Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

תנועת פרוקי רגלי ניטור נדרשה לעתים קרובות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה הקשורים האוכלוסייה, דפוסי פיזור, העדפות צמח מארח, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות. פרוקי רגליים בדרך כלל במעקב בטבע על ידי תיוגם עם סימן ייחודי ולאחר מכן לאורך זמן ובמרחבם כדי לקבוע את יכולות פיזורם באיסוף מחדש. בנוסף לתגים פיזיים ממשיים, כגון אבק או צבע צבעוניים, סוגים שונים של חלבונים הוכחו כיעילות מאוד לסימון פרוקי רגליים למחקר אקולוגי. יכולים להינתן חלבונים פנימיים ו / או חיצוני. אז יכולים להיות שזוהו החלבונים על פרוקי רגליים וכבשו עם assay חלבון ספציפי צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחוץ וכלפי פן תיוג פרוקי רגליים עם חלבון. שתי דוגמאות ניסיוניות פשוטות הם הפגינו: (1) סימן חלבון פנימי הציג לחרקים על ידי מתן תזונה מועשר בחלבון ו- (2) סימן חלבון חיצוני topicallypplied לחרקים באמצעות nebulizer רפואי. לאחר מכן, אנו מתייחסים מדריך צעד-אחר-צעד של הכריך ושיטות ELISA עקיפים משמשות לאיתור סימני חלבון בחרקים. בהפגנה זו, היבטים שונים של הרכישה והגילוי של סמני חלבון על פרוקי רגליים לסימן-שחרור-לכבוש מחדש, סימן-ללכוד, וסוגים-סימן-לכידה העצמית של מחקר הם דנו, יחד עם הדרכים השונות כי הליך immunomarking היה מותאם כך שיתאים למגוון רחב של מטרות מחקר.

Introduction

מעקב התנועה של מזיקי פרוקי רגליים, אויבים טבעיים (טפילים וטורפים), ומאביקים בטבע הוא חיוני להבנה טובה יותר כיצד לשפר את שירותי מערכת אקולוגית. המרכיב המרכזי במרבית הסוגים של מחקר הוא שיש פיזור שיטה אמינה כדי לתייג את פרוקי הרגליים (ים) של עניין. מגוון רחב של חומרים (לדוגמא, צבעים, צבעים, אבקות צבעוניות, תגים, אלמנטים נדירים, חלבונים) שימשו כדי לסמן פרוקי רגליים להעריך דינמיקת האוכלוסייה שלהם, יכולות פיזור, האכלת התנהגויות, ואינטראקציות אקולוגיות אחרות 1,2.

נאותות סמן המשמש לכל מחקר פיזור נתון תהיה תלויים בסוג של מחקר שנערך. ישנם שלושה סיווגים רחבים לסימון פרוקי רגליים: (1) סימן-שחרור-לכבוש מחדש (MRR), (2) סימן-ללכוד, ו- (3) סימן-לכידה עצמית. למחקר סימן-שחרור-לכבוש מחדש, החוקר בדרך כלל מסמן את פרוקי הרגליים קולקטיבי בlaboratoר"י ומשחרר אותם בנקודה מרכזית בתחום. אז פרוקי רגליהם כבשו במרווחי מרחב ובזמן שונים באמצעות מכשירי אוסף שונים (בניכוי למשל, לטאטא, ואקום, מלכודת דביקה) 3,4,5. אז הדגימות כבשו נבחנות לסימן הספציפי להבחין שוחררו מאנשים מקומיים. למחקר סימן-ללכוד, החוקר בדרך כלל חל הסימן ישירות בציוד השדה באמצעות תרסיס (למשל, מרסס תרמיל, בום ומרסס זרבובית). הסמנים הטובים ביותר עבור מחקר סימן-לכידה זולים ובקלות להחיל בית הגידול של פרוקי הרגליים. למחקר-סימן-לכידה עצמית, החוקר בדרך כלל חל סימנים לכניסה פיתיון פרוקי רגליים 6,7 או 8 קן. בתורו, פרוקי הרגליים מסמנת את עצמו באופן פנימי על ידי טורף את הפיתיון המסומן או חיצוני על ידי "צחצוח" נגד סימן יציאתו לקן.

