Protocol
1. Att upprätthålla självförnyelse i IMOP Cells
- Bered iMOP kulturmedier: DMEM / F12, 1X B27 tillskott, 25 | ig / ml carbenecillin och 20 ng / ml bFGF. Gör 50 ml iMOP odlingsmedier med hjälp av sterila reagenser. Värm upp 49 ml av DMEM / F12 i en 50 ml E-i en 37 ° C vattenbad.
- Thaw 50X B27 supplement och filtersteriliserade 100 mg / ml carbenecillin alikvoter för 5 minuter i en 37 ° C vattenbad. Tina upp 100 | ig / ml bFGF alikvot vid RT. Tillsätt 1 ml 50X B27, 10 pl av 100 | ig / ml bFGF och 12,5 | il av 100 mg / ml carbenecillin till DMEM / F12.
- Använd 3 ml av media i en 60 mm vävnadsodlingsskål för odling iMOP celler. Lägg till färskt medium till kulturer varannan dag genom att fördubbla volymen av media. Se till att koncentrationen av bFGF inte sjunker under 5 ng / ml.
- Kultur iMOP celler vid 37 ° C med 5% CO 2. Passage celler efter 5 - 7 dagar i kulturen som anges i stegen nedan. Överför kultur till en 15ml E med användning av en 10 ml pipett spets.
- Gör en mM EDTA i HBSS genom utspädning 0,1 ml av 0,5 M EDTA pH 8,0 i 50 ml HBSS. Pre-varm 1 mM EDTA gjord i HBSS i ett 37 ° C vattenbad.
- Harvest celler genom gravitationssedimentering eller centrifugering vid 200 xg under 5 min. vid RT. För gravitationssedimentering, placera 15 ml koniskt innehållande kulturerna i 37 ° C inkubator i fem - tio minuter. Efter den tiden observera otospheres samlas på botten av 15 ml koniskt.
OBS: Överdriven centrifugalkraften kan orsaka cellskador. - Försiktigt aspirera bringade media med en 2 ml aspire pipett utan att störa cellpelleten. Tillsätt 0,5 ml förvärmda 1 mM EDTA HBSS lösning för att cellpelleten. Med hjälp av en P1000 pipett försiktigt pipettera upp och ned 2 - 3 gånger. Placera konisk vid 37 ° C och inkubera i <5 min för att underlätta dissociation till enstaka celler.
- Snurra försiktigt cellen lösningen för att avgöra om otospheres dissocieras. Om ingen otosfärer sedimenterar till botten av den koniska cellerna dissocieras. Tiden för inkuberingen kan variera.
OBS: förlängd inkubation med EDTA resulterar i överdriven celldöd. - Ta bort celler från 37 ° C, tillsätt 2 ml av media för att neutralisera och späda ut EDTA. Samla cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid RT. Sug ut utspädd EDTA med användning av en 2 ml aspire pipett och tillsätt 5 ml 1X PBS för att tvätta cellerna.
- Snurra cellerna ner vid 200 xg under 5 minuter vid RT och aspirera ut 1X PBS genom att använda en 2 ml aspire pipett. Resuspendera cellerna med användning av en P1000 pipett i 0,5 ml iMOP odlingsmedier genom att försiktigt pipettera upp och ned 2 - 3 gånger.
- Räkna celler med hjälp av en mikroflödespartikelräknare med lämpliga kassetterna 28. En sammanflytande tallrik iMOP celler kommer att innehålla ~ 6 X10 6 celler. Späd celler 1: 100 i media och tillsätt 75 ul av cell lösningen i kassetten för räkning. Plansch 1 x 10 6 celler i en 6 cm platta i iMOP Culture media (~ 1: 10 utspädning). Passage iMOPs var 5 - 7 dagar.
OBS: Celler som bildar stora otospheres eller fästa till botten av vävnadsodlingsskålen kommer differentiera. Celler kommer också att dö om kulturerna är över konfluenta.
2. nedfrysning och upptining IMOP Cells
- Bered syntetiskt frysning mediet genom upptining och ekvilibrering av lösningen till 4 ° C före fryscellerna.
- Samla celler från en sammanhängande 6 cm skål med iMOP celler. Använd en 10 ml pipett och överföra celler (~ 6 - 8 x 10 6 celler) i en 15 ml konisk.
- Harvest celler genom gravitationssedimentering eller centrifugering vid 200 xg under 5 min vid RT. Om otospheres är små, kommer cellerna inte nöja genom gravitation sedimentering. Tillval: Räkna celler med hjälp av steg 1,9 för att bestämma totala cellantalet.
- Aspirera bringade media med en 2 ml aspire pipett medan den lösa cellpelleten bakom.
- Lägg 0,25 ml av syntetiska frysmedier att resuspendera cells vid en densitet av ~ 5 x 10 5 till 3 x 10 6 celler / ml. Pipett försiktigt celler med en P1000 pipett. Överför cellsuspensionen till kryogeniska flaskor med hjälp av en P1000 pipett med 1 ml filtrerad spets.
- Placera rören i en alkohol fri frysbehållaren och placera frysning behållaren vid -80 ° C för att reducera temperaturen 1 ° C per minut tills temperaturen når -80 ° C.
- För långtidsförvaring av celler, överför flaskorna till ångfasen i en flytande kväve lagringstank. För att tina upp celler för kultur, jämvikt kryogen flaska innehållande frysta celler vid -80 ° C.
- Pre-varm iMOP odlingsmedier i ett 37 ° C vattenbad.
- Tina den frusna flaskan snabbt genom att snurra på botten av flaskan i ett 37 ° C vattenbad. Tillsätt 1 ml av förvärmd iMOP odlingsmedier till upptinade cellerna en gång den sista iskristall försvinner. Överför celler till en 15 ml konisk och lägg till ytterligare 4 ml iMOP odlingsmedier
- Snurra 15 ml coniska för 5 minuter. vid 200 x g och aspirera de förbrukade medierna. Resuspendera cellerna i 2 ml iMOP odlingsmedia och platt celler i en 6 cm skål. Inkubera kulturer vid 37 ° C med 5% CO2 för expansion.
