Protocol
1. IMOP細胞における自己再生を維持
- DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリンおよび20 ng / mlのbFGF：培養培地をiMOP準備します。無菌の試薬を用いてiMOP培養培地50mlをしてください。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。
- 解凍50X B27サプリメント、37℃の水浴中で5分間、フィルター滅菌し100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 RTで100μg/ mlのbFGFのアリコートを解凍します。 DMEM / F12には100μg/ mlのbFGFの1ミリリットル50X B27、10μLおよび100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。
- 培養iMOP細胞を60 mm組織培養皿内のメディアの3ミリリットルを使用してください。メディアの容量を倍にして、一日おきに培養物に新鮮な培地を追加します。 bFGFのその濃度が5 ng / mlで以下に低下しないことを確認してください。
- 5の後、5％のCO 2継代細胞と37℃で培養iMOP細胞-培養7日以下の手順に記載されています。 15に転送する文化10 mlピペットチップを用いmLコニカル。
- HBSS 50mlに0.5MのEDTA pH8.0の0.1mlの希釈してHBSS中1mMのEDTAを行います。プレ暖かい1mMのEDTA、37℃の水浴中でHBSSで作ら。
- 5分間200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 RTで。 10分 - 重力沈降のために、5、37℃のインキュベーターで培養液を含む15ミリリットルの円錐を配置します。その時間の後、otospheresを観察し、15 mLコニカルの底に集めます。
注：過度の遠心力は、細胞の損傷を引き起こす可能性があります。 - 慎重に吸引細胞ペレットを乱すことなく、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。細胞ペレットに予め温めておいた1mMのEDTAのHBSS溶液0.5mlを追加します。 P1000ピペットを使用して、静かにアップピペット上下2から3回。 37℃の円錐形を置き、単一細胞に解離を促進するために、<5分間インキュベートします。
- 穏やかotospheresが解離しているかどうかを決定するために細胞溶液を渦。おと場合球は、細胞が解離され、円錐形の底に沈殿します。インキュベーションの時間が異なる場合があります。
注：EDTAで長時間のインキュベーションは、過剰な細胞死をもたらすでしょう。 - 37°Cから細胞を取り出し、EDTAを中和し、希釈するために、メディアの2ミリリットルを追加します。室温で5分間、200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。吸引除去が出て2ミリリットル吸引ピペットを用いて、細胞を洗浄するために1×PBSの5ミリリットルを追加し、EDTAを希釈しました。
- 室温で5分間、200×gで細胞をスピンダウンし、2ミリリットル吸引ピペットを用いて1×PBSを吸引除去します。 3回 - 優しくピペッティングと2ダウンによってiMOP培養培地0.5mlにP1000ピペットを用いて細胞を再懸濁します。
- 適切なカセット28とマイクロ流体パーティクルカウンターを用いて細胞を数えます。 iMOP細胞のコンフルエントプレートが〜6 X10 6個の細胞が含まれています。細胞1希釈：メディアで100を計数するためのカセットに細胞溶液75μlのを追加します。プレートiMOP cultu 6cmの皿で1×10 6個の細胞メディア再（〜1：10希釈）。通路iMOPsごとに5から7日間。
注：大otospheresを形成するか、または組織培養皿の底に付着した細胞は、分化します。培養がコンフルエントを超えている場合に細胞も死んでしまいます。
2.凍結融解IMOP細胞
- 解凍と凍結前の細胞に4℃の解決策を平衡化することにより合成凍結媒体を準備します。
- iMOP細胞のコンフルエントに6cm皿から細胞を収集します。 15ミリリットルコニカルに- （8×10 6個の細胞 〜6）10 mlピペットと転送細胞を使用してください。
- 室温で5分間、200×gで重力沈降または遠心分離によって細胞を回収。 otospheresが小さい場合、細胞は重力沈降により決済することはありません。オプション：総細胞数を決定するためにステップ1.9を用いて細胞を数えます。
- 背後に緩い細胞ペレットを残しながら吸引し、ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごしました。