כפי שצוין לעיל, סוגים רבים של סמנים היואד לתייג מגוון מיני פרוקי רגליים. עם זאת, מעט מאוד שימושיים לכל שלושת קטגוריות מחקר פיזור אלה. הפיתוח של הליך immunomarking החלבון היה פריצת דרך משמעותית עבור סימון חרקים. Immunomarking מעמיד תווית חלבון על פרוקי רגליים פנימיים או חיצוני אשר, בתורו, הוא זוהה על ידי assay נגד חלבון מסוים צמוד אנזים immunosorbent (ELISA). סמני החלבון הראשונים מסוג המשמשים היו אימונוגלובולינים ארנב (IgG) וIgG עוף / IgY 9,10. הם הוכיחו להיות יעילים מאוד סימנים לMRR ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון). למרבה הצער, חלבוני IgG / IgY הם יקרים ולכן אינם מעשיים למחקר סימן-לכידה ורוב הסוגים של מחקר-סימן-לכידה עצמית. בהמשך לכך, ELISAs זיהוי חלבון הדור השני פותחו עבור חלבונים כלולים בחלבוני ביצת עוף (אלבומין), חלב פרה (קזאין) וחלב סויה (חלבון מעכב טריפסין). כל assay הוא רגיש מאוד, ספציפי, והכיחשוב מכך, משתמש בחלבונים שהם הרבה פחות יקרים מאשר חלבוני IgG / IgY 11. חלבונים אלה הוכחו כיעילים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקר-סימן-לכידה עצמית (ראה דיון).

במאמר זה, אנו מתארים ומדגימים כיצד לבצע מחקרי שימור המעבדה סימן חלבון. מחקרים כאלה הם השלב הראשון של המחקר הדרוש לכל סוג של מחקר פיזור שדה. באופן ספציפי, זה קריטי, כי חוקרים יודעים כמה זמן הסימן יישמר על מיני פרוקי רגליים הממוקדים לפני היציאה ללימודי פיזור שדה. כאן אנו מתארים ומדגימים כיצד פנימיים והן חיצוניים כדי לסמן חרקים לMRR, סימן-ללכוד, ומחקרי שדה הסוג-סימן-לכידה עצמית. לאחר מכן, אנו מדגימים כיצד לזהות הנוכחות של הסימנים עם ELISAs העקיף וכריך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפנימי מארק, שמירה, וזיהוי נוהל

