccanico. Nel protocollo corrente, la dissociazione è compiuta incubazione con 1 mM EDTA. Frenare eccessivo tempo di incubazione con EDTA, ridurre l'eccessiva taglio meccanico causato pipettando vigoroso e limitando più fasi di centrifugazione quando passaging cellule IMOP, contribuirà ad aumentare la vitalità cellulare. L'attenzione data a questi passaggi può mantenere efficacemente la vitalità di un gran numero di cellule durante l'espansione delle culture.
Durante la coltura di cellule di routine IMOP, diversi metodi per dissociare le cellule sono state testate. Mechantranciatura ical pipettatura può essere utilizzato dissociare otospheres, ma non uniforme o costantemente produrre cellule singole. Uso di reagenti disponibili in commercio per la dissociazione cellulare delle cellule IMOP può effettivamente generare cellule singole da otospheres, ma questi reagenti influenzare le proprietà adesive delle cellule riformare otospheres e di aderire alle superfici trattate. Per poter utilizzare reagenti commerciali, diversi lavaggi sono stati tenuti a rimuovere i reagenti dissociazione prima che impiegano protocolli di differenziazione.
Nei protocolli di differenziazione attuali, sia in condizioni epiteli e differenziazione neuronale sensoriali provocato morte cellulare che è stato osservato in forma di singole cellule o grumi di cellule morte. Morte cellulare apoptotica potrebbe essere dovuto alla mancanza di un'adeguata differenziazione o sopravvivenza segnali durante la coltura in vitro prolungata. Entrambe le condizioni di differenziazione contenute supplemento B27 per promuovere la sopravvivenza delle cellule. Sebbene B27 supplement ha dimostrato di promuovere la sopravvivenza di neuroni ippocampali primari 32, può non essere sufficiente per promuovere la sopravvivenza di cellule IMOP. L'aggiunta di composti come l'inibitore ROCK può aiutare a mantenere e aumentare la sopravvivenza delle cellule IMOP durante la coltura di routine e nella differenziazione in vitro. Inibitore ROCK è stato ampiamente utilizzato in colture di cellule staminali pluripotenti per promuovere la sopravvivenza delle cellule in culture liberi di siero senza influenzare il differenziamento 33. L'aggiunta di inibitore ROCK ai terreni di coltura può aiutare ad aumentare la sopravvivenza delle cellule durante i protocolli di differenziazione lunghi senza influenzare il potenziale di differenziazione delle cellule IMOP. Aumento della sopravvivenza delle cellule permetterà sviluppo di protocolli per generare in modo efficiente grandi quantità di cellule ciliate mature o Sgns.
Aumento dell'espressione CDKN1B come marker precoce di IMOP Differenziazione
Durante le prime fasi dello sviluppo cocleare, l'evento iniziale di cellulauscita ciclo precede la differenziazione per cellule ciliate, cellule di sostegno e Sgns 34. Mitosi terminale dei progenitori neuronali diffonde in onda a partire dalla base e procedendo verso l'apice della coclea 35. In una pendenza opposta, mitosi terminale dei progenitori prosensory che danno origine a cellule ciliate e cellule di sostegno progredisce dall'apice alla base della coclea 34,36. Sebbene l'espressione temporale di CDKN1B correla bene allo stato post-mitotico, è molto probabilmente non l'unico fattore che promuove uscita ciclo cellulare nella coclea sviluppo. A sostegno di questo, CDKN1B animali mutanti possono ancora sviluppare cellule ciliate post-mitotico 37. Invece, CDKN1B può essere utilizzato come un primo indicatore per segnare l'inizio della differenziazione. Nelle culture differenziazione IMOP non guidate, un marker precoce di differenziazione aiuterà a sviluppare protocolli per promuovere prime fasi della differenziazione prima evidenti caratteristiche morfologiche possono essere osservati. </ p>
Simile allo sviluppo dell'orecchio, uscita ciclo inizia la differenziazione e si traduce in un aumento dei livelli CDKN1B nelle cellule IMOP. In cellule proliferanti IMOP, solo espressione basso livello di CDKN1B può essere osservato. Altri inibitori della chinasi ciclina dipendenti, come CDKN1A (p21 CIP) possono essere responsabili di normale progressione del ciclo cellulare nelle cellule IMOP. Durante epiteli sensoriali e la differenziazione neuronale di cellule IMOP, singola cella analisi quantitativa ha rivelato un sottogruppo di cellule con aumento dell'espressione di CDKN1B nel differenziare le culture IMOP (Figura 6A, C). Espressione di CDKN1B in queste cellule sono un'indicazione di cellule IMOP sottoposti differenziazione terminale.
Le cellule IMOP come piattaforma Cellular per lo Studio delle cellule Fate Determinazione
Dal momento che le cellule IMOP può passare da uno stato progenitore di diversi lignaggi otic in vitro, possono essere utilizzati per studiare il destino delle cellule oticdeterminazione. Attualmente, il protocollo descritto utilizzato procedure di differenziazione non guidati per generare diversi tipi di cellule otic. Il sistema permette IMOP per l'aggiunta di molecole bioattive, composti e geni definiti che guidano le cellule IMOP verso la cella di capelli maturi, cellule di supporto e lignaggi SGN. Un uso di IMOP piattaforma cellulare è di prova per trascrizioni candidati fattori (TF) che promuovono la differenziazione. L'espressione di TF tasto può essere usato per guidare cella capelli o la differenziazione neuronale. Espressione di CDKN1B con marcatori stabiliti o caratteristiche morfologiche delle cellule ciliate e Sgns può essere usato per determinare il contributo di TF candidati a diversi lignaggi otic 38,39.
TF candidati come la Atoh1 sono essenziali per lo sviluppo delle cellule dei capelli e sono stati riutilizzati per promuovere la differenziazione delle cellule dei capelli nel 40,41 coclea danneggiata. Introduzione del Atoh1 in cellule IMOP può contribuire a promuovere la differenziazione delle cellule dei capelli. Nel developing coclea, sia Ngn1 e NeuroD1 sono necessari per una corretta differenziazione SGN in vivo 42-44. L'espressione di Ngn1 o NeuroD1 in cellule IMOP può promuovere SGN differenziazione. Questi esperimenti sono simili alle cellule che generano indotte neuronali (in), in cui l'espressione del TF singolarmente o in combinazione può convertire fibroblasti o cellule staminali pluripotenti in neuroni 45-48. Introduzione del TF che sono normalmente espressi durante lo sviluppo delle cellule ciliate o Sgns è una buona strategia per guidare le cellule IMOP verso la cella di capelli o SGN lignaggio.
Le condizioni che favoriscono la differenziazione di un gran numero di cellule e Sgns capelli IMOP di derivazione forniranno una piattaforma cellulare robusta per modellare la malattia, lo screening piccola molecola e test tossicologici che può essere realizzato in modo rapido e vantaggioso costo prima di avviare i test ad alta intensità di manodopera nei roditori . Il protocollo descritto presenta un sistema semplice e versatile che può essere utilizzata per studying differenziazione progenitore otica ed è suscettibile di esperimenti su larga scala.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
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