Protocol
1. IMOP 세포의 자기 갱신을 유지
- 문화 매체를 iMOP 준비 : DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin 20 NG / ㎖의 bFGF를. 멸균 시약을 사용하여 iMOP 문화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업.
- 해동 50X B27 보충제와 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 동안 필터 멸균 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin 분취. 실온에서 100 μg의 / ㎖의 bFGF 나누어지는을 녹여. 추가 1 ml의 50 배 B27, 100 μg의 / ㎖의 bFGF를 10 μL와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μL.
- 배양 iMOP 세포 60mm 조직 배양 접시에 미디어의 3 ㎖를 사용합니다. 미디어의 볼륨을 두 배로 매일 문화에 신선한 매체를 추가합니다. 의 bFGF의 농도가 5 ng를 / ㎖ 이하로 떨어지지 않도록해야합니다.
- 아래 단계에 나열된 문화 5~7일 후 5 % CO 2 항로 세포와 37 ° C에서 문화 iMOP 세포. (15)로 전송 문화10 ML의 피펫 팁을 사용하여 ML 원뿔.
- HBSS의 50 ㎖에 0.5 M EDTA의 pH 8.0의 0.1 ml에 희석하여 HBSS에 1 mM의 EDTA를 확인합니다. 사전 따뜻한 1 mM의 EDTA는 37 ° C의 물을 욕조에 HBSS로했다.
- 중력 침강 또는 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 실온에서. 10 분 - 중력 침강를 들어, 5 37 ° C 배양기에서 문화를 포함하는 15 ML 원뿔을 배치합니다. 그 시간 후, otospheres이 15 ml의 원추형의 바닥에 수집 관찰.
참고 : 과도한 원심력 세포 손상의 원인이 될 수 있습니다. - 조심스럽게 흡인 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 보냈다. 펠렛을 셀에 미리 예열 1 mM의 EDTA HBSS 용액 0.5ml를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 부드럽게 피펫 아래로 2-3 회. 37 ° C에서 원추형 배치 및 단일 세포로 분리를 용이하게하기 <5 분 동안 배양한다.
- 부드럽게 otospheres가 해리되어 있는지 확인 셀 솔루션을 소용돌이 친다. 더 OTO 경우구가 원뿔의 바닥에 침전, 세포를 분해한다. 배양 시간은 다를 수 있습니다.
참고 : EDTA와 장기간 배양 과도한 세포 사망을 초래할 것입니다. - 37 ° C에서 세포를 제거 EDTA를 중화하고 희석 미디어 2 ㎖를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다. 대기음 아웃 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 세포를 씻어 1X PBS 5 mL를 추가 EDTA를 희석.
- 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운 및 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 1X PBS를 대기음. 3 번 - 부드럽게 내려 2를 피펫 팅에 의해 iMOP 배양액 0.5 ㎖에 P1000 피펫을 사용하여 세포를 재현 탁.
- 해당 카세트 (28)와 미세 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트. iMOP 세포의 합류 판 ~ 6 X10 6 셀이 포함됩니다. 미디어 (100) 및 계산을위한 카세트에 셀 솔루션의 75 UL을 추가 세포 1을 희석. iMOP의 cultu에서 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포미디어 재 (~ 1 : 10 희석). 통로 iMOPs 모든 5-7일.
참고 : 큰 otospheres을 형성하거나 차별화 조직 배양 접시의 바닥에 부착 세포. 문화가 융합을 통해 경우 세포는 죽을 것이다.
2. 동결 융해 IMOP 세포
- 해동 전에 동결 세포에 4 ° C에 대한 해결책을 평형화에 의해 합성 동결 매체를 준비합니다.
- iMOP 세포의 합류 6cm 접시에서 세포를 수집합니다. 15 ML 원뿔로 - (8 × 10 6 세포 ~ 6) 10ml를 피펫 및 전송 세포를 사용합니다.
- 중력 침강 또는 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. otospheres가 작은 경우, 세포가 중력 침강에 의해 해결되지 않습니다. 옵션 : 총 세포 수를 결정하는 단계 1.9을 사용하여 세포를 계산합니다.
- 대기음 뒤에 느슨한 세포 펠렛을 유지하면서 피펫을 흡입 2 ㎖를 사용하여 미디어를 보냈다.
- CE를 재현 탁하는 합성 동결 미디어의 0.25 ML을 추가~ 5 × 5 × 106 3 세포 / ml의 밀도로 LLS. 부드럽게 P1000 피펫으로 세포를 피펫. 팁을 여과 1 mL를 P1000 피펫을 사용하여 극저온 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 알코올 무료 냉동 컨테이너에 튜브를 놓고 온도에 도달 할 때까지 -80 ° C ~ 분당 온도 1 ° C를 감소 -80 ℃에서 냉동 컨테이너를 배치합니다.
- 세포를 장기간 저장을 위해, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 튜브를 전송. 문화에 대한 세포를 해동, -80 ℃에서 냉동 세포를 포함하는 극저온 유리 병을 평형.
- 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 iMOP 문화 미디어.