3. Differentiering IMOP Celler i Sensorisk epitel
- Förbered 50 ml iMOP sensoriska epitel differentiering media: DMEM / F12, 1X B27 komplettera, 25 ug / ml carbenecillin. Gör 50 ml iMOP sensoriska epitel differentiering media. Värm upp 49 ml av DMEM / F12 i en 50 ml E-i en 37 ° C vattenbad. Tina 50X B27 komplettera och 100 mg / ml carbenecillin portioner för 5 min. i ett 37 ° C vattenbad. Tillsätt 1 ml 50X B27 och 12,5 pl av 100 mg / ml carbenecillin i DMEM / F12.
- Att skörda, dissocierar, resuspendera och räkna celler upprepa steg 1,4-1,9
- Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm maträtt på Dag -3 använder iMOP odlingsmedier. På dag 0, överföringskulturer med hjälp av en 10 ml pipett i en 15 ml konisk. Samla otosfärer av gravitationssedimentering som anges i steg 1.6. Aspirera bringade ut media med en 2 ml aspire pipett och lämna otospheres på botten av den koniska.
- Lägg försiktigt i 2 ml av sensorisk epitel differentiering media. Transfer otospheres till en 6 cm skål med ett stort hål 10 ml pipett.
OBS: Mekanisk klippning från hårda pipettering kan skilja celler från otospheres. - Tillsätt 2 ml av färsk sensoriska epiteldifferentiering media till kulturer varannan dag. Om så är nödvändigt, kan celler uppsamlas genom gravitationssedimentering och ersattes mediet.
- Samla otospheres på dag 10 genom överföring till ett 15 ml koniskt och låta otospheres sedimentera som anges i steg 1.6.Aspirate de förbrukade media med en 2 ml aspire pipett och lämna otospheres ostört.
- Fix otospheres genom inkubation i 4% formaldehyd i 1 x PBS under 15 min vid RT. Avlägsna formaldehydlösning, tvätta otospheres med tvättbuffert (1 x PBS innehållande 0,1% TritonX-100) före inkubering i blockeringsbuffert (1 x PBS innehållande 10% normalt getserum och 0,1% Triton X-100) under 1 timme.
- Byt buffert och inkubera prover i blockerande buffert med utspädd antikropp. Inkubera vid 4 ° C. Tvätta prover med 1X PBS innehållande 0,1% Triton X-100 under förutsättning att otosphere att immunfärgning 27. Överför otospheres i 1X PBS och placera otospheres till montering media på ett objektglas med hjälp av en P1000 pipett. Sätt en täck över provet och låt monterings media torka vid 4 ° C.
- Förvärva epifluorescence bilder med hjälp av ett inverterat mikroskop installation utrustad med en 16-bitars CCD-kamera och antingen en 20X 0,75 luft eller en 40X 1,3 NA oljeimmersionsobjektiv. Samla fluorescens från olika färgkanaler med hjälp av noterade (excitation och emission) våglängder: blå (377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm), grön (475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm), röd (562 ± 20 nm / och 625 ± 20 nm) och infrarött (628 ± 20 nm / och 692 ± 20nm).
4. Testmetoder edu Inkorporering
- På dag -3, plattan 1 x 10 6 iMOP celler i en 6 cm skål. Tre dagar senare, den dag 0, skörd, dissociera, resuspendera och räkna celler genom steg 1,4-1,9 upprepas.
- Platta 2,5 x 10 5 celler i iMOP odlingsmedia och 5 x10 5 celler i sensoriska epitel differentiering medier i olika brunnar på en 6 bra maträtt.
- Bestämma procenten celler i S-fas efter edu inkorporering på dag 3 med hjälp av en edu inkorporeringsanalys
- Lägg edu lager direkt till iMOP kulturer för att erhålla en slutlig koncentration av 1 | iM edu i odlingsmediet.
- Inkubera edu i iMOP kulturer för 2 h och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2. Harvest, dissocierar och samla cellerna upprepa steg 1,4-1,9. Lägg i 4% formaldehyd i 1 x PBS under 15 minuter. vid RT för att fixera celler. Harvest cellerna genom centrifugering vid 200 xg under 5 min vid RT. Avlägsna formaldehydlösning och properly avyttra.
- Etikett kärnor av celler med Hoechst och införlivade EDU med grön fluorescens färg azid enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Alla tvättar görs med 1X PBS, 3% BSA och 0,1% Tween 20. Tvätta cellerna med 1X PBS två gånger. - Montera celler på en bild med hjälp av antifade reagens och placera en 1,5 täckglas över provet. Förvärva fluorescerande bilder av märkta celler med hjälp av en epifluorescensmikroskopi.
5. Skilja IMOP-Derived neuroner
- Gör 50 ml av neuronal differentiering Medel: Neurobasal media, 1X B27 supplement, 2 mM L-glutamin. Tö flaska 50X B27 och 200 mM L-glutamin i 37 ° C vattenbad i 5 min. Tillsätt 1 ml 50X B27 och 0,5 ml 200 mM L-glutamin till 48,5 ml Neurobasal medium.
- Coat coverglass genom att placera 12 mm runda 1,5 täckglas i en steril 10 cm platta och tillsätt 70% EtOH för plattan för att steriliseras och rengör täckglas.
- Skaka försiktigt vikenrslips att säkerställa att de är täckta i etanol. Låt plattan under 10 min vid RT. Skölj täck 3 gånger med sterilt 1X PBS för att tvätta bort den kvarvarande etanol. Skölj täck gång med steril H 2 0 att tvätta bort kvarvarande 1X PBS.