- CEを再懸濁し、合成凍結メディアの0.25ミリリットルを追加約5×10 5〜6×10 3細胞/ mlの密度でLLS。ゆっくりP1000ピペットで細胞をピペット。先端を濾過した1 mlのP1000ピペットを用いて、低温バイアルに細胞懸濁液を転送します。
- アルコールフリーの冷凍コンテナにバイアルを置き、温度に到達するまで-80℃〜毎分温度1℃を減らすために-80℃で凍結コンテナを配置します。
- 細胞の長期保存のために、液体窒素貯蔵タンクの気相へのバイアルを移します。培養のための細胞を解凍するには、-80℃で凍結した細胞を含む低温バイアルを平衡化。
- 37℃の水槽で予備iMOP暖かい培養培地。
- 37℃の水浴中で、バイアルの底に旋回することによって、迅速凍結バイアルを解凍します。最後の氷の結晶が消えたら、解凍した細胞にiMOP予め温めておいた培地の1ミリリットルを追加します。転送15mLの円錐形への細胞とiMOP培養培地の追加の4ミリリットルを追加
- 15ミリリットルの共同スピン5分間nical。 200×gで使用済み培地を吸引し、。 6 10cmディッシュにiMOP培地プレート細胞の2ml中の細胞を再懸濁。拡張のため、5％CO 2で37℃で培養物をインキュベートします。
3.感覚上皮にIMOP細胞を分化
- DMEM / F12、1X B27サプリメント、25 / mlのカルベニシリン：iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを準備します。 iMOP感覚上皮の分化培地50mlのを行います。 37℃の水浴中で50ミリリットルコニカルにDMEM / F12の49ミリリットルをウォームアップ。解凍50XのB27サプリメントと5分間100 mg / mlのカルベニシリンアリコート。 37℃の水浴中で。 1ミリリットル50X B27およびDMEM / F12に100 mg / mlのカルベニシリンの12.5μLを追加します。
- 、収穫解離、再懸濁し、細胞をカウントする手順1.4から1.9を繰り返します
- 3日目の培地を使用してiMOPで6センチディッシュでプレート1×10 6個の細胞 。 0日目に、転送培養を15mlコニカルに10 mlのピペットを用いて。 OTOの収集ステップ1.6で述べたように、重力沈降による球。吸引除去が出ピペットを吸引2ミリリットルを使用してメディアを過ごし、円錐形の底にotospheresを残します。
- そっと感覚上皮の分化培地2mlに追加します。大口径10ミリリットルピペットを用いてを6cmディッシュに転送otospheres。
注：過酷なピペッティングから機械的せん断がotospheresから細胞を解離することができます。 - 一日おきに培養物に新鮮な感覚上皮分化培地2 mlを加え。必要に応じて、細胞は、重力沈降によって収集することができ、メディアを交換。
- 円錐15ミリリットルに転送しotospheresが述べたようにピペットを吸引2ミリリットルを使用して、ステップ1.6.Aspirateで使用済み培地を沈降し、邪魔されずotospheresを残すようにすることによって10日目でotospheresを収集します。
- 室温で15分間、1×PBS中の4％ホルムアルデヒド中でインキュベートすることによりotospheresを修正。 、ホルムアルデヒド溶液を除去し、洗浄緩衝液（1×PBS、0.1％トリトンX-10を含有するotospheres洗います0）をブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、10％正常ヤギ血清で1時間、0.1％トリトンX-100）を含みます。
- バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBSで洗浄サンプルは、27の免疫染色を、0.1％トリトンX-100の対象にotosphereを含みます。 P1000ピペットを用いてガラススライド上にメディアをマウントに1×PBSに転送otospheresと場所のotospheres。サンプルの上にカバースリップを置き、取り付けメディアは4℃で乾燥させます。
- 16ビットのCCDカメラを搭載した倒立顕微鏡のセットアップおよび20X 0.75空気または40X 1.3 NA油浸対物レンズのいずれかを使用して、エピ蛍光画像を取得します。ブルー（377±25 nmで/ 447±30 nm）で、グリーン（475±25 nmで/ 540±25 nm）の赤（562±20nmで/ 625：記載されている（励起および発光）の波長を使用して、異なるカラーチャネルからの蛍光を収集20nmの）及び赤外線（628±20nmの/および692±20±NM）。
4.アッセイするEDU設立
- 3日目に、プレート6 10cmディッシュ中、1×10 6 iMOP細胞。三日後0日、収穫、解離、再懸濁し、ステップ1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。