- 37 ℃의 수욕 바이알의 저부 소용돌이에 의해 신속하게 냉동 바이알을 해동. 마지막 얼음 결정이 사라지면 해동 세포에 미리 예열 iMOP 문화 미디어의 1 ML을 추가합니다. 전사 15ml의 원뿔형으로 iMOP 세포 배양 배지의 추가적인 4를 가하여
- 15 ml의 공동 스핀5 분 nical. 200 XG에서 보낸 매체를 대기음. 6cm iMOP 접시에 배양 배지 및 세포 플레이트 2 ㎖의 세포를 재현 탁. 확장을 위해 5 %, 37 ℃에서 이산화탄소를 문화를 품어.
3. 감각 상피에 IMOP 세포를 차별화
- DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin : iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 ㎖를 준비합니다. iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업. 해동 50X의 B27 보충제, 5 분 동안 100 mg을 / ㎖ carbenecillin 분취. 37 ° C의 물을 욕조에. 1 ml의 50X B27와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μl를 추가합니다.
- , 수확, 재현 탁을 해리와 카운트 세포는 1.4-1.9 단계를 반복
- 일 -3 문화 매체를 iMOP 사용에 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포. 일 0에서 전송 문화는 15 ML 원뿔에 10 ml의 피펫을 사용하여. OTO를 수집중력 침강에 의해 구체로 단계 1.6에서 말했다. 대기음 밖으로 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 소비하고, 원뿔 밑면의 otospheres 둡니다.
- 부드럽게 감각 상피 분화 미디어 2 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 전송은 큰 구멍 10ml를 피펫을 사용하여 6cm 접시에 otospheres.
참고 : 거친 피펫 팅에서 기계 전단은 otospheres에서 세포를 떼어 놓다 수 있습니다. - 매일 문화에 신선한 감각 상피 분화 매체의 2 ML을 추가합니다. 필요한 경우, 세포 대체 중력 침강 및 매체에 의해 회수 할 수있다.
- 15 ML 원뿔로 전송하고 otospheres 단계에서 언급 한 바와 같이 보냈다 미디어 피펫을 흡입 2 ml에 사용 1.6.Aspirate 침전물과 방해받지 otospheres을 떠날 수 있도록하여 10 일에 otospheres를 수집합니다.
- 실온에서 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에서 배양하여 otospheres을 수정합니다. 포름 알데히드 용액을 제거 세척 완충액 (PBS 1X, 0.1 % 트리톤-10을 함유하는 세척 otospheres0)를 차단 완충액에서 배양 하였다 (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청에서 1 시간 동안 0.1 % 트리톤 X-100)을 함유.
- 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 27 면역 염색에 0.1 % 트리톤 X-100 대상에게 otosphere를 포함 씻을 샘플. P1000 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 미디어를 장착에 1X PBS로 전송 otospheres 및 장소 otospheres. 샘플을 통해 coverslip에 넣고 설치 미디어가 4 ℃에서 건조 할 수 있습니다.
- 16 비트 CCD 카메라와 20 배 0.75 공기 중 또는 40X 1.3 NA 오일 침지 목적이 장착 거꾸로 현미경 설정을 사용하여 표면 형광 이미지를 획득. 블루 (377 ± 25 나노 / 447 ± 30 ㎚), 녹색 (475 ± 25 나노 / 540 ± 25 ㎚), 빨간색 (562 ± 20 나노 / 625 : 상기 (여기 및 방출) 파장을 사용하여 다른 색상 채널에서 형광을 수집 ± 20 나노) 및 적외선 (628 ± 20 나노 / 및 692 ± 20㎚).
4. 시금 에듀 설립
- 일 -3에서 6cm 접시에 1 × 10 6 iMOP 세포를 접시. 삼일 후에 일 0에, 수확, 해리, 재현 탁하고 단계 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다.
- 플레이트 iMOP 배양 배지에 2.5 × 10 5 세포와 6 잘 접시의 다른 우물의 감각 상피 분화 미디어 5 X10 5 세포.
- 에듀 통합 분석을 사용하여 3 일에 듀 설립하여 S 단계에서 세포의 비율을 결정
- 배양 배지에서 1 μM 듀의 최종 농도를 얻기 위해 iMOP 배양 직접 듀 콘텐츠를 추가한다.
- 2 시간 동안 iMOP 문화에 EDU을 품어 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 수확, 해리와 수집 세포 단계 1.4-1.9를 반복합니다. 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에 추가합니다. 실온에서 세포를 해결하려면. 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 포름 알데히드 용액과 properl 제거Y는 폐기하십시오.
- 라벨 훽스트 (Hoechst)와 세포의 핵 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 염료 아 지드와 에듀를 통합.
참고 : 모든 세척이 1X PBS, 두 번 1X PBS로 3 % BSA, 0.1 % 트윈 20 세척 세포로 이루어집니다. - 및 antifade 시약을 사용하여 슬라이드에 마운트 세포 샘플을 통해 1.5 커버 유리를 놓습니다. 표면 형광 현미경을 사용하여 표지 된 세포의 형광 이미지를 획득.
5. IMOP 유래 신경 세포를 차별화
- 로 Neurobasal 미디어, 1X B27 보충제, 2 mM의 L 글루타민 : 신경 세포 분화 매체의 50 mL로한다. 5 분 37 ° C의 물을 욕조에 50 배 B27 200 mM의 L 글루타민의 해동 병. 로 Neurobasal 미디어의 48.5 ml의 1ml를 50X B27 0.5 ml의 200 mM의 L 글루타민을 추가합니다.