  1. הליך סימון פנימי
    1. לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100 אנשים) ממושבת מעבדה גדלה על דיאטה מלאכותית או מהשטח ולחלק לשתי מכולות גידול נקיות.
    2. מניחים מנות רגילות 20 מיליליטר דיאטה (טיפול ביקורת שלילי לא מסומן) לאחת מהמכולות. להשלים מנה שנייה 20 מיליליטר מלאכותית דיאטה עם 1.0 מיליליטר של 1.0 מ"ג / מיליליטר IgG עוף / פתרון IgY, ומערבב היטב, ומניח אותו במכל האחר.
      הערה: אם החרק של עניין אין דיאטה מלאכותית, הסימן יכול להיות ממוקם באו בכל דיאטה שהם בדרך כלל נגרמו על (למשל, שעועית ירוקה, ביצי עש, מים, סוכר, דבש).
    3. לאפשר החרקים לחדש פעילות ההאכלה שלהם למשך 24 שעות.
  2. הליך שימור סימן פנימי
    1. הסר את מנות דיאטה מכל מכולה ולספק את החרקים wה- i אחר מקור מזון כדי לקיים אותם על משך הניסוי (למשל, שעועית ירוקה).
    2. לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים יומיים (או בכל פרק זמן רצוי) מכל טיפול ולהקפיא מייד ב -20 ° C.
  3. הליך ELISA כריך
    1. הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד עוף IgY העיקרי בדילול 1: 500 בטריס שנאגרו מלוח (TBS) היטב בכל microplate ELISA נקי ודגירה למינימום של שעה 1 ב RT (הערה: O microplates גם יכול להיות מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס).
    2. מחק את הנוגדן מהצלחת ולחסום כל טוב עם 300 μl של פתרון חלב יבש ללא שומן 1.0% למשך 30 דקות.
    3. בזמן ההמתנה לצעדי דגירה הקודמים, למקם את החרקים קפוא בנפרד ב1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge עם 1.0 מיליליטר של TBS.
    4. טוחנים כל חרקים עם העלי נקי עד הומוגני ביסודיות ולהוסיף של כל דגימה 100 μl ולבודד של ELISAצַלַחַת. אפשר הדגימות כדי לדגור על RT עבור שעה 1.
    5. להוסיף לשלילי (TBS בלבד) וחיוביים 100 μl (חלבוני ביצה בTBS) בקרות לבארות בעמודה הראשונה של כל צלחת ELISA. כמו כן, להוסיף בקרות חרקים שליליות (חרקים לא מסומנים) 100 μl לבארות 8 בטור האחרון של כל צלחת (איור 1). אפשר דגימות השליטה כדי לדגור על RT עבור שעה 1. שים לב שהתבנית הניתנת באיור 1 היא התבנית אנו משתמשים למבחנים הסטנדרטיים שלנו. המיקום של הדגימות בבארות הוא לשיקול דעתו של החוקר.
    6. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם מי מלח פוספט (PBS) -tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG אנטי-עוף ארנב / IgY מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: פתרון חלב 10,000 ב 1% ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
    7. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של tetramethylbenzidine מצע (TMB) זה טוב.
    8. לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארותעם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר.

איור 1
איור 1. תרשים סכמטי המציג את הכינויים גם תקניים המשמשים ל96 טיפוסי גם microplate ELISA. כל צלחת מכילה 7 בארות מוקדשים לבקרה שלילית שנאגרו מלוחה-טריס (TBS), גם ייעודיות לשליטת חלבון חיובית (POS Ctrl), 80 בארות בודדות מוקדשת לחרקים כבשו מחדש (לדוגמא 1 ... 80), ו -8 בארות מוקדשים לבקרת חרקים לא מסומן (שלילית) (נג Ctrl 1 ... 8). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. החיצוני מארק, שמירה, וזיהוי נוהל