- Aspirera H 2 0 användning av en 2 ml aspire pipett och låt täck torka. Exponera täckglasen för UV-ljus i vävnadsodling huven för 15 minuter. Butikstäckglas i en steril omgivning om inte omedelbart användes.
- Placera en 12 mm rund täckglas i varje brunn i en 24 brunn maträtt. Skaka plattan försiktigt för att säkerställa att täck ligga platt på botten av brunnen.
- Tö 2 mg / ml poly-D-lysin förrådslösning vid RT och späd till en 10 ^ g / ml poly-D-lysin koncentration i 1 x PBS. Lägg 0,25 ml 10 pg / ml poly-D-lysin till brunnarna. Låt plattan i 37 ° C inkubator i en timme.
- Tvätta brunnarna 3 gånger med sterilt 1X PBS. Tö 10 mg / ml laminin stamlösning vid RT och späd till 10 ^ g / m ^li 1X PBS. Lägg 0,25 ml 10 | ig / ml laminin arbetslösning i en enda brunn i en 24 flerbrunnsskål. Inkubera plattan vid 37 ° C inkubator. Aspirera ut laminin lösningen med en 2 ml aspire pipett.
- Tvätta täckglas 3 gånger med 1 x PBS genom tillsats i 1 ml 1X PBS med en P1000 pipett och avlägsnande av 1 x PBS genom att aspirera med en 2 ml aspire pipett. Lämna 1X PBS från sista tvätten i brunnen tills cellerna är redo att vara klädd. Initiera neuronal differentiering genom avverkning, dissociation och räkna celler i steg 1.4-1.9.Plate 1 x 10 6 celler i en 6 cm maträtt på Dag -3.
- På dag 0, skörd, dissociera och räkna celler genom att upprepa 1,4-1,9. Seed 1 x 10 5 - 1,5 x 10 5 iMOP celler i 0,5 ml förvärmda neuronal differentiering media per brunn i en 24 flerbrunnsskål. Aspirera och lägga förvärmda neuronal differentiering media till kulturer varannan dag.
- Fix iMOP-härledda neuroner i 4% formaldehyd under 15 minuter. ent RT på dag 7. Avlägsnande formaldehydlösning, tvätta iMOP-härledda neuroner med tvättbuffert (1 x PBS innehållande 0,1% TritonX-100) före inkubering i blockeringsbuffert (1 x PBS innehållande 10% normalt getserum och 0,1% Triton X-100) under 1 timme.
- Byt buffert och inkubera prover i blockerande buffert med utspädd antikropp. Inkubera vid 4 ° C. Tvätta prover med 1X PBS innehållande 0,1% Triton X-100 patientår celler att immunfärgning 27. Tvätta coverglass med 1X PBS innan den placeras på monterings media. Låt monterings media torka vid 4 ° C innan förvärva epifluorescens bilder som anges i steg 3.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
bFGF Utträde Minskningar spridning i IMOP Celler
För att minska fortplantningsförmågan hos iMOP celler och initiera differentiering av iMOP celler, bFGF tillbaka från odlingarna. För att bekräfta att tillväxtfaktor uttag minskar spridningen var Edu inkorporering anställd som prolifereringsanalys. Procentandelen av celler som inkorporerade edu från otospheres odlade med iMOP odlingsmedia (innehållande bFGF) och otospheres odlade i sensoriska epitel media (utan bFGF) jämfördes. Otosphere kulturerna pulsades med nukleotidanalogen edu, skördades och fixerades. Incorporated edu nukleotider fluorescerande med Alexafluor 488 azid med hjälp av click-kemi. Celler från otospheres odlade i frånvaro av bFGF visade minskad införlivning av EDU i förhållande till celler odlade med bFGF (figur 1 A-F). Eftersom storleken Of otosphere ökade, var det allt svårare att visualisera alla cellerna från otosphere med ett epifluorescent mikroskop. För att lösa detta, cellerna dissocierades och monteras så att de kan entydigt visualiseras en massa. Även efter dissociation och fixering, cellerna åter aggregeras. För att bibehålla cellerna i ett dissocierat tillstånd, var rengöringsmedel som hindrade cellerna från re-aggregerande testas. Tween 20 var en av de detergenter som hindrade åter aggregering av cellerna. Dissocierade celler tvättades med 0,1% Tween 20 och monteras på objektglas. Edu märkta cellerna visualiserades sedan genom epifluorescensmikroskopi (Figur 1G, H). Representativa resultat från individuella experiment (n = 5) visade en signifikant minskning i procentandelen av edu märkta celler från 48% till 19% efter 3 dagar efter bFGF tillbakadragande (p <0,005). Dessa resultat bekräftar en dramatisk minskning i procentandelen av S-fasceller och proliferativ potential iMOP celler efterbFGF tillbakadragande.
IMOP härledda Sensorisk epitel Express Cdkn1b och Visa morfologiska förändringar
En tidslinje iMOP sensoriska epitel differentiering protokoll visas (Figur 2A). Otospheres från proliferativa odlingar dissocieras till enskilda celler och tilläts återhämta sig under 3 dagar i iMOP odlingsmedia. Denna metod hjälper anrika celler som förökar sig och väljer mot post mitotiska celler i dessa utgångs kulturer. Efter 3 dagar var nybildade otospheres ympades i sensoriska epitel differentiering medier och tilläts genomgå ostyrd differentiering under 10 dagar. Ljusa fält bilder av typiska kulturer innehållande otospheres vid olika tidpunkter efter ympning uppvisade en initial minskning i storlek innan otospheres börja öka i storlek (Figur 2B-E).