- 멸균 10cm 플레이트 라운드 12mm 1.5 커버 글라스를 배치하고 멸균 된 커버를 청소 판에 70 %의 EtOH를 추가로 코트 커브 글라스.
- 부드럽게 코브를 교반rslips은 에탄올에 포함되어 있는지 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 접시를 남겨주세요. 나머지 에탄올을 씻어 살균 1X PBS로 된 커버 3 회 씻어. 1X PBS 나머지 씻어 살균 H 2 0 번 커버 슬립을 씻어.
- 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 H 2 0 대기음 된 커버가 건조 할 수 있습니다. 15 분 동안 조직 배양 후드에서 UV 광에 노출 된 커버. 즉시 사용하지 않을 경우 저장소는 무균 환경에서 커버 슬립.
- 24 잘 접시의 각 웰에 한 12mm 라운드 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립이 잘 바닥에 평평하게 놓여 있는지 확인 부드럽게 판을 흔들어.
- 해동 2 밀리그램 / 1X PBS에서 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 농도 실온에서 폴리 -D- 라이신 원액 mL 및 희석. 10 UG / ㎖ 폴리 D 라이신 0.25 ml의 우물에 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 남겨주세요.
- 멸균 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. 실온에서 10 ㎎ / ㎖ 라미닌 원액 및 해동 10 μg의 / M로 희석1X PBS에서 L. 추가 10 μg의 24 멀티 잘 접시의 단일 잘으로 솔루션을 작동 / ㎖ 라미닌 0.25 ml의. 37 ° C 배양기에서 접시를 품어. 2ml의 흡인 피펫을 사용하여 용액을 라미닌 대기음.
- P1000 피펫 1X PBS 1 ml의 추가 및 피펫을 흡입 2 ㎖로 흡입하여 1X PBS를 제거하여 커버 슬립을 1X PBS로 3 회 반복한다. 세포가 도금 될 준비가 될 때까지 잘 마지막 세척에서 1X PBS를 남겨주세요. 해리와 일 -3에서 6cm 접시에 단계 1.4-1.9.Plate 1 × 10 6 세포를 세포를 계산, 수확에 의해 신경 세포의 분화를 시작합니다.
- 일 0, 수확, 해리와 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다. 씨 1 × 10 5 - 잘 24 멀티 잘 접시 당 예열 신경 세포 분화 미디어 0.5 ml의에 × 10 5 iMOP 세포 1.5. 기음과 매일 문화에 미리 예열 신경 세포의 분화 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 15 분 동안 4 % 포름 알데히드에 iMOP 유래 신경 세포를 고정합니다. 에이t RT 7 일째 제거 포름 알데히드 용액에 세척 완충액으로 iMOP 유래의 신경 세포를 세척 버퍼를 차단에 배양 하였다 (1X PBS 0.1 % 트리톤-100을 포함하는) (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청과 0.1 %를 함유 트리톤 X-100) 1 시간 동안.
- 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 0.1 % 트리톤 X-100 주제 세포를 포함 씻을 샘플은 27 면역 염색합니다. 설치 미디어에 배치하기 전에 1X PBS로 커브 글라스를 씻으십시오. 설치 미디어가 단계 3.8에 나와있는 표면 형광 이미지를 획득하기 전에 4 ℃에서 건조하도록 허용합니다.
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Representative Results
IMOP 세포에서 bFGF의 탈퇴 감소 확산
iMOP 세포의 증식능을 감소시키고 iMOP 세포의 분화를 개시하기 위해,는 bFGF를 배양으로부터 회수 하였다. 성장 인자 철수 증식을 감소 함을 확인하려면, 에듀 통합은 증식 분석으로 사용 하였다. (bFGF를하지 않고) iMOP 문화 미디어 (bFGF를 함유) 및 감각 상피 미디어에서 배양 otospheres 배양 otospheres에서 에듀를 통합 세포의 비율을 비교 하였다. Otosphere 문화 수확 및 고정 염기 아날로그 에듀와 펄스했다. 통합 에듀 뉴클레오티드는 형광 Alexafluor 488 지드는 클릭 - 화학을 이용하여 표시 하였다. 의 bFGF의 부재 하에서 성장 otospheres에서 세포의 bFGF (도 1A-F)와 함께 배양 된 세포에 대하여 듀의 혼입을 감소 하였다. 사이즈 O로서F otosphere 그것은 epifluorescent 현미경 otosphere의 모든 세포를 시각화하는 것이 점점 더 어려워했다 증가했다. 이 문제를 해결하기 위해, 세포를 분해하고 모호하지 않게 질량 도중에 가시화 될 수 있도록 장착 하였다. 심지어 분리 및 고정 후, 세포 응집 재. 해리 된 상태로 세포를 유지하기 위해, 재 응집을 방지 셀 세제 시험 하였다. 트윈 20은 세포의 재 응집을 방지 세제 중 하나였다. 해리 된 세포를 0.1 % 트윈 20으로 세척 한 슬라이드 상에 장착 하였다. EDU 표지 세포를 표면 형광 현미경 (도 1G, H)에 의해 가시화 하였다. 개개의 실험에서 대표 결과 (N = 5) 듀의 비율을 크게 감소 bFGF를 인출 (p <0.005) 후 3 일 후 19 %로 48 %의 세포를 표지 하였다. 이러한 결과는 S 단계 세포의 백분율 및 iMOP 세포의 증식 후 전위의 급격한 저하를 확인할bFGF를 철수.