- プレートiMOP培養培地中2.5×10 5個の細胞と6ウェル皿の異なるウェルにおける感覚上皮の分化培地中の5×10 5細胞 。
- EDU取り込みアッセイを使用して、3日目にEDU取り込みによってS期の細胞の割合を決定します
- 培地に1μMのEDUの最終濃度を得るためにiMOP培養物に直接EDUの株式を追加します。
- 2時間iMOP培養でEDUをインキュベートし、5％CO 2で37℃でインキュベートします。収穫は、解離し、収集した細胞は、手順1.4から1.9を繰り返します。 15分間、1X PBS中4％ホルムアルデヒド中で加えます。室温で細胞を固定します。室温で5分間、200×gで遠心分離により細胞を回収。ホルムアルデヒド溶液とproperlを削除yは廃棄してください。
- ラベルヘキストでの細胞の核とは、製造業者のプロトコルに従って、緑色蛍光色素アジドとEDUを組み込みました。
注：すべての洗浄は1×PBS、二回1×PBSで3％BSAおよび0.1％のTween 20洗浄細胞を用いて行われます。 - 退色防止試薬を用いてスライド上のマウント細胞およびサンプルの上に1.5カバーガラスを配置します。落射蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞の蛍光画像を取得します。
5. IMOP由来ニューロンの区別
- 神経基本培地、1X B27サプリメント、2mMのL-グルタミン：神経分化培地50mlのを行います。 5分間37℃の水浴中で50X B27と200mMのL-グルタミンの解凍ボトル。神経基本培地48.5 mlに1ミリリットル50X B27 0.5mlの200mMのL-グルタミンを追加します。
- 滅菌10cmプレートでラウンド12ミリメートル1.5カバーガラスを配置し、滅菌し、カバーガラスをきれいにするためにプレートに70％エタノールを加えることにより、コートカバーガラス。
- 静かな入り江を攪拌彼らはエタノールでカバーされていることを確認するrslips。 RTで10分間プレートを残します。残りのエタノールを洗い流すために、滅菌1X PBSでカバーグラスを3回すすいでください。残りの1×PBSを洗い流すための滅菌H 2 Oで一回カバースリップをすすぎます。
- ピペットを吸引2ミリリットルを使用して、H 2 Oを吸引除去し、カバーガラスを乾燥させ。 15分間組織培養フード中でUV光にカバースリップを公開。すぐに使用しない場合、Storeは、無菌環境でカバースリップ。
- 24ウェルディッシュの各ウェルに1 12ミリメートルラウンドカバーガラスを配置します。カバーガラスは、ウェルの底に平らにすることを確実にするために静かにプレートを振ります。
- 2ミリグラム/ RTでmlのポリ-D-リシンストック溶液を解凍し、1×PBS中10μg/ mlのポリ-D-リジン濃度に希釈します。 10 UG / mlのポリ-D-リジン0.25mlのウェルに追加します。 1時間37℃のインキュベーター内でプレートを残します。
- 滅菌1×PBSでウェルを3回洗浄します。室温で10 mg / mlのラミニンストック溶液を、融解を10μg/ mの希釈1×PBSでリットル。 24マルチウェルディッシュの1ウェルに作業溶液を10μg/ mlのラミニンの0.25ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターでプレートをインキュベートします。 2ミリリットル吸引ピペットを用いてラミニン液を吸引します。
- P1000ピペットを用いて1×PBS 1 mlに添加して、ピペットを吸引2mlで吸引することにより、1×PBSを除去することにより、カバーガラスを1×PBSで3回洗浄します。細胞は、めっきされる準備が整うまで、ウェル中の最後の洗浄から1×PBSを残します。解離と3日目に6センチの皿に段階的に1.4-1.9.Plate 1×10 6個の細胞を、細胞をカウント、収穫により神経分化を開始します。
- 0日、収穫には、解離して1.4から1.9を繰り返して細胞をカウントします。 24マルチウェルディッシュで1.5×10 0.5ミリリットルに5 iMOP細胞ウェルあたり予め温め神経分化メディア-シード1×10 5。吸引し、一日おきに培養物に予熱した神経分化培地を追加します。
- 15分間4％ホルムアルデヒドでiMOP由来の神経細胞を固定してください。 AT RT 7日目削除ホルムアルデヒド溶液に、洗浄緩衝液でiMOP由来の神経細胞を洗浄し、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする前に、（1×PBS、0.1％トリトンX-100を含む）（1×PBS、10％正常ヤギ血清および0.1％トリトンX-100） 1時間。
- バッファーを交換し、希釈した抗体をブロッキング緩衝液でサンプルをインキュベートします。 4℃でインキュベートします。 1X PBS、0.1％トリトンX-100を被験者の細胞を含有する洗浄サンプル27を免疫染色します。マウントメディアに配置する前に、1×PBSでカバーガラスを洗ってください。マウントメディアはステップ3.8に記載されているエピ蛍光画像を取得する前に、4℃で乾燥することができます。