27. För att bestämma om uttryck av Cdkn1b (p27 KIP) kan användas som en markör för differentiering, var otospheres från proliferativa eller sensoriska epitel differentierade iMOP kulturer jämförs. Fluorescerande markörer visualiserades och fångas upp av epifluorescensmikroskopi. Representativa bilder av otospheres från proliferativa kulturer visade lågt uttryck av Cdkn1b utanför kärnorna med nästan ingen phalloidin färgning (Figur 3 AD). Otospheres odlade i sensoriska epitel differentiering medier uppvisade ökad expression av nukleär Cdkn1b samtidig med uppträdandet av phalloidin märkning i de perifera kanterna av celler (Figur 3 EH). I prolifererande iMOP otospheres, Cdh1 (E-cadherin) och falloidin är svagt märkta (Figur 3 IL). I differentierade iMOP otospheres, uttalad phalloidin och Cdh1 märkning markera morfologiska förändringar i aktinfilament och regioner i cell-cell adhesion (Figur 3 MP), som liknar tidigare resultat 27. Under sensoriska epitel differentiering, de morfologiska förändringar i aktinfilament parallellt utseende Cdh1 uttryck i vidhäftningsställen mellan celler. I detta protokoll, ökningen i Cdkn1b uttryck tillsammans med förändringar i falloidin och Cdh1 fungera som tidiga indikatorer på sensoriska epitel differentiering i iMOP celler.
IMOP härledda Nervceller Express Cdkn1b och Tubb3
En schematisk bild av iMOP neuronal differentiering protokoll visas (figur 4A). I likhet med ovannämnda protokollet var iMOP celler dissocierades och alföljde till återhämtning i 3 dagar i iMOP odlingsmedia. Otospheres skördades, dissocieras till enskilda celler och såddes på poly-D-lysin och laminin belagda täckglas. Cellerna tilläts att differentiera i 7 dagar. Representativa ljusa fält bilder på tidpunkter visas progressiva morfologiska förändringar när de differentierade i iMOP-härledda neuron (figur 4B-E). Genom Dag 7, kan långa neuriter ses som sträcker sig från cellkroppar (Figur 4E pilspetsar). För att bestämma förändringar i expressionsnivåer av Cdkn1b under neuronal differentiering, förökande iMOP celler och iMOP-härledda neuroner jämfördes. Otospheres märktes med Hoechst och Cdkn1b antikroppar. iMOP celler från prolifererande otospheres hade några celler med låg kärn Cdkn1b uttryck (Figur 4 FH). Vidare iMOP-härledda neuroner uppvisade en ökning av antalet celler med nukleär Cdkn1b uttryck 7 dagar efter neuronal differentiering (fig 4IK). För att avgöra om Cdkn1b cellerna att anta en neuronal härstamning, var märkningen av iMOP härledda nervceller med neuronal markör Tubb3 gjort. Representativa bilder av iMOP-härledda neuroner visade co-märkning av Cdkn1b och Tubb3 (Figur 5 AD). Förstoring och kvantifiering av neuriter från dessa celler visade en genomsnittlig 1,5 neuriter associerade med varje Tubb3 märkta cell (n = 60) (Figur 5 EG). I vår neuronal differentiering protokoll, immunfärgning med Cdkn1b och Tubb3 kan användas som en indikator på differentiering till bipolär eller pseudo unipolära iMOP härledda neuron.
Nuclear Cdkn1b Uttrycks nivåerna ökar efter Initiera Differentiering
De morfologiska förändringar i otospheres visar kvalitativa förändringar i iMOP celler som de genomgår differentiering. För att uppnå kvantitativa resultat från IMMUnofluorescence bilder för att beteckna tidiga differentieringshändelser, nukleär fluorescens intensitet Cdkn1b från enskilda prolifererande iMOP celler (n = 239) och iMOP celler som genomgår sensoriska epitel differentiering (n = 246) mättes. För att normalisera Cdkn1b fluorescenssignaler från oberoende experiment, var förhållandet av Cdkn1b Hoechst fluorescens från enskilda celler bestämdes. Histogram av den normaliserade fluorescensintensiteten hos Cdkn1b från prolifererande iMOP celler (svarta) och sensoriska epitel differentierande iMOP celler (röd) ritades (figur 6A). En ökning av antalet höga Cdkn1b uttryckande celler observerades som en högerförskjutning av histogrammet för sensorisk epitel differentiering (rött) i förhållande till histogrammet för prolifererande iMOP celler (svarta). För att bestämma ökningen av procentandelen celler som uttrycker Cdkn1b, en tröskel för normaliserade Cdkn1b fluorescensintensitetsenheter (0,65) sattes (pilspets) och procentandelen celler abo ve tröskeln bestämdes. Efter sensoriska epitel differentiering, iMOP celler uppvisade en ökning från 25,3% till 67,1% av celler som uttrycker Cdkn1b (figur 6B). Samma kvantitativ analys tillämpades på iMOP-härledda neuroner. När man jämför proliferativa iMOP celler (n = 525) och 7 dagars iMOP-härledda neuron (n = 583) en högerförskjutning i histogrammet i samband med iMOP härrörande neuroner observerades i förhållande till histogrammet för prolifererande iMOP celler (figur 6C). Bestämning av procentandelen celler över tröskel avslöjade en ökning av Cdkn1b uttryckande celler från 23,5% till 85,5% (fig 6D). Med användning av de beskrivna protokollen, kvantitativ analys av Cdkn1b expressionen bekräftade en ökning av antalet celler som uppreglerar Cdkn1b under sensorisk epitel och neuronal differentiering. De ökade antalet Cdkn1b-uttryckande celler kan användas för att bekräfta differentiering av iMOP celler i dessa protokoll.
jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. edu Införlivande som en analys för att bestämma proliferativ staten IMOP kulturer. IMOP härledda otospheres odlats i närvaro av bFGF. Kärnor av celler märktes med (A) Hoechst och (B) EDU Alexafluor 488. (C) Sammanslagen bild av Hoechst och EDU fluorescens. Otospheres odlade 3 dagar i media som saknar bFGF. Celler från kulturerna märktes med (D) Hoechst och (E) EDU Alexafluor 488. (F) Sammanfogade bilder av Hoechst och EDU märkning. Sammanfogade fluorescens bilder av Hoechst (magenta) och EDU (grön) märkta celler efter dissociering otospheres och tvättning med 1 x PBS innehållande 0,1% Tween 20. Celler från otospheres odlade (G) i närvaro av bFGF eller (H) frånvaro av bFGF. Längd på skalanstaplarna är 10 ^ m om inte annat anges. (I) Procent EDU märkta celler från iMOP celler odlade i närvaro eller frånvaro av bFGF. Antalet individuella celler analyserade betecknades inom stapeldiagrammet och felstaplar var avbildad som standardfel av medelvärdet (SEM). Cellräkningar var från n = 5 oberoende experiment. Den t-test gjordes för att bestämma statistisk signifikans. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Allmänna Schematisk av sensoriska epitel differentiering. (A) Tidslinje för differentiering iMOP celler i sensoriska epitel. Linjediagrammet anger tiden cell dissociation och media förändringar. (B) Typisk faskontrastbilder av otospheres på dag 0, (C) 3, (D) 7 och (E) 10 under ostyrda sensoriska epitel differentiering. Längd fördelar bar är 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Uttryck av markörer som tyder på cellcykelstopp och differentiering i IMOP härledda Sensory epitel. Otosphere av iMOP celler odlade i iMOP odlingsmedier. Kärnor av celler märktes med (A) Hoechst och (B) Cdkn1b antikropp. Filamentöst aktin märktes med (C) falloidin. (D) Den sammanslagna bilden av en typisk otospheres innehållande prolifererande iMOP celler. Otospheres från iMOP Cellerna odlades i sensorisk epithelia odlingsmedier för 10 dagar. Celler från otopsheres markerades med (E) Hoechst, (F) Cdkn1b och (G) falloidin. (H) Sammanslagen bild av otospheres visar ökad Cdkn1b och phalloidin märkning. Prolifererande otospheres märktes med (I) Hoechst, (J) Cdh1, (K) falloidin. (L) Den sammanslagna bilden visar svag fluorescens från dessa markörer. Otospheres differentierade i sensoriska epitel var också märkt med (M) Hoechst, (N) Cdh1, (O) falloidin. (P) Den sammanslagna bilden visar typiska starka Cdh1 och phalloidin märkning. Längd skal barer är 10 pm om inte annat anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Allmän Schematisk bild av neuronal differentiering. (A) Tidslinje för differentiering iMOP celler i nervceller. Faskontrast bilder av iMOP celler som undergår neuronal differentiering vid (B) Dag 1, (C) 3, (D) 5 och (E) 7. Pilspetsar pekar på neuriter. Fluorescens bilder av iMOP celler odlade som otospheres i iMOP odlingsmedia märkta med (F) Hoechst och (G) Cdkn1b. (H) Sammanslagen bild av celler märkta med Hoechst och Cdkn1b. Fluorescensbilder av iMOP celler efter 7 dagars odling i neuronal differentiering media. Kärnor av celler märktes med (I) Hoechst och (J) Cdkn1b. (K) Sammanslagen bild av celler märkta med Hoechst och Cdkn1b. Längd skal barer är 10 pm om inte annat anges. om / filer / ftp_upload / 53692 / 53692fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Expression of Molecular Markers vägledande för cell- Cycle Exit och neuronal differentiering. IMOP celler 7 dagar efter neuronal differentiering. Kärnor märktes med (A) Hoechst, (B) Tubb3 (neuronala β-tubulin) antikroppar för att markera cellulär morfologi och (C) Cdkn1b antikroppar. (D) sammanslagna bilden med märkning av Cdkn1b och Tubb3 i enskilda celler. Längd fördelar bar är 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
oad / 53692 / 53692fig6.jpg "/>
Figur 6. Enkelcell Kvantitativ Fluorescens Intensitet Analys av Cdkn1b. (A) Normaliserad fluorescensintensiteten hos Cdkn1b uttryckning bestämdes genom att beräkna förhållandet mellan Cdkn1b och Hoechst fluorescensintensiteten från individuella celler. Den normaliserade fluorescensintensiteten plottades relativt cellantal som ett histogram. Normaliserad fluorescensintensiteten hos Cdkn1b från prolifererande iMOP celler odlade i närvaro av bFGF (svart) och iMOP otospheres differentierade till sensoriska epitel (SE) (röd) visas. En tröskel sattes till 0,65 normaliserade fluorescensintensitetsenheter (pilspets) (B) Procent av iMOP celler som uttrycker Cdkn1b över tröskelvärdet, från förökar (svart) och sensoriska epitel differentierade kulturer (röd). (C) Sammanslagen fluorescerande bild av sensoriska epitel differentierade iMOP celler märkta med Hoechst och Myo6 antikroppar. (D (E) Andel iMOP celler som uttrycker Cdkn1b från förökar (svart) och neuronala differentiering kulturer (röd). Individuella celler som används för analys betecknades i varje stapeldiagram. Resultaten sammanställts från olika experiment (n = 3) och felstaplar visas som SEM. Student-t-test användes för att bestämma den statistiska signifikansen. (F) Sammanslagen fluorescerande bild av bipolär eller pseudo-unipolär iMOP härrörande neuroner märkta med Hoechst och Tubb3. Längd skal barer är 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Cellodling Vessel | Surface Area (cm 2) | Antal Celler Seedade för Rutinunderhåll | Antal Celler Ympade för Sensorisk epitel differentiering | Antal Celler Seedade för neuronal differentiering | Skalning Faktor I förhållande till 60 mm skål | Volym Media Begagnade (ml) | |