IMOP 유래 감각 상피 익스프레스 Cdkn1b 및 표시 형태 학적 변화
iMOP 감각 상피 분화 프로토콜의 타임 라인 (그림 2A)에 표시됩니다. 증식 문화 Otospheres 단일 세포로 해리와 iMOP 문화 미디어 3 일 동안 복구 할 수 있었다. 이 방법은이 시작 문화 후 유사 분열 세포에 대한 세포 및 선택 증식을 위해 풍부하게하는 데 도움이됩니다. 삼일 후, 새로 형성된 otospheres은 감각 상피 분화 매체에 접종 10 일 동안 나누어 져 분화를 받아야하는 것이 허용되었다. otospheres 크기 (도 2b-E)이 증가하기 전에 시딩 후 상이한 시점에서 otospheres 함유 전형적인 배양 명 시야 이미지의 크기는 초기 감소 하였다.
(27)의 형태 적 및 분자 적 특징을 강조하기 위해 사용 된 분자 표지로 면역 염색 iMOP 세포의 분화 과정에서 발생하는 변화의 대부분을 표시 할 수 있기 때문이다. Cdkn1b (P27의 측정 도구)의 발현이 분화 마커로 사용할 수 있는지 확인하려면, 증식 또는 감각 상피 분화 iMOP의 문화 otospheres 비교 하였다. 형광 표식은 시각 및 표면 형광 현미경에 의하여 촬영되었다. 증식 문화 otospheres의 대표 이미지는 거의 팔로이 딘 염색 (그림 3 AD)와 핵 외부 Cdkn1b의 낮은 발현을 보였다. 감각 상피 분화 배지에서 배양 Otospheres 세포 (그림 3 EH)의 주변 가장자리에 팔로이 딘 라벨의 모양과 핵 Cdkn1b의 수반의 발현을 증가 표시됩니다. 증식 iMOP의 otospheres에서, Cdh1 (E-cadheriN)와 팔로이 딘은 약하게 (그림 3 IL) 표시되어 있습니다. 차별화 된 iMOP의 otospheres에서 두드러 팔로이 딘과 Cdh1 라벨은 액틴 필라멘트 및 이전 결과 (27)와 유사한 세포 - 세포 부착 (그림 3 MP), 지역의 형태 학적 변화를 강조 표시합니다. 감각 상피 분화하는 동안, 액틴 필라멘트의 형태 학적 변화는 세포 사이의 접착 사이트에서 Cdh1 식의 모양을 평행. 이 프로토콜에서 팔로이 딘과 Cdh1의 변화와 함께 Cdkn1b 발현의 증가는 iMOP 세포에서 감각 상피 분화의 조기 지표를 제공합니다.
IMOP 유래 신경 세포 익스프레스 Cdkn1b 및 Tubb3을
iMOP 신경 분화 프로토콜의 개략도 (도 4a)에 도시된다. 상기 프로토콜과 마찬가지로, iMOP 세포 해리 된 알iMOP 배양 배지에서 3 일간 회복 lowed. Otospheres 수확하고, 단일 세포로 해리 폴리 -D- 리신 및 라미닌 코팅 된 커버 슬립 위에 접종. 셀 7 일 동안 분화시켰다. 그들은 iMOP 유래 신경 세포 (그림 4B-E)로 분화로 시점에서 대표 시야 이미지는 진보적 인 형태 학적 변화를 표시. 7 일까지, 긴 신경 돌기는 세포체 (그림 4E 화살촉)에서 연장 볼 수 있습니다. iMOP iMOP 세포 유래 신경 세포를 증식, 신경 분화 동안 Cdkn1b의 발현 수준의 변화를 결정하기 위해 비교 하였다. Otospheres은 훽스트와 Cdkn1b 항체로 표지 하였다. 확산 otospheres에서 iMOP 세포는 낮은 핵 Cdkn1b 식 (그림 4 FH)와 약간의 세포를했다. 또한, iMOP 유래 신경 7 일 신경 분화 (도 4 이후 핵 Cdkn1b 식 세포 수의 증가를 보였다IK). Cdkn1b 세포가 신경 세포의 혈통을 채택되었는지 확인하려면 신경 세포 마커 Tubb3와 iMOP 유래 신경 세포의 표지가 이루어졌다. iMOP 유래 신경 세포의 대표 이미지는 Cdkn1b 및 Tubb3 (그림 5 AD)의 공동 라벨을 보였다. 확대 및 이들 세포에서 신경 돌기의 정량화 각 Tubb3과 관련된 평균 1.5 신경 돌기가 셀을 표시했다 (N = 60) (그림 5 EG). Cdkn1b Tubb3과 함께 면역 염색 우리의 신경 분화 프로토콜에서, 바이폴라 또는 의사 - 단극 iMOP 유래 신경 세포로의 분화의 지표로 사용될 수있다.