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Representative Results
IMOP細胞におけるbFGFの撤退下げます増殖
iMOP細胞の増殖能を減少させ、iMOP細胞の分化を開始するには、bFGFを培地から取り出しました。成長因子の離脱が増殖を減少させることを確認するために、EDUの取り込みを増殖アッセイとして使用しました。 （bFGFを含まない）iMOP培地（bFGFを含有）と感覚上皮培地で培養otospheresと共に培養otospheresからEDUを組み入れた細胞の割合を比較しました。 Otosphere培養物を回収し、固定し、ヌクレオチドアナログEDUでパルスしました。株式会社EDUヌクレオチドは、蛍光のAlexaFluor 488アジがクリック化学を用いて標識しました。 bFGFの不在下で増殖させたotospheresからの細胞は、bFGF（ 図1A-F）を用いて培養細胞にEDUの相対的な取り込みの減少を示しました。サイズOなどotosphereが増加fは、それは落射蛍光顕微鏡でotosphereからのすべての細胞を可視化することはますます困難でした。これに対処するために、細胞を解離し、それらが明確に質量アン可視化することができるように取り付けました。偶数解離および固定後、細胞を再集約します。解離した状態で細胞を維持するために、再凝集から細胞を防ぐ洗浄剤を試験しました。トゥイーン20は、細胞の再凝集を防止洗浄剤の一つでした。解離した細胞を、0.1％Tween 20で洗浄し、スライド上にマウントしました。 EDU標識された細胞は、次いで、落射蛍光顕微鏡（ 図1G、H）で可視化しました。個々の実験からの代表的な結果は、（n = 5）でエドゥの割合の有意な減少は、bFGFの撤退た（p <0.005）後の3日後に19％に48％から標識細胞を示しました。これらの結果は、後のiMOP細胞のS期の細胞の割合の劇的な低下や増殖能を確認bFGFの撤退。
IMOP由来の感覚上皮エクスプレスCDKN1Bと表示形態変化
iMOP感覚上皮の分化プロトコルのタイムラインは、（図2A）が示されています。増殖培養からOtospheresは、単一の細胞に解離しiMOP培養培地中で3日間回復させました。この方法は、これらの出発培養における有糸分裂後細胞に対して細胞と選択を増殖するために豊かにするのに役立ちます。 3日後、新たに形成されたotospheresは、感覚上皮の分化培地に播種し、10日間無誘導分化を受けることが許されました。 otospheresサイズ（ 図2B-E）で増加し始める前に、播種後の異なる時点でotospheresを含む代表的な培養物の明視野像のサイズは初期の減少を示しました。
27の形態学的および分子的特徴を強調するために使用された分子マーカーを用いた免疫染色iMOP細胞の分化中に起こる変化の多くを明らかにすることはできませんので。 CDKN1B（のp27 KIP）の発現は分化のマーカーとして使用することができるかどうかを確認するには、増殖性または感覚上皮に分化iMOP培養物からのotospheresを比較しました。蛍光マーカーは、落射蛍光顕微鏡で可視化し、捕捉しました。増殖培養物からotospheresの代表的な画像は、ほとんどないファロイジン染色（ 図3 AD）と核外CDKN1Bの低発現を示しました。 Otospheres培養における感覚上皮の分化培地は、細胞の周縁部にラベルをファロイジンの外観（ 図3 EH）と核CDKN1Bの付随の増加した発現を示しました。 otospheresをiMOP増殖するには、CDH1（E-cadherin）およびファロイジンが弱く（ 図3、IL）のラベルが付いています。差別iMOPのotospheresでは、顕著ファロイジンおよびCDH1標識が以前の結果27に似た細胞間接着のアクチンフィラメントと地域における形態学的変化（ 図3 MP）を 、強調表示します。感覚上皮分化の間に、アクチンフィラメントの形態変化は、細胞間の接着部位におけるCDH1式の外観を平行。このプロトコルでは、ファロイジンの変化やCDH1と共にCDKN1B発現の増加は、iMOP細胞における感覚上皮分化の早期指標として役立ちます。
IMOP由来のニューロンエクスプレスCDKN1BとTubb3