| Multwell Plattor | |||||||
| 96 | 0,3 | 10 tusen | 20 tusen | 10,000-50,000 | 0,015 | 0,1 | |
| 24 | 2 | 90 tusen | 180 tusen | 100,000-150,000 | 0,100 | 0,5 | |
| 12 | 4 | 180 tusen | 360 tusen | 300,000 | 0,200 | 1 | |
| 6 | 10 | 500 tusen | 1.000.000 | 500,000-750,000 | 0,500 | 2 | |
| Disk | |||||||
| 35 mm | 10 | 500 tusen | 1.000.000 | 500 tusen | 0,500 | 2 | |
| 60 mm | 20 | 1.000.000 | 2.000.000 | 1,000,000-1,500,000 | 1,000 | 3 | |
| 100 mm | 60 | 2.500.000 | 5.000.000 | 2,500,000- 3.000.000 | 3,000 | 8 | |
Tabell 1. Cell Tal för Underhåll av Differentiering av IMOP celler i Various vävnadskulturplatta format.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Övervakning IMOP Kulturer
Ett protokoll för att upprätthålla självförnyelse och främja differentiering av en ny iMOP cellinje beskrivs och ytterligare plätering format ingår (tabell 1). Flera viktiga steg som hjälper till med rutin expansion och differentiering av iMOP celler noteras. I likhet med pluripotenta stamcellsodlingar, iMOP celler har teoretiskt en obestämd livslängd. För att säkerställa att cellinjer gott skick, är iMOP kulturer rutinmässigt övervakas för cellviabilitet, självförnyelse och differentiering potential. För att bestämma cellviabilitet efter dissociation använder vi trypanblått-färgning. I allmänhet, över 70% av cellerna är livsdugliga efter dissociation. För att övervaka självförnyelse i iMOP celler, immunfärgning med c-Myc och Sox2 antikroppar görs. Under proliferativa odlingsbetingelser, iMOP celler har en fördubblingstid av ~ 18 timmar. Förändringar i uttryck av självförnyelse markörer eller göraubling tid är potentiella indikatorer på förändrad självförnyelse. För övervakning av differentieringspotentialen för iMOP celler, cellcykel exit och expression av tidigt stadium markörer för sensorisk epitel- eller nervceller används för att utvärdera differentieringspotentialen av cellerna. Om iMOP celler inte passerar någon av de criterions som beskrivs ovan, skulle det vara lämpligt att avsluta kulturerna.
Variabler som påverkar IMOP kulturer
Ett kritiskt steg i odling iMOP celler är att upprätthålla en aktiv koncentration av bFGF i kulturerna för att främja självförnyelse. bFGF är enligt uppgift starkt labil vid 37 ° C när odling av celler 29,30. Tillväxten av kulturer kan påverkas väsentligt genom spontan differentiering på grund av bFGF instabilitet. I det nuvarande protokollet, är färskt medium kontinuerligt levereras till kulturerna för att bibehålla bFGF nivåer över 5 ng / ml. Stabilisering av bFGF nivåer med hjälp av kontrollerad frisättning frånglykol och mjölksyrapolyestermikrosfärer kan minska frekvensen av medie förändringar som behövs för att bibehålla stabila nivåer av bFGF i media 31. Tillsats av stadigt lösgör bFGF kommer att minska behovet av att ofta lägga till media för att upprätthålla bFGF nivåer i iMOP kulturer.
En annan avgörande steg för att upprätthålla livskraften i iMOP celler är att begränsa exponeringen för dissociation reagens och mekanisk skjuvning. I det nuvarande protokollet, är dissociation uppnås genom inkubation med 1 mM EDTA. Curbing driven inkubationstid med EDTA, minska överdriven mekanisk skjuvning som orsakas av kraftig pipettering och begränsa flera centrifugeringssteg vid passage iMOP celler hjälper till att öka cellernas livskraft. Uppmärksamhet ges till dessa steg kan effektivt upprätthålla under expansion av kulturer livskraft ett stort antal celler.
Under rutinmässig kultur av iMOP celler har flera metoder för att dissociera cellerna testas. Mechanical klippning från pipettering kan användas för att dissociera otospheres, men inte enhetligt eller konsekvent producera enskilda celler. Användning av kommersiellt tillgängliga reagens för cellulär dissociation av iMOP celler effektivt kan generera enstaka celler från otospheres, men dessa reagens påverkar de vidhäftande egenskaperna hos celler att reformera otospheres och att vidhäfta till behandlade ytor. För att kunna använda kommersiella reagens var flera tvättar krävs för att avlägsna de dissociation reagens före anställning differentieringsprotokoll.
I den aktuella differentieringsprotokoll, både sensoriska epitel och neuronal differentiering förhållanden resulterade i celldöd som observerades i form av enskilda celler eller klumpar av döda celler. Apoptotisk celldöd kan bero på avsaknaden av lämpliga differentiering eller överlevnad referenser under förlängd odling in vitro. Båda differentierings villkoren B27 tillägg för att främja överlevnad av celler. Fastän B27 supplement har visat att främja överlevnaden av primära hippocampusneuroner 32, kan det inte vara tillräckligt för att främja överlevnad iMOP celler. Tillsats av föreningar såsom ROCK-hämmare kan bidra till att upprätthålla och öka överlevnaden av iMOP celler under rutin kultur och in vitro differentiering. ROCK-inhibitor har i stor utsträckning använts i pluripotenta stamcellkulturer för att främja överlevnaden av celler i serumfria kulturer utan att påverka differentiering 33. Tillsats av ROCK-hämmare till odlingsmedier kan bidra till att öka cellöverlevnad under långa differentieringsprotokoll utan att påverka differentiering potential iMOP celler. Ökad cellöverlevnad kommer att möjliggöra utveckling av protokoll för att på ett effektivt sätt generera ett stort antal mogna hårceller eller SGNs.