핵 Cdkn1b 발현 수준은 차별화를 초기화 한 후 증가
그들은 차별화를 받아야으로 otospheres의 형태 학적 변화는 iMOP 세포에서 질적 변화를 보여줍니다. 면역 글로불린에서 정량적 인 결과를 달성하기nofluorescence 이미지 초기 분화 이벤트 감각 상피 분화를 겪고 개별 증식 iMOP 셀들 (N = 239)와 iMOP Cdkn1b 세포에서 핵의 형광 강도를 나타 내기 위해 (N = 246)을 측정 하였다. 독립적 인 실험에서 Cdkn1b 형광 신호를 정규화하기 위해, 각 셀에서의 Hoechst 형광에 Cdkn1b의 비율을 구 하였다. iMOP 세포 (적색) 분화 증식 iMOP 세포 (검은 색)과 감각 상피에서 Cdkn1b의 정규화 된 형광 강도의 히스토그램 (그림 6A)를 꾸몄다했다. 높은 Cdkn1b 발현 세포 수의 증가는 세포 증식 iMOP (블랙)에 대한 히스토그램 감각 상피 분화 (레드)에 대한 상대적인 히스토그램의 우측 시프트로서 관찰되었다. Cdkn1b, 표준화 된 형광 강도 Cdkn1b 단위 임계치 (0.65)를 발현하는 세포의 비율의 증가를 결정하는 세트 (화살촉)과 세포의 비율은 ABO시켰다 임계 값이 결정되었다했습니다. 감각 상피 분화 후, 세포는 iMOP Cdkn1b (도 6b)을 발현하는 세포의 67.1 %에서 25.3 % 증가를 표시. 동일한 정량 분석 iMOP 유래 신경 세포에 적용 하였다. (N = 583)을 증식 iMOP 세포를 비교 (N = 525)과 7 일간 iMOP 유래 신경 때 iMOP 유래 신경과 연관된 히스토그램의 우측 시프트 iMOP 세포 (도 6c)를 증식에 대한 히스토그램에 대하여 관찰 하였다. 임계 값 이상의 세포의 비율을 결정하는 것은 85.5 % (그림 6D)에 23.5 %에서 Cdkn1b 발현하는 세포의 증가를 한 것으로 밝혀졌습니다. 설명 된 프로토콜을 사용하여, Cdkn1b 발현의 정량 분석은 감각 신경 세포 및 상피 분화 동안 Cdkn1b을 상향 조절 세포 수의 증가를 확인했다. Cdkn1b 발현 세포의 증가 된 수치는 이러한 프로토콜에 iMOP 세포의 분화를 확인하기 위해 사용될 수있다.
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의 bFGF의 존재 배양 IMOP 문화의 증식 상태를 파악하기 위해 에듀 설립 분석으로 그림 1. iMOP 파생 otospheres. 세포의 핵은 (A) 및 훽스트 (B) EDU Alexafluor 488 (C) 및 훽스트 EDU 형광의 합성 화상으로 표시 하였다. Otospheres는 bFGF를 부족한 미디어에서 삼일 배양. 문화의 세포 훽스트 (Hoechst)와 에듀 라벨의 (D) 훽스트 (Hoechst) 및 (E) EDU Alexafluor 488 (F) 병합 된 이미지를 표시했다. 1X PBS 0.1 % 트윈를 20 세포를 포함하여 otospheres 세척을 해리 후 훽스트 (마젠타)와 EDU (녹색) 표지 세포의 합병 형광 이미지의 bFGF의 존재의 bFGF의 (H) 부재 (G) 배양 otospheres에서 있었다. 규모의 길이듀의 표시. (I) 비율은 bFGF의 존재 또는 부재하에 배양 된 세포로부터 iMOP 세포를 표지하지 않는 바는 10 μm의이다. 막대 그래프와 에러 바 내에 표시 하였다 분석 개별 셀의 수는 평균의 표준 오차 (SEM)로서 도시되었다. 세포 수는 N = 5 독립적 인 실험에서 있었다. 학생의 t- 테스트가 통계적 유의성을 결정하기 위해 이루어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
감각 상피 분화 그림 2. 일반 회로도. 감각 상피에 iMOP 세포를 구별하기위한 (A) 타임 라인. 선 그래프는 세포 분해 및 미디어의 시간 변화를 나타낸다. (B) 일반 위상차비유도 감각 상피 분화 동안 0 일째에 otospheres 이미지, (C) (3), (D) (7) 및 (E) (10). 스케일 바의 길이는 100 ㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
iMOP 배양 배지에서 배양 iMOP 세포의 IMOP 유래 감각 상피. Otosphere에서 세포주기 정지와 차별화를 나타내는 마커의 그림 3. 식입니다. 세포의 핵은 (A) 및 훽스트 (B) Cdkn1b 항체로 표지 하였다. 필라멘트는 액틴 (C) 팔로이 딘으로 표지 하였다. (D) iMOP 증식 세포를 포함하는 전형적인 otospheres의 합성 화상. iMOP 세포로부터 Otospheres 관능 epith에서 배양 하였다십일에 대한 엘리아 문화 미디어. otopsheres에서 세포 (E) 훽스트 (F) Cdkn1b 및 (G) 팔로이 딘 표시했다. otospheres의 (H) 합병 이미지 Cdkn1b과 팔로이 딘 라벨을 증가 게재. 증식 otospheres는 (I) 훽스트 (J) Cdh1, (K) 팔로이 딘으로 표시했다. (L) 병합 된 이미지는 마커에서 약한 형광을 보여줍니다. 감각 상피로 분화 Otospheres는 (M) 훽스트 (N) Cdh1, (O) 팔로이 딘으로 표시했다. (P) 병합 된 이미지가 전형적인 강한 Cdh1과 팔로이 딘 라벨을 보여줍니다. 스케일 바의 길이가 표시되지 않는 한 10 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