iMOPニューロン分化プロトコルの概略図（ 図4A）に示されています。前述のプロトコルと同様に、iMOP細胞が解離し、アルましたiMOP培養培地中で3日間の回復にlowed。 Otospheresを回収し、単一細胞に解離し、ポリ-D-リジンおよびラミニンでコートしたカバースリップ上に播種しました。細胞を7日間分化させました。彼らはiMOP由来の神経細胞（ 図4B-E）に分化としての時点で代表明視野画像は、プログレッシブ形態学的変化を示しました。 7日目までに、長い神経突起は、細胞体（ 図4Eの矢印）から延びる見ることができます。 iMOP細胞とiMOP由来の神経細胞を増殖し、神経細胞の分化の間CDKN1Bの発現レベルの変化を決定するために比較しました。 OtospheresはヘキストとCDKN1B抗体で標識しました。増殖しotospheresからiMOP細胞は、低核CDKN1B式（ 図4 FH）と少数の細胞を持っていました。また、iMOP由来のニューロンは、7日間の神経分化（ 図4の後核CDKN1B発現を有する細胞の数の増加を示しました。IK）。 CDKN1B細胞が神経系統を採用したかどうかを判断するには、ニューロンマーカーTubb3とiMOP由来神経細胞の標識が行われました。 iMOP由来神経細胞の代表的な画像をCDKN1BとTubb3（ 図5 AD）の同時標識を示しました。拡大し、これらの細胞からの神経突起の定量化は、（ 図5 EG）の各Tubb3に関連する平均1.5神経突起は、細胞を標識した（n = 60）を示しました。我々の神経分化のプロトコルでは、CDKN1BおよびTubb3による免疫染色は、バイポーラまたは擬似ユニポーラiMOP由来の神経細胞への分化の指標として用いることができます。
原子力CDKN1Bの発現レベルは、分化の開始後に増加
彼らは分化を受けるようotospheresの形態変化はiMOP細胞の質的変化を示します。 IMMUからの定量的な結果を達成するために、nofluorescence画像が早期分化事象、感覚上皮分化を受けている個々の増殖iMOPセル（N = 239）とiMOP細胞からCDKN1Bの核蛍光強度を示すために（N = 246）を測定しました。独立した実験からのCDKN1B蛍光シグナルを標準化するために、個々の細胞からヘキスト蛍光のCDKN1Bの比率を決定しました。 iMOP細胞（赤）を微分増殖しiMOP細胞（黒）と感覚上皮からCDKN1Bの正規化された蛍光強度のヒストグラム（ 図6A）をプロットしました。高CDKN1B発現する細胞の数の増加は、増殖iMOP細胞（黒）のヒストグラムに感覚上皮分化（赤）相対のヒストグラムの右方向へのシフトとして観察されました。 CDKN1Bを発現する細胞の割合の増加、正規化CDKN1B蛍光強度単位（0.65）のための閾値が設定された（矢印）および細胞の割合を決定するために、ABOしきい値を決定したVEの。感覚上皮の分化後、iMOP細胞はCDKN1B（ 図6B）を発現する細胞の67.1％が25.3％の増加を示しました。同一の定量分析はiMOP由来のニューロンに適用しました。増殖iMOP細胞（N = 525）と7日のiMOP由来のニューロン（N = 583）を比較するとiMOP由来の神経細胞に関連するヒストグラムの右シフトはiMOP細胞（ 図6C）を増殖するためのヒストグラムに対して観察されました。閾値以上の細胞の割合を決定することは、85.5％（ 図6D）の23.5％からCDKN1B発現細胞の増加が明らかになりました。記載されたプロトコルを使用して、CDKN1B発現の定量分析は、感覚上皮および神経分化中CDKN1Bをアップレギュレートする細胞の数の増加を確認しました。 CDKN1B発現する細胞の数の増加は、これらのプロトコルでiMOP細胞の分化を確認するために使用することができます。
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bFGFの存在下で培養IMOP培養の増殖状態を決定するためにEDU取り込みアッセイとして 図1。iMOP由来otospheres。細胞の核は、（A）およびヘキスト（B）EDUのAlexaFluor 488（C）とEDUヘキスト蛍光の合成画像で標識しました。 Otospheresは、bFGFを欠く培地で3日間培養しました。培養液からの細胞を、（D）ヘキストおよび （E）EDUのAlexaFluor 488（F）で標識し、ヘキストとEDUの標識の画像を合併。 1X PBS、0.1％のTweenを20細胞を含有するotospheres、洗浄を解離した後ヘキスト（マゼンタ）、EDU（緑色）標識細胞のマージされた蛍光画像は、bFGFの存在またはbFGFの（H）非存在下での（G）で 培養otospheresからでした。スケールの長さ指示がない限りバーは10μmである。EDUの（I）パーセントbFGFの存在下または非存在下で培養しiMOP細胞から細胞を標識しました。分析個々の細胞の数は、棒グラフの中に示され、エラーバーは平均の標準誤差（SEM）として示されました。細胞数は、n = 5の独立した実験からのものでした。スチューデントのt検定は、統計的有意性を決定するために行われました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