Ökad Cdkn1b Uttryckning som en tidig markör av IMOP Differentiering
Under tidig Cochlear utveckling, den inledande händelse av cellcykel exit föregår differentieringen för hårcellerna, stödjande celler och SGNs 34. Terminal mitos av neuronala stamceller sprider sig i en våg med start från basen och framsteg mot toppen av snäckan 35. I en motsatt lutning, terminal mitos av prosensory stamceller som ger upphov till hårceller och stödjande celler går från spetsen till basen av cochlea 34,36. Även om tids uttryck för Cdkn1b korrelerar väl till den post-mitotiska tillstånd, är det sannolikt inte den enda faktorn som främjar cellcykel exit i utvecklings snäckan. Till stöd för detta, kan Cdkn1b muterade djur fortfarande utveckla post-mitotiska hårceller 37. Istället kan Cdkn1b användas som en tidig indikator för att markera starten av differentiering. I ostyrd iMOP differentiering kulturer, kommer en tidig markör för differentiering bidra till att utveckla protokoll för att främja tidiga stadier av differentiering innan kan observeras uppenbara morfologiska funktioner. </ p>
I likhet med öron utveckling initierar cykel exit differentiering och resulterar i ökade Cdkn1b nivåer i iMOP celler. I prolifererande iMOP celler kan observeras endast låg nivå uttryck för Cdkn1b. Andra cyklinberoende kinashämmare såsom Cdkn1a (p21 CIP) kan vara ansvarig för normal cellcykelprogression i iMOP celler. Under sensoriska epitel och neuronal differentiering av iMOP celler, avslöjade enda cell kvantitativ analys en delmängd av celler med ökad expression av Cdkn1b vid differentiering iMOP kulturer (figur 6A, C). Expression av Cdkn1b i dessa celler är en indikation på iMOP celler som genomgår terminal differentiering.
IMOP Celler som Cellular Platform för att studera Cell Fate Fastställande
Eftersom iMOP celler kan övergå från en stamfader tillstånd till olika otiska härstamningar in vitro, kan de användas för att studera otiska cellödebestämning. För närvarande används den beskrivna protokollet ostyrd differentiering förfaranden för att generera olika öroncelltyper. Det iMOP system möjliggör tillsats av bioaktiva molekyler, föreningar och definierade gener som styr iMOP celler mot den mogna hårceller, stödja cell och SGN linjerna. En användning av iMOP cellulära plattform är att testa för kandidat transkriptioner faktorer (TF) som främjar differentiering. Redovisning av nyckel TF kan användas för att driva hårceller eller neuronal differentiering. Expression av Cdkn1b tillsammans med etablerade markörer eller morfologiska särdrag hos hårceller och SGNs kan användas för att bestämma bidraget av kandidat TF: er till olika otiska härstamningar 38,39.
Kandidat TF såsom Atoh1 är viktiga för hår cellutveckling och har repurposed för att främja hår celldifferentiering i den skadade cochlea 40,41. Införande av Atoh1 i iMOP celler kan bidra till att främja hår celldifferentiering. I och utvecklings-ng cochlea, både Ngn1 och NeuroD1 krävs för korrekt SGN differentiering in vivo 42-44. Uttryck av Ngn1 eller NeuroD1 i iMOP celler kan främja SGN differentiering. Dessa experiment liknar generera inducerade neuronala celler (IN), där expression av TF: er individuellt eller i kombination kan omvandla fibroblaster eller pluripotenta stamceller till neuron 45-48. Införande av TF som normalt uttrycks under utvecklingen av hårceller eller SGNs är en bra strategi för att styra iMOP celler mot håret cellen eller SGN härstamning.
Förhållanden som främjar differentiering av ett stort antal iMOP härrörande hårceller och SGNs kommer att ge en robust cellulär plattform för sjukdom modellering, liten molekyl screening och toxikologi tester som kan utföras snabbt och kostnadseffektivt innan arbetsintensiva tester hos gnagare initieras . Det protokoll som beskrivits presenterar en enkel och mångsidigt system som kan utnyttjas för studying öron stamfader differentiering och är mottaglig för storskaliga experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CoolCell LX Alcohol-Free Cell Freezing Containers | BioCision | BCS-405 | |
| Cryogenic Vials (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1.5 Thickness Glass Coverslip (Round 12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Stored as 1 ml aliquots |
| L-Glutamine(200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Stored as 5 ml aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Stored as 1 mg/ml aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Cryopreservation Media | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Moxi Z Mini Automated Cell Counter | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Cassette Type S | Orflo | MXC002 | |
| Recombinant Murine Fibroblast Growth Factor, basic (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspended in 0.1% BSA in H20 and stored as 20 mg/ml aliquots |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7886 | Resuspended in 1X PBS and stored as 10 mg/ml 100 µl aliquots |
| Carbenicillin, Disodium Salt | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspended in 10 mM Hepes pH 7.4 and stored as 100 mg/ml aliquots |
| 5 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml pipet individually wrapped paperback (200/case) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Tissue Culture Treated Biolite 24-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Tissue Culture Treated Biolite 6-Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Tissue Culture Treated 6 cm Dish | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterile Syringe PVDF Filter Pore size: 0.22 μm | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne filter pipet tips 0.1 - 10 μl elongated filter tip | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 20 μl filter tip | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne filter pipet tips 1 - 200 μl filter tip | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne filter pipet tips 101 - 1000 μl filter tip | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml conical tubes sterile 20 bags of 25 tubes (500 tubes) | USA Scientific | 1500-1211 |
References
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary' noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Huth, M. E., Ricci, A. J., Cheng, A. G. Mechanisms of aminoglycoside ototoxicity and targets of hair cell protection. Int J Otolaryngol. 2011, 937861-93 (2011).