신경 세포의 분화 그림 4. 일반 회로도. 뉴런에 iMOP 세포를 구별하기위한 (A) 타임 라인. (B) 제 1 일, (C) (3), (D) (5) 및 (E) 제 화살촉은 신경 돌기를 지점에서 신경 분화를 겪고 iMOP 셀의 위상차 이미지. (F) 훽스트 (Hoechst)와 (사) Cdkn1b으로 표시 iMOP 문화 미디어 otospheres으로 배양 iMOP 세포의 형광 이미지. (H) 훽스트와 Cdkn1b 표지 세포의 병합 된 이미지입니다. 신경 세포 분화 배지에서 배양 7 일 후 iMOP 세포의 형광 이미지. 세포의 핵은 (I) 훽스트와 (J) Cdkn1b으로 표시했다. 훽스트와 Cdkn1b 표지 세포 (K) 합병 이미지입니다. 언급하지 않는 한 스케일 바의 길이는 10 μm의 수 있습니다. OM / 파일 / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 세포주기의 종료와 신경 세포 분화의 분자 마커 지표 5. 식입니다. 칠일 신경 세포의 분화 후 iMOP 세포. 핵은 세포의 형태 및 (c) Cdkn1b 항체를 강조 (A) 훽스트 (Hoechst), (B) Tubb3 (신경 β-tubulin의) 항체로 표지 하였다. (D) 각 셀에 Cdkn1b과 Tubb3의 라벨과 병합 된 이미지입니다. 스케일 바의 길이는 20 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
OAD / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
Cdkn1b 발현도 6 Cdkn1b의 단세포 정량적 형광 강도 분석. (A) 표준화 된 형광 강도는 각 셀에서 Cdkn1b 및 훽스트 형광 강도의 비를 계산함으로써 결정 하였다. 표준화 형광 강도 히스토그램 세포 수에 대해 플롯 팅 하였다. 감각 상피 (SE) (적색)로 분화의 bFGF (검정)과의 iMOP otospheres의 존재 하에서 배양 iMOP 세포 증식에서의 정규화 Cdkn1b 형광 강도를 나타내었다. 임계치는 증식 (블랙) 및 감각 상피 분화 배양 (레드)에서, 0.65 표준화 형광 강도 유닛 (화살촉) (B) 임계 값 이상 Cdkn1b iMOP 발현 세포의 백분율로 설정 하였다. (C)는 훽스트 Myo6 및 항체로 표지 감각 상피 분화 iMOP 세포의 형광 이미지를 합병. (D (E) (검정색) 증식 및 신경 분화 문화 (빨간색)에서 Cdkn1b을 표현 iMOP 세포의 백분율. 분석에 사용되는 각 셀은 각각의 막대 그래프에 표시 하였다. 결과는 다른 실험에서 컴파일 된 (N = 3)과 오차 막대 SEM으로 묘사했다. 학생 t 테스트는 통계적 유의성을 측정 하였다. (F)는 바이폴라 또는 훽스트와 Tubb3 표지 의사 유니 폴라 iMOP 유래 신경 세포의 형광 이미지를 합병했다. 스케일 바의 길이는 20 μm의 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 세포 배양 용기 | 스와rface 면적 (cm 2) | 세포의 수는 유지 보수를 위해 시드 | 감각 상피 분화 시드 세포의 수 | 세포의 수의 연결을 차별화 시드 | 60mm 접시에 스케일링 팩터 상대 | 사용 미디어의 볼륨 (ML) | |
| Multwell 플레이트 | |||||||
| (96) | 0.3 | 10,000 | 20,000 | 10,000-50,000 | 0.015 | 0.1 | |
| (24) | (2) | 90,000 | 180,000 | 100,000-150,000 | 0.100 | 0.5 | |
| (12) | 4 | 180,000 | 360,000 | 300,000 | 0.200 | 1 | |
| (6) | (10) | 50 만 | 1,000,000 | 50 ~ 75 만 | 0.500 | (2) | |
| 그릇 | |||||||
| 35mm | (10) | 50 만 | 1,000,000 | 50 만 | 0.500 | (2) | |
| 60mm | (20) | 1,000,000 | 2,000,000 | 1,000,000-1,500,000 | 1.000 | 3 | |
| 100mm | (60) | 2,500,000 | 5,000,000 | 2,500,000- 3,000,000 | 3.000 | 8 | |
바르에서 IMOP 세포의 분화의 유지 보수 표 1. 세포 수빚을내는 조직 배양 플레이트 형식.