感覚上皮分化の 図2. 一般的な回路図。感覚上皮にiMOP細胞を区別するための（A）のタイムライン。折れ線グラフは、細胞解離および培地交換の時間を示します。 （B）代表的な位相差0日目のotospheresの画像、無誘導感覚上皮の分化中の（C）3、（D）7、（E）10。スケールバーの長さは100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
iMOP培養培地で培養しIMOP由来の感覚上皮における細胞周期の停止および分化を示すマーカーの図3.式 iMOP細胞の。Otosphere。細胞の核は、（A）およびヘキスト（B）CDKN1B抗体で標識しました。繊維状アクチンは、（C）ファロイジンで標識しました。 （D）、増殖iMOP細胞を含む典型的なotospheresの合成画像。 iMOP細胞からOtospheresは、感覚epithで培養しました10日間Eliaの培養培地。 otopsheresからの細胞は、（E）ヘキスト、（F）CDKN1B及び（G）ファロイジンでマークしました。 （H）が増加 CDKN1Bとファロイジン標識を示すotospheresのイメージを合併します。増殖otospheresは、（I）、ヘキスト（J）CDH1、（K）ファロイジンで標識しました。 （L）、マージされた画像は、これらのマーカーからの微弱な蛍光を示しています。感覚上皮に分化Otospheresも（M）、ヘキスト（N）CDH1（O）ファロイジンで標識しました。 （P）、マージされた画像は、典型的な強いCDH1とファロイジン標識を示します。示されない限り、スケールバーの長さは10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
神経分化の図4.一般的な回路図。ニューロンへiMOP細胞を区別するための（A）のタイムライン。 （B）1日目、（C）3で神経分化を受けiMOP細胞の位相差画像は、（D）5（E）7.矢印は神経突起を指します。 （F）およびヘキスト（G）CDKN1Bで標識iMOP培養培地中で培養されたようにotospheres iMOP細胞の蛍光画像。 （H）ヘキストとCDKN1Bで標識された細胞の合成画像。神経分化培地での培養の7日後iMOP細胞の蛍光画像。細胞の核は、（I）およびヘキスト（J）CDKN1Bで標識しました。 （K）はヘキストとCDKN1Bで標識された細胞の画像を合併します。注記がない限り、スケールバーの長さは10μmです。 OM /ファイル/ ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
7日神経分化後の細胞周期出口の分子マーカー指標的および神経分化。iMOP細胞の図5.発現。核は細胞の形態および（C）CDKN1B抗体を強調するために、（A）ヘキスト、（B）Tubb3（神経βチューブリン）抗体で標識しました。 （D）は、個々の細胞におけるCDKN1BとTubb3のラベル付けされた合成画像。スケールバーの長さは20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
CDKN1B式の図6 CDKN1Bの単一細胞の定量的蛍光強度分析。（A）正規化された蛍光強度は、個々の細胞からのCDKN1Bおよびヘキスト蛍光強度の比を計算することによって決定しました。正規化された蛍光強度は、ヒストグラムとして細胞数に対してプロットしました。感覚上皮（SE）（赤）に分化したbFGF（黒）とiMOPのotospheresの存在下で培養iMOP細胞増殖からCDKN1Bの正規化蛍光強度が示されています。閾値は、増殖（黒色）と感覚上皮分化した培養物（赤）から、0.65の正規化蛍光強度単位（矢印）、（B）閾値を上回るCDKN1Bを発現iMOP細胞の割合としました。 （C）はヘキストとMyo6抗体で標識した感覚上皮に分化iMOP細胞の蛍光画像を吸収合併します。 （D （E）（黒）を、増殖し、神経細胞の分化培養（赤）からCDKN1Bを表現iMOP細胞の割合。分析のために使用される個々の細胞は、それぞれの棒グラフに示されました。結果は、異なる実験からコンパイルされた（n = 3）を、エラーバーSEMとして示さ。スチューデントt検定は、統計的有意性を決定するために使用しました。 （F）はヘキストとTubb3で標識されたバイポーラまたは擬似ユニポーラiMOP由来神経細胞の蛍光画像を吸収合併しました。スケールバーの長さは20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 細胞培養容器 | 蘇rfaceエリア（cm 2）と | 定期メンテナンスのために播種された細胞の数 | 感覚上皮分化のために播種された細胞の数 | 神経分化のために播種された細胞の数 | 60ミリメートル皿にスケーリングファクタの相対 | 使用されるメディアの容量（ml） | |
| Multwellプレート | |||||||
| 96 | 0.3 | 10000 | 2万 | 10,000〜50,000 | 0.015 | 0.1 | |
| 24 | 2 | 9万 | 18万 | 100,000-150,000 | 0.100 | 0.5 | |