- Brigande, J. V., Heller, S. Quo vadis, hair cell regeneration? Nat Neurosci. 12 (6), 679-685 (2009).
- Groves, A. K. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood). 235 (4), 434-446 (2010).
- Okano, T., Kelley, M. W. Stem cell therapy for the inner ear: recent advances and future directions. Trends Amplif. 16 (1), 4-18 (2012).
- Ronaghi, M., Nasr, M., Heller, S. Concise review: Inner ear stem cells--an oxymoron, but why? Stem Cells. 30 (1), 69-74 (2012).
- Chen, W., et al. Restoration of auditory evoked responses by human ES-cell-derived otic progenitors. Nature. 490 (7419), 278-282 (2012).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. , (2013).
- Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).
- Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features. J Assoc Res Otolaryngol. 10 (2), 173-190 (2009).
- Doetzlhofer, A., White, P., Lee, Y. S., Groves, A., Segil, N. Prospective identification and purification of hair cell and supporting cell progenitors from the embryonic cochlea. Brain Res. 1091 (1), 282-288 (2006).
- Doetzlhofer, A., White, P. M., Johnson, J. E., Segil, N., Groves, A. K. In vitro growth and differentiation of mammalian sensory hair cell progenitors: a requirement for EGF and periotic mesenchyme. Dev Biol. 272 (2), 432-447 (2004).
- Martinez-Monedero, R., Yi, E., Oshima, K., Glowatzki, E., Edge, A. S. Differentiation of inner ear stem cells to functional sensory neurons. Dev Neurobiol. 68 (5), 669-684 (2008).
- Oshima, K., Senn, P., Heller, S. Isolation of sphere-forming stem cells from the mouse inner ear. Methods Mol Biol. 493, 141-162 (2009).
- Nishimura, K., Nakagawa, T., Sakamoto, T., Ito, J. Fates of murine pluripotent stem cell-derived neural progenitors following transplantation into mouse cochleae. Cell Transplant. 21 (4), 763-771 (2012).
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409 (2012).
- Jiang, H., et al. Lineage analysis of the late otocyst stage mouse inner ear by transuterine microinjection of a retroviral vector encoding alkaline phosphatase and an oligonucleotide library. PLoS One. 8 (7), e69314 (2013).
- Sapede, D., Dyballa, S., Pujades, C. Cell lineage analysis reveals three different progenitor pools for neurosensory elements in the otic vesicle. J Neurosci. 32 (46), 16424-16434 (2012).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132 (7), 1687-1697 (2005).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134 (24), 4405-4415 (2007).
- Neves, J., Parada, C., Chamizo, M., Giraldez, F. Jagged 1 regulates the restriction of Sox2 expression in the developing chicken inner ear: a mechanism for sensory organ specification. Development. 138 (4), 735-744 (2011).
- Mak, A. C., Szeto, I. Y., Fritzsch, B., Cheah, K. S. Differential and overlapping expression pattern of SOX2 and SOX9 in inner ear development. Gene Expr Patterns. 9 (6), 444-453 (2009).
- Kiernan, A. E., et al. Sox2 is required for sensory organ development in the mammalian inner ear. Nature. 434 (7036), 1031-1035 (2005).
- Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing mammalian cochlea. J Neurosci. 30 (2), 714-722 (2010).
- Kwan, K. Y., Shen, J., Corey, D. P. C-MYC transcriptionally amplifies SOX2 target genes to regulate self-renewal in multipotent otic progenitor cells. Stem Cell Reports. 4 (1), 47-60 (2015).
- Dittami, G. M., Sethi, M., Rabbitt, R. D., Ayliffe, H. E. Determination of mammalian cell counts, cell size and cell health using the Moxi Z mini automated cell counter. J Vis Exp. (64), (2012).
- Levenstein, M. E., et al. Basic fibroblast growth factor support of human embryonic stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (3), 568-574 (2006).
- Furue, M. K., et al. Heparin promotes the growth of human embryonic stem cells in a defined serum-free medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (36), 13409-13414 (2008).
- Lotz, S., et al. Sustained levels of FGF2 maintain undifferentiated stem cell cultures with biweekly feeding. PLoS One. 8 (2), e56289 (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ruben, R. J. Development of the inner ear of the mouse: a radioautographic study of terminal mitoses. Acta Otolaryngol. , Suppl 220. 1-44 (1967).
- Matei, V., et al. Smaller inner ear sensory epithelia in Neurog 1 null mice are related to earlier hair cell cycle exit. Dev Dyn. 234 (3), 633-650 (2005).
- Lee, Y. S., Liu, F., Segil, N. A morphogenetic wave of p27Kip1 transcription directs cell cycle exit during organ of Corti development. Development. 133 (15), 2817-2826 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. 126 (8), 1581-1590 (1999).
- Hasson, T., et al. Unconventional myosins in inner-ear sensory epithelia. J Cell Biol. 137 (6), 1287-1307 (1997).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, 33 (2011).
- Bermingham, N. A., et al. Math1: an essential gene for the generation of inner ear hair cells. Science. 284 (5421), 1837-1841 (1999).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Kim, W. Y., et al. NeuroD-null mice are deaf due to a severe loss of the inner ear sensory neurons during development. Development. 128 (3), 417-426 (2001).
- Liu, M., et al. Essential role of BETA2/NeuroD1 in development of the vestibular and auditory systems. Genes Dev. 14 (22), 2839-2854 (2000).
- Ma, Q., Anderson, D. J., Fritzsch, B. Neurogenin 1 null mutant ears develop fewer, morphologically normal hair cells in smaller sensory epithelia devoid of innervation. J Assoc Res Otolaryngol. 1 (2), 129-143 (2000).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Blanchard, J. W., et al. Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons. Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).