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Discussion
IMOP 문화 모니터링
신규 iMOP 세포주의 분화를 자기 갱신을 유지 및 촉진시키기위한 프로토콜을 설명하는 추가 도금 포맷 (표 1)을 포함한다. 일상적인 확장과 iMOP 세포의 분화에 도움이되는 몇 가지 중요한 단계가 설명되어 있습니다. 다 능성 줄기 세포 배양과 마찬가지로, iMOP 세포는 이론적으로 불명확 수명을 갖는다. 세포주가 제대로 유지되도록하려면, iMOP 문화가 일상적으로 세포 생존,자가 재생과 분화 가능성에 대해 모니터링된다. 분리 한 후 세포 생존을 확인하려면, 우리는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 일반적으로, 세포의 70 % 이상이 분해 후에 실용적이다. 수행 C-Myc와 및 Sox2이 항체와 면역 염색, iMOP 세포의자가 재생을 모니터링 할 수 있습니다. 증식 배양 조건에서 iMOP 세포는 18 시간 ~의 두 배의 시간이 있습니다. 수행 또는 자체 갱신 마커의 발현의 변화시간을 ubling 변경된 자기 갱신의 가능성 지표입니다. iMOP 세포, 또는 감각 신경 상피에 대한 초기 단계의 마커의 세포주기 출구와 표현의 분화 잠재력을 모니터링하는 것은 세포의 분화 잠재 성을 평가하는 데 사용된다. iMOP 세포 상술 criterions에 중 어느 하나를 통과하지 않는 경우, 배양 물을 정지하는 것이 바람직하다.
IMOP 문화에 영향을주는 변수
iMOP 세포를 배양 한 중요한 단계는자가 재생을 촉진하는 배양 물에서의 bFGF의 활성 농도를 유지하는 것이다. 세포 (29, 30)를 배양 할 때의 bFGF는 소문에 37 ° C에서 매우 불안정하다. 배양의 성장은 상당히 불안정 bFGF에 의한 자발적인 분화에 영향을받을 수있다. 현재의 프로토콜에서, 신선한 매체는 끊임없이 5 NG / ㎖의 bFGF 위 수준을 유지하기 위해 배양 물에 공급된다. bFGF를 수준의 안정화에서 방출을 제어 사용글리콜 및 폴리 락트산 미립자 매체 (31)의 bFGF의 정상 수준을 유지하는 데 필요한 미디어 변경의 빈도를 줄일 수있다. 꾸준히 이형성 bFGF를 첨가 자주 iMOP 배양 bFGF의 농도를 유지하기 위해 미디어를 추가 할 필요성을 감소시킬 것이다.
iMOP 세포의 생존력을 유지하는 또 다른 중요한 단계 해리 시약 및 기계적 전단력에 노출을 제한하는 것이다. 현재 프로토콜에서, 해리는 1 mM의 EDTA와 함께 배양하여 수행됩니다. 활발한 피펫으로 인한 과도한 기계적 전단을 줄이고 세포 생존 능력을 높이는 데 도움이됩니다 iMOP 세포를 계대 할 때 여러 원심 분리 단계를 제한, EDTA와 과도한 배양 시간을 억제. 다음 단계에 주어진주의 효과적으로 문화의 확장 동안 세포의 많은 수의 생존 능력을 유지할 수 있습니다.
iMOP 세포 배양 루틴 동안 세포를 해리위한 여러 방법을 시험 하였다. Mechan피펫으로부터 iCal의 전단은 otospheres 해리를 사용할 수 있지만, 균일하게 또는 일관성있게 하나의 세포를 생성하지 않는다. iMOP 세포의 세포 분리에 대한 상업적으로 이용 가능한 시약의 사용은 효과적으로 otospheres에서 단일 세포를 생성 할 수 있지만,이 시약은 otospheres를 개혁하고 처리 표면에 부착하는 세포의 접착 특성에 영향을 미친다. 상업적 시약을 사용하기 위해, 여러 세척액 분화 프로토콜을 이용하기 전에 해리 시약을 제거하기 위해 요구되었다.
현재 분화 프로토콜에서 두 감각 신경 세포 및 상피 분화 조건은 단일 세포 또는 사균의 덩어리 형태로 관찰되었다 세포 죽음을 초래. 사멸 세포의 죽음은 체외에서 장기간 배양하는 동안 적절한 분화 또는 생존 단서의 부족으로 인해 수 있습니다. B27 보충제 포함 모두 분화 조건은 세포의 생존을 촉진. B27의 supplem 있지만ENT 1 차 해마 신경 세포 (32)의 생존을 촉진하는 것으로 알려져있다, 그것은 iMOP 세포의 생존을 촉진하기위한 충분하지 않을 수 있습니다. 이러한 유지하고 일상적인 문화 동안 체외 분화 iMOP 세포의 생존을 증가 도움이 될 수 ROCK 저해제로서 화합물의 추가. ROCK 억제제 광범위 분화 (33)에 영향을주지 않고 혈청 배양에서 세포의 생존을 촉진하는 다 능성 줄기 세포 배양에 사용되어왔다. 배양액 ROCK 억제제 첨가 iMOP 세포의 분화능에 영향을 미치지 않고 긴 분화 프로토콜 중에 세포 생존을 향상시킬 수있다. 증가 된 세포 생존 효율적 성숙한 유모 세포 또는 SGNs 많은 수를 생성하는 프로토콜의 개발을 허용한다.