| 12 | 4 | 18万 | 36万 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| 6 | 10 | 50万 | 1,000,000 | 500,000-750,000 | 0.500 | 2 | |
| 料理 | |||||||
| 35ミリメートル | 10 | 50万 | 1,000,000 | 50万 | 0.500 | 2 | |
| 60ミリメートル | 20 | 1,000,000 | 2,000,000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100ミリメートル | 60 | 250万 | 5,000,000 | 2,500,000-300万 | 3.000 | 8 | |
VarのIMOP細胞の分化を維持するための表1のセル番号IOUの組織培養プレートフォーマット。
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Discussion
IMOP培養のモニタリング
自己再生を維持し、新規iMOP細胞株の分化を促進するためのプロトコルが記載されており、付加的なめっきフォーマット（表1）に含まれています。日常的拡大とiMOP細胞の分化に役立ついくつかの重要なステップが記載されています。多能性幹細胞培養と同様に、iMOP細胞は、理論的に無限の寿命を有します。細胞株が適切に維持されることを保証するために、iMOP培養物を定期的に細胞の生存、自己複製と分化能のために監視されます。解離後の細胞の生存率を決定するために、我々は、トリパンブルー染色を使用しています。一般的には、細胞の70％以上が解離した後に生存しています。 iMOP細胞内で自己複製を監視するには、C-MycおよびSox2の抗体を用いて免疫染色することは行われています。増殖培養条件の下では、iMOP細胞は〜18時間の倍加時間を持っています。行うか、自己再生マーカーの発現の変化時間をubling変更された自己複製の可能性の指標です。 iMOP細胞、感覚上皮細胞またはニューロンのための早期マーカーの細胞周期の出口及び発現の分化能を監視するための細胞の分化能を評価するために使用されます。 iMOP細胞は、上記の規準のいずれかに合格しない場合は、培養を終了することが賢明であろう。
IMOPの文化に影響を与える変数
iMOP細胞を培養中で1つの重要なステップは、自己再生を促進するために、培養物中のbFGFの活性濃度を維持することです。セル29,30を培養する際のbFGFは伝え37℃で非常に不安定です。培養物の増殖を有意に起因したbFGFの不安定性に自発的分化によって影響を受けることができます。現在のプロトコルでは、新鮮な培地は、常には5ng / mlの上記のbFGFレベルを維持するために、培養物に供給されます。からの放出制御を使用したbFGFレベルの安定化グリコール酸および乳酸のポリエステルマイクロスフェアは、媒体31におけるbFGFの安定したレベルを維持するために必要なメディアの変更の頻度を減らすことができます。着実に解放可能bFGFの添加は、しばしばiMOP培養中のbFGFのレベルを維持するためにメディアを追加する必要性を減少させます。
iMOP細胞の生存率を維持するために別の重要なステップは、解離試薬および機械的せん断への暴露を制限することです。現在のプロトコルでは、解離は、1mMのEDTAとのインキュベーションによって達成されます。活発なピペット操作によって引き起こされる過度の機械的せん断を低減し、細胞の生存率を向上させるのに役立ちますiMOP細胞を継代する際、複数の遠心分離工程を制限し、EDTAで過剰なインキュベーション時間の抑制。これらのステップに与えられた注意が効果的に文化の拡張中に多数の細胞の生存率を維持することができます。
iMOP細胞のルーチン培養の間、細胞を解離させるためのいくつかの方法を試験しました。 MechanピペッティングからiCalのせん断はotospheresを解離するために使用することができるが、均一にまたは一貫して単一細胞を生成しません。 iMOP細胞の細胞解離のための市販の試薬を使用すると、効果的にotospheresから単一細胞を生成することができますが、これらの試薬はotospheresを改革し、処理表面に付着した細胞の接着性に影響を与えます。市販の試薬を使用するために、複数回の洗浄は、分化プロトコールを用いる前に、解離試薬を除去するために必要でした。
現在の分化プロトコルにおいて、両方の感覚上皮及び神経分化条件は、単一細胞または死細胞の塊の形で観察された細胞死をもたらしました。アポトーシス細胞死は 、インビトロで長期培養中に適切な分化または生存の手がかりが不足しているためである可能性があります。 B27サプリメントに含まれる両方の分化条件は、細胞の生存を促進します。 B27 supplemが、ENTは、初代海馬ニューロン32の生存を促進することが示されている、それはiMOP細胞の生存を促進するのに十分ではないかもしれません。このようなROCK阻害剤としての化合物の添加は、維持し、日常的培養中および in vitro 分化におけるiMOP細胞の生存率を高めることがあります。 ROCK阻害剤は、広範囲の分化33に影響を与えることなく、無血清培養物中の細胞の生存を促進するために多能性幹細胞の培養に使用されています。培地にROCK阻害剤の添加はiMOP細胞の分化能に影響を与えることなく、長い分化プロトコル中の細胞の生存率を高めることができます。増加した細胞生存率を効率的に成熟有毛細胞またはSGNSを多数生成するためのプロトコルの開発を可能にします。
IMOP分化の初期マーカーとして増加CDKN1B式
初期の蝸牛開発中に、セルの初期イベントサイクル出口が有毛細胞、支持細胞とSGNS 34分化に先行します。神経前駆細胞の有糸分裂ターミナルは波ベースから始まり、蝸牛35の頂部に向かって進んで広がります。反対の勾配では、有毛細胞および支持細胞を生じさせるprosensory前駆細胞の有糸分裂の端末は、蝸牛34,36のベースに頂点から進行します。 CDKN1Bの時間的発現が有糸分裂後の状態によく相関するが、それは最も可能性の高い開発蝸牛における細胞周期の出口を促進する唯一の要因ではありません。これを支持する、CDKN1B変異動物は、まだ分裂後毛細胞37を開発することができます。その代わりに、CDKN1Bは、分化の開始をマークするために早期の指標として用いることができます。無誘導iMOP分化培養において、分化の早期マーカーは明らかな形態学的特徴が観察される前に、分化の初期段階を促進するためのプロトコルの開発を支援します。</ P>
耳の開発と同様に、サイクル出口はiMOP細胞における増加CDKN1Bレベルで差別化し、結果を開始します。 iMOP細胞増殖において、CDKN1Bだけ低いレベルの発現を観察することができます。かかるCDKN1A（のp21 CIP）のような他のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤はiMOP細胞において正常な細胞周期進行に関与し得ます。感覚上皮およびiMOP細胞の神経分化の間に、単一の細胞の定量的分析はiMOP培養（ 図6A、C）を微分でCDKN1Bの増加発現と細胞のサブセットを明らかにしました。これらの細胞におけるCDKN1Bの発現は、分化を受けiMOP細胞の指標です。
細胞運命の決意を研究するための携帯電話のプラットフォームとしてIMOP細胞
iMOP細胞は、インビトロで異なる耳の系統への前駆状態から遷移することができるので、耳の細胞の運命を調べるために利用することができます決定。現在、説明されたプロトコルは、様々な耳の細胞型を生成するために、無誘導分化手順を使用します。 iMOPシステムは、セルとSGN系統をサポートする、成熟した有毛細胞に向けてiMOP細胞を導く、生物活性分子、化合物と定義された遺伝子の追加が可能になります。 iMOP携帯プラットフォームの1つの用途は、分化を促進する候補トランスクリプション要因（TF）をテストすることです。キーTFの発現は、有毛細胞または神経細胞の分化を駆動するために使用することができます。確立されたマーカーまたは有毛細胞とSGNSの形態学的特徴とともにCDKN1Bの発現が異なる耳の系統38,39への候補TFの寄与を決定するために用いることができます。
などのAtoh1のような候補のTFは、有毛細胞の開発のために不可欠であり、損傷を受けた蝸牛40,41内有毛細胞の分化を促進するために再利用されています。 iMOP細胞へのAtoh1の導入は、有毛細胞の分化を促進することができます。 developiで蝸牛ngの、Ngn1とNeuroD1の両方は 、インビボ42-44 で適切SGN分化に必要とされます。 iMOP細胞内Ngn1またはNeuroD1の発現は、SGNの分化を促進することができます。これらの実験は、TFを個別にまたは組み合わせでの発現は、ニューロン45〜48に、線維芽細胞または多能性幹細胞に変換することができます生成する誘導された神経細胞（IN）に似ています。通常、有毛細胞またはSGNSの開発中に発現されているTFの導入は、有毛細胞またはSGN系譜に向けてiMOP細胞を誘導するための良い戦略です。
iMOP由来の有毛細胞とSGNS多数の分化を促進する条件は、疾患モデル、げっ歯類における労働集約型のテストが開始される前に、迅速かつコスト効率良く行うことができる小分子のスクリーニングおよび毒性試験のための堅牢な携帯プラットフォームを提供します。記載されたプロトコルは、複数のに利用することができる単純で汎用性の高いシステムを提供します耳の前駆細胞の分化をtudyingおよび大規模の実験に適しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
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