  1. הליך סימון חיצוני
    1. לאסוף חרקים של עניין (n ≈ 100יחידים) ממושבת מעבדה או מהשטח והמקום לשני מיכלי פלסטיק 1.0 L עם חור בקוטר 2.5 סנטימטר אגרוף מהצד השני של כל מכולה.
    2. ריסוס החרקים במכל הראשון עם 1.0 מיליליטר של DH 2 O (טיפול בקרה שלילי) באמצעות nebulizer רפואי. ריסוס החרקים במכל השני עם 1.0 מיליליטר של פתרון 5.0% מחלבוני ביצת עוף באמצעות nebulizer רפואי.
    3. צרף את הצינור של nebulizer לשקע אוויר מעבדה סטנדרטי ולאחר מכן הכנס את הפה של nebulizer לתוך חור 2.5 סנטימטר של המכל. לאחר מכן, להפעיל את יציאת האוויר בהדרגה עד nebulizer מייצר אדים.
    4. המשך ריסוס (סימון) עד פתרון חלבוני ביצה כבר לוותר (כ. 2-5 דקות).
    5. הסר את nebulizer ולמקם את פקק לתוך החור של מיכל הפלסטיק. לאפשר החרקים לעמוד על RT עד הפתרון התייבש לחלוטין.
  2. הליך שימור סימן חיצוני
    1. מניחים כל טיפול בחרקים היבש לתוך מיכל נפרד גידול נקי, כדי למנוע חשיפה נוספת לסימן.
    2. להוסיף מזון ומים למכל הנקי כדי לקיים את החרקים על משך המחקר.
    3. לאסוף עוקבה (n = 20) של חרקים מכל טיפול היומי ולהקפיא מייד ב -20 ° C.
  3. הליך ELISA עקיף
    1. מניחים את החרקים הקפואים בנפרד לתוך 1.6 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1.0 מיליליטר של TBS.
    2. משרים את הדגימות עבור שעה 1 בסט ייקר מסלולית ב 120 סל"ד.
    3. להוסיף בקרות שליליות וחיוביות כמתואר בשלב 1.3.5.
    4. לאחר ההשריה, פיפטה aliquot 100 μl מכל מדגם לאחד 80 בארות מדגם ייעודיות ובצלחת ELISA חדשה 96 כפי שמוצג באיור 1 אפשר הדגימות כדי לדגור במשך שעה 1 ב RT (הערה:. Microplates יכול להיות גם O מודגרות / N ב 4 מעלות צלזיוס).
    5. לשטוף את הבארות שלוש פעמים עםPBS-tween ולאחר מכן להוסיף 300 μl של נאגר מלוח פוספט המכיל 1% אלבומין בסרום שור (PBS-BSA) זה טוב.
    6. לאחר 30 דקות ב RT לשטוף פעמיים עם PBS-tween.
    7. הוסף 50 μl של נוגדן ארנב נגד ביצת אלבומין העיקרי בדילול 1: 8,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) לכל היטב דגירה עבור שעה 1 ב RT.
    8. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולאחר מכן להוסיף 50 μl של IgG נגד הארנב העז מצומדות עם peroxidase חזרת דילול 1: 2,000 ב PBS-BSA-Silwet (0.05%) במשך שעה 1 ב RT.
    9. לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם PBS-tween ולהוסיף 50 μl של מצע TMB היטב כל אחד.
    10. לאחר 10 דקות, לקרוא את הבארות עם ספקטרופוטומטר microplate להגדיר באורך גל של 650 ננומטר.

ניתוח 3. נתונים

  1. לחשב את הערך הממוצע של ספיגת 8 החרקים ביקורת השליליים על כל צלחת ELISA ולאחר מכן לחשב את סטיית התקן בהתבסס על הפקדים השליליים נקוו הלוך ושובכל צלחות ELISA של מחקר ניתנו 12 מ '.
  2. להוסיף שש פעמים סטיית תקן ונקווה לממוצע המתקבל לכל צלחת ELISA להשיג ערך סף חיובי ELISA. כל מדגם חרקים מניב ערך הספיגה שווה או גדול מהערך הזה נחשב כחיובי לנוכחות של סימן החלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פנימי לציון:

תוצאות בדיקת שימור סימן הפנימית מוצגות באיור 2 א. ערך הסף המחושב ELISA הקריטי היה 0.054. בסך הכל (כל ארבעת תאריכי המדגם משולבים), החרקים טופלו ללא חלבון הניבו ערכים נמוכים באופן עקבי ELISA (x = 0.038 ± 0.002, n = 80). לעומת זאת, כל החרקים האכילו את הדיאטה העשירה החלבון הניבה ערכים חזקים באופן עקבי ELISA (x = .475 ± 0.221, n = 80).

חיצוני לציון:

תוצאות בדיקת שימור סימן החיצונית מוצגות באיור 2. ערך הסף המחושב ELISA הקריטי היה 0.082. בסך הכל, החרקים מריחה מסומנים במים רק הניבו ELI הנמוך באופן עקביערכי SA (x = .048 ± 0.007, n = 80). לעומת זאת, כל החרקים מריחה מסומנים בפתרון החלבונים הניבו ערכים חזקים באופן עקבי ELISA (x = .746 ± 0.232, n = 80).