IMOP 차별화의 초기 마커 증가 Cdkn1b 식
초기 인공 와우 개발 과정에서 세포의 초기 이벤트사이클 종료는 유모 세포,지지 세포와 SGNs (34)에 대한 차별화를 앞에. 신경 전구 세포의 유사 분열 터미널이 파베이스에서 시작하여 달팽이관 (35)의 정점을 향해 진행에 펼쳐집니다. 반대 그라데이션, 헤어 세포와지지 세포를 야기 할 prosensory 조상의 단말기 유사 분열은 달팽이관 (34, 36)의베이스에 정점에서 진행된다. Cdkn1b의 일시적인 발현 후 세포 분열 상태로 잘 상관 있지만, 현상 달팽이관의 세포주기의 종료를 촉진 인자 유일한 가능성이 아니다. 이 지원에 Cdkn1b 돌연변이 동물은 여전히 후 유사 분열 유모 세포 (37)을 개발할 수 있습니다. 대신 Cdkn1b 분화의 개시를 표시하는 초기 지표로서 사용될 수있다. 비유도 iMOP 분화 배양, 분화 초기 마커는 분명한 형태 적 특징이 관찰되기 전에 분화의 초기 단계를 촉진하는 프로토콜 개발에 도움이 될 것입니다. </ P>
귀의 개발과 마찬가지로, 사이클 종료 iMOP 세포에서 증가 Cdkn1b 수준의 차별화와 결과를 시작합니다. iMOP 세포 증식에서 Cdkn1b 단지 낮은 수준의 발현이 관찰 될 수있다. 이러한 Cdkn1a (P21의 CIP) 등의 다른 사이클린 의존성 키나제 억제제는 iMOP 세포에서 정상 세포주기 진행을 담당 할 수있다. 감각 상피와 iMOP 세포의 신경 세포 분화하는 동안, 단일 세포 정량 분석 iMOP 문화 (그림 6A, C)를 구별에 Cdkn1b의 증가 식 세포의 일부를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이들 세포에서의 발현은 Cdkn1b 말단 분화를 겪고 iMOP 셀의 표시이다.
세포 운명 결정 유학을위한 셀룰러 플랫폼으로 IMOP 세포
iMOP 세포는 시험관 내에서 상이한 계통에 귀 전구 상태로부터 전이 할 수 있기 때문에, 그것들은 귀 세포의 운명을 연구하는데 이용 될 수있다결심. 현재 기술 된 프로토콜은 상이한 귀 세포 유형을 생성하는 비유도 분화 절차를 사용 하였다. iMOP 시스템은 생리 활성 분자, 화합물 및 정의 유전자 성숙한 머리 세포를 향해 iMOP 세포를 안내, 지원 세포와 SGN 계통의 추가 할 수 있습니다. iMOP 셀룰러 플랫폼을 사용하는 이유 중 하나는 분화를 촉진 후보 녹음 방송 요인 (TF)를 테스트하는 것입니다. 키 TF의 발현은 모발 또는 신경 세포의 분화를 구동하는데 사용될 수있다. 확립 된 마커 또는 모발 세포 SGNs의 형태 적 특징과 함께 Cdkn1b의 발현은 별개의 계통 (38, 39)에 귀 후보의 TF의 기여도를 결정하는데 사용될 수있다.
이러한 Atoh1 같은 후보 TF가 헤어 전지 개발에 필수적이며 손상된 달팽이관 40,41 머리 세포 분화를 촉진하는 용도 변경되었다. iMOP 세포로 Atoh1의 소개 머리 세포 분화를 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다. developi에서달팽이관을 겨, Ngn1과 NeuroD1 모두 생체 42-44에서 적절한 SGN 차별화 필요합니다. iMOP 세포에서 Ngn1 또는 NeuroD1의 발현은 SGN의 분화를 촉진 할 수있다. 이러한 실험 TF가 개별적으로 또는 조합의 발현이 신경 세포 또는 섬유 아세포로 45-48 다 능성 줄기 세포를 변환 할 수있는 유도 된 신경 세포 생성 (IN)와 유사하다. 일반적 유모 세포 또는 SGNs 개발 중에 발현되는 TF가 도입 머리 셀 또는 SGN 계통 향해 iMOP 세포를 유도하기위한 좋은 전략이다.
iMOP 유래 유모 세포와 SGNs 다수의 분화를 촉진 조건 빠르게 달성 될 수 있고, 비용 효율적 설치류 노동 집약적 시험이 개시되기 전에 질병 모델링, 소 분자 스크리닝 및 독성 테스트에 대한 강력한 셀룰러 플랫폼을 제공한다 . 설명 된 프로토콜들에 이용 될 수있는 간단하고 다양한 방식을 제시귀 전구 차별화를 tudying과하는 대규모 실험에 대한 의무입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
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