איור 2
איור 2. ממוצע (± סטיית תקן) ELISA ערכי צפיפות אופטיים של חרקים () המסומנים באופן פנימי עם IgY עוף וחרקים (B) המסומנים באופן חיצוני עם חלבוני ביצת עוף (אלבומין). פסים שחורים הם הערכים הממוצעים ± ELISA SD הצפיפות אופטית הניבו ידי חרקים לא מסומנים. גודל מדגם חרקים עבור כל טיפול חלבון יומי היה 20 אנשים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הליך immunomarking חלבון פרוקי רגליים תואר לראשונה כמעט רבע מאה לפני 9. מאז, ההליך הותאם ללמוד את דפוסי הפיזור של מגוון רחב של פרוקי רגליים באמצעות IgG / IgYs מנוהל פנימי וחיצוני. חלבונים אלה הוכיחו סמנים איתנים למגוון הרחב של מיני חרקים נבדקו עד כה. עם זאת, כאמור לעיל, המגבלה העיקרית לשימוש בIgG / IgYs היא שהם יקרים מאוד. כתוצאה מכך, IgG / IgYs הם שימושי רק עבור MRR ומחקרי סוג סימון עצמי שבו קבוצות גדולות של חרקים יכולות להיות מסומנות בחלל קטן או יכולים להיות משולבות הסימנים לדיאטה או פיתיון. הנה, סיפקנו הדגמה פשוטה כיצד סימן פנימי יכול להיות מנוהל על ידי האכלת יעד החרקים דיאטה מלאכותית מועשרת בIgG העוף / IgY. בתורו, IgG / IgY זוהה באמצעות כריך ELISA. מערכת זו עשויה להיות יתרון במיוחד לחוקרים שכבר משתמשיםדיאטה המכילה ביצי תרנגולת מאז assay באופן טבעי לזהות את IgG / IgY מצא בביצים. בנוסף, כמויות קטנות של חלבון IgG / IgY של יכולות להיות מנוהלות topically לחרקים באמצעות nebulizer הרפואי שתואר לעיל (איור 3 א). Nebulizer שימש לראשונה לטפילי סימן המוני מאוד עדינים וזעירים עם IgG ארנב לסוג MRR מחקר 3. מאז, בשיטות אחרות כבר משמשות לניהול סימני IgG / IgY לפרוקי רגליים למחקר פיזור. לדוגמא, מרסס בושם נעשה שימוש כדי להחיל סימני IgG / IgY על מינים טפילים אחרים 13,14. אחרים פנימיים מסומנים חרקים שונים על ידי האכלה להם (כלומר, סימון העצמי) IgG ארנב מים דבש או סוכר 14,15 כותרת 16 (איור 3). לבסוף, בייקר ואח '. 7 קרטון הפד לטרמיטים שנכנס להריון עם הארנב IgG (איור 3 ג). טרמיטים אלה בקלות מסומן עצמי כפי שהם בלעו את האוכל התגרההחומר.

איור 3
איור 3. שיטות שונות המשמשות לניהול סימן חלבון: (א) טפילים עדינים להיות מסומנים עם IgY עוף באמצעות nebulizer רפואי, (ב) טפיל האכלה על פתרון דבש מועשר IgG ארנב, (ג) טרמיטי האכלה על קרטון מועשר IgG ארנב פיתיון, דבורים (ד ') דבש עצמי לציון עם חלב יבש כפי שהם עוברים מכשיר לאבק שהוצב בכניסה של כוורת, (E) חרקים מקומיים להיות מסומנים עם חלב בשדה כותנה באמצעות אסדת תרסיס טרקטור קונבנציונלית, (F ) חרקים מקומיים להיות מסומנים עם חלבוני ביצת עוף עם מכשיר בום ותרסיס זרבובית רכוב על גבי טרקטורון, (G) חרקים מקומיים ברצועה של אספסת להיות מסומן עם חלבוני ביצת עוף עם גבמכשיר חבילת ספריי, ו( ​​H, I) חרקים מקומיים באספסת להיות מסומנים עם חלבוני ביצת עוף באמצעות החלת אוויר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חלבוני IgG / IgY לא רק שימשו ללימוד פיזור חרקים. הם גם היו בשימוש למעקב אחר קישורים טרופיים בשרשרת מזון פרוקי רגליים. Hagler וDurand 17 הציעו לראשונה את הרעיון של סימון טרף עם IgG / IgY ו, בתורו, ניהול תוכן IgG / IgY ספציפי בטן כריך ELISA על טורפים שצרכו את הטרף המסומן. טכניקה זו לאחרונה צברה פופולריות בקרב חוקרי ניתוח הבטן כי זה פחות מייגע ויקר מאשר ביצוע תגובת ELISA או שרשרת של פולימראז טרף ספציפי (PCR) הקלד ניתוחי תוכן מעי מולקולריים (ראה Hagler 18 ופורנייה et al. 19 לביקורות של היתרונות וחסרונות של דואר טכניקות assay הבטן השונות). בעשור האחרון, טכניקת immunomarking הטרף נעשתה שימוש כדי לזהות פעילות האכלת טורפי כותנה במזיקי ארנב-מסומן IgG 18,20,21, trophallaxis ויחסי האכלה במושבות טרמיטים באמצעות ארנב שטופל IgG מקור מזון נייר 22, granivory של מכלול פרוקי רגליים על זרעי עשבים פולשניים שן הארי מסומן עם הארנב IgG 23, מסריח שיעורי באג טריפת hornworms עגבניות מסומנות IgG נאספו בחלקות נתון לטיפולים שונים semiochemical 24, ופעילות הדחה טורף על פגרים מסומנים IgY IgG / 25.

דור שני של ELISAs העקיף זיהוי החלבון פותחו כמעט לפני עשור. ELISAs אלה תוכננו במיוחד כדי לזהות חלבונים המצויים במוצרי מזון "מהמדף", כגון חלבון אלבומין ביצה בחלבוני ביצת עוף, חלבון סויה מעכבי טריפסין בחלב סויה, וחלבון קזאיןבחלב בקר. Immunomarkers חלבון הדור השני הוכיח שימושי לMRR, סימן-לכידה ומחקר סוג סימן עצמי. לדוגמא, ארווין et al. 26 הראה שזה היה אפשרי לסמן מריחת טפילים עדינים עם חלבונים מחוץ למדף אלה. יתר על כן, Hagler et al. 8,27 הראה כי דבורי דבש אפשר לסמן עצמי עם אבקות יבשות ביצה לבנה וחלב שור יציאתם דרך מתקן חלבון שהוצב בכניסה של כוורת (איור 3D). אולי השימוש יצירתי ביותר של חלבון סימון מעורב מיקוד טופח פרה עם חלבונים באמצעות מרסס סילון 28. בתורו, מבוגרים פנים לטוס רכשו סימן עצמי כפי שהם יצאו משלב גלמים שלהם ויצאו מהטפיחה פרה.

המאפיין החשוב ביותר של immunomarkers חלבון הדור השני הוא שהם זמינים בכמויות המוניות ובכל חלק של העלות של חלבוני IgG / IgY 11. יש תכונה זו revolutionized דרך מחקר סוג הסימן-לכידת אזור רחב מתנהל. באופן ספציפי, עכשיו יש לי חוקרי שיטה אמינה לפרוקי רגלי תג במהירות ובאופן אחיד על פני שטחים נרחבים בתחום תוך שימוש במגוון רחב של ציוד אסדת תרסיס קונבנציונלי (איור 3E). לדוגמא, חרקים מזיקים סומנו ישירות בפרדסים ושדות באמצעות מתזים יד אקדח נייד סוג 29,30, מתזים airblast מונע טרקטור 31,32, ומתזים החלקה 33. הורטון et al. 34 משמשים מכשיר חשמלי תרסיס רכוב על רכב השטח כדי לאתר יישומים של חלבונים לחרקים הכובשים גידולי כיסוי משובצים במטע אגסים (איור 3F). באופן דומה, Swezey et al. 5,35 משמש מרסס תרמיל ליישם יישומים מדויקים של חלבוני ביצת עוף לשורות של יבול מלכודת אספסת (צמח מארח מועדף) משובצים בשדה תות אורגני לציון מזיקים ואויביו הטבעיים ( et al. 36 מיושם יישום שידור של חלב בקר וביצה לבנה עד 29 ו -16 דונם של אספסת פורחת, בהתאמה (איור 3H, אני). מטרת מחקר זה הייתה לציון פרוקי הרגליים התושב באספסת, ולאחר מכן, לאחר האספסת הייתה שנקטפו על ידי כיסוח (וגרם לאירוע פיזור), כדי לעקוב אחר דפוסי הפיזור של פרוקי הרגליים לשדות כותנה סמוכים (יבול רגיש מיני מזיקים).

חלק מהמשתמשים של הליך סימן-ללכוד הדור השני שינו את ההליך המקורי במידה מסוימת כדי לענות על הצרכים הספציפיים של המחקר שלהם. סוג הגוף והגודל של tהוא ממוקד חרקים, יחד עם המאפיינים התנהגותיים שלה, יכתיב את הנפח וריכוז של סימן דרוש וכיצד הסימן מנוהל 37. יתר על כן, השיטה המשמשת לשחזר חרקים בתחום תהיה תלויה בגורמים אלה. עד כה, המשמשת כמעט בכל שיטה (לדוגמא, מלכודות דביקות, רשתות לטאטא, שואבי אבק) כדי לאסוף חרקים שמשו בהצלחה לאסוף חרקים מסומנים 3,5,8,11,29,31,32,35,38. עם זאת, בשל הרגישות הקיצונית של ELISAs זיהוי החלבון, אנו מדגישים כי יש לנקוט בזהירות רבה על מנת להבטיח כי דגימות לא מסומנות לא להיות מזוהמות בתהליכי האיסוף או מיון 38.

המחקר המקורי 11 שתיאר את הדור השני של מערכות חלבון לציון (כלומר, אלבומין ביצה, קזאין חלב, ומעכבי טריפסין הסויה) דיווח גורמים המשפיעים על רגישות assay עשוי להשתנות בין הסוגים של סמן. באופן ספציפי, הם הראו כי DIFמקורות ferent מים, תוספים (שטח), ואפילו הסוג של צלחת ELISA השתמשו מושפעים (חיובי או שלילי) assay. יתר על כן, כי המחקר ומחקרים עוקבים 37,39,40 הראו כי מבחני איתור סימן שלושה חלבון להשתנות ביעילות. הסמן הלבן הביצה נשמר זמן רב יותר מאשר את סמן חלב, שנשמר זמן רב יותר מאשר סמן חלב סויה. תוצאות אלו מדגישות את החשיבות של שימור סימן חלבון בדיקות על כל חרק שניתן לפני היציאה לשדה מחקר. כמו כן, ELISAs העקיף אלה הדור השני לפעמים להראות רמה נמוכה של רעש רקע עם סוגים מסוימים של חרקים (למשל, אוכלי עשב) (מצו. הערה). רעש רקע זה יכול להיות מופחת על ידי הוספה של מי חמצן 100 μl היטב בכל צלחת ELISA למשך 30 דקות בין שלב 2.3.4 והשלב 2.3.5 בפרוטוקול לעיל (. נתונים unpubl).

יש לציין כי ELISAs העקיף משמש לאיתור סימני חלבון הדור השניהם יעילים מאוד באיתור החלבון על חרקים ספוגים במאגר המדגם. עם זאת, ELISAs העקיף אינו יעיל כמו הכריך ELISA באיתור סימני חלבון פנימיים או חלבוני טרף בחרקים. מחקרים הראו כי ELISAs העקיף אינו יעיל כמו ELISAs כריך באיתור חלבון בדגימות של חרקים הומוגני 34,41.

גורם חשוב לשקול עם כל ELISA הוא כי ההליך לעתים קרובות מראה צלחת לצלחת (מיוחסת בעיקר להשפעות היום-היום של ריצת assay) 42,43 שונות. לכן, זה הכרחי כי כל צלחת ELISA כוללת: בקרות רק שליליות (1) אחד או יותר TBS, (2) TBS אחד או יותר + פקדים טהורים חלבון חיוביים, ו- (3) לפחות שמונה בקרות חרקים שליליות (כלומר, אנשים ידועים לא להכיל סימן חלבון). TBS בלבד, חלבון TBS +, ובקרות שליליות חרקים להבטיח שהמאגר הוא לא מקור של שגיאה, ריאגנטים פועלים כראוי,nd שאין כל חלבונים בחרק שחוצים להגיב עם חומרים כימיים ELISA, בהתאמה. יתר על כן, הבקרות השליליות חרקים חיוניות לחישוב ערכי סף ELISA (ראה להלן). עיצוב הצלחת מוצג בהפגנה זו כלל 7 כדורי סרק TBS, חלבון 1 + שליטה חיובית TBS (בעמודה הראשונה) ושמונה בקרות שליליות (בעמודה האחרונה) על כל צלחת ELISA (איור 1).

גורם חשוב נוסף שיש לשקול בעת הטיפול בנתוני ELISA הוא לקבוע ערך סף להבקיע חרקים לנוכחות או עדר של סימן חלבון. השיטה המוצעת במקור על ידי Stimmann 44 לפינה רחוקה חרקים-מסומן רובידיום הוגדרה כרמה הממוצעת של סמן בבריכה של חרקים מסומנים בתוספת שלוש פעמים סטיית התקן של אנשים לא מסומנים. שיטה זו שימשה גם כשיטת הקונבנציונלית לפינה רחוקה חרקים לנוכחות של סימני חלבון 9,17. עם זאת, בחלק CASes, חוקרים באופן אינטואיטיבי שנבחרו ערכי סף שמרניים יותר כדי להפחית את הסיכוי להשגת תוצאות חיוביות שגויות. השיטה הקלה ביותר היא פשוט להוסיף ארבעה עד שש סטיות תקן לממוצע של הבקרות השליליות במקום שלוש 18,34. שיטה מתוחכמת יותר כדי להפחית את הסיכוי להשגת תוצאות חיוביות שגויות נוסף הוצעה על ידי et al Sivakoff. 12. שיטה זו כרוכה בחישוב הערך הממוצע של ספיגת שמונה החרקים ביקורת השליליים על כל צלחת ELISA ולאחר מכן חישוב סטיית התקן בהתבסס על הפקדים שליליים נקוו מכל צלחות ELISA של מחקר נתון.

לסיכום, שיטה אמינה לתייג פרוקי רגליים היא קריטית להצלחה של רוב מחקרי פיזור. שיטות שונות שימשו לציון פרוקי רגליים עם חלבונים בשני העשורים האחרונים. immunomarking חלבון וזיהוי של הסימנים קלים יחסית ולא יקרים ומאוד להתאמה למספר עצום של יםtudies. משתמשים עתידיים של טכניקת immunomarking צריכים להבטיח שהמתודולוגיה שלהם היא מתאימה לפרטים של המחקר שלהם. הריכוז והנפח של הסימן דרוש וכיצד הסימן מיושם יהיו תלוי בגורמים כמו התנהגות, מבנה גוף וגודל של מיני היעד 40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות האמריקאי. משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנות שווה ומעביד.

Acknowledgments

מימון ניתן על ידי משרד החקלאות האמריקאי כריס 5347-22620-021-00D ו, בחלקו, על ידי החקלאות ומזון מענק המחקר תחרותי היוזמה לא. 2011-67009-30141 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הטכנית של יוהנה Nassif. אנו מודים גם פול בייקר, דוד הורטון, דייגו Nieto, ופרנסס Sivakoff למתן חלק מהתמונות השתמשו באיור 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

Tags

מדעי סביבה גיליון 107 Immunomarking חרקים ELISA סימן-ללכוד סימן-שחרור-לכבוש מחדש סימן עצמי
ניהול וזיהוי סימני חלבון על פרוקי רגליים לחקר פיזור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter