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Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53693
Automatic Translation
1, 1
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

Abstract

Monitoreo movimiento artrópodos se requiere a menudo para comprender mejor la dinámica de población asociados, patrones de dispersión, las preferencias de la planta huésped, y otras interacciones ecológicas. Los artrópodos suelen ser rastreados en la naturaleza mediante el etiquetado con una marca única y luego vuelven a su recogida en el tiempo y en el espacio para determinar sus capacidades de dispersión. Además de las etiquetas físicas reales, como el polvo o pintura de color, varios tipos de proteínas han demostrado ser muy eficaz para el marcado de los artrópodos para la investigación ecológica. Las proteínas se pueden administrar internamente y / o externamente. Las proteínas pueden entonces ser detectados en los artrópodos recapturados con un ensayo ligado a enzimas específico de la proteína de inmunoabsorción (ELISA). Aquí se describen los protocolos para la externa como internamente etiquetado artrópodos con la proteína. Dos ejemplos experimentales sencillos se demuestran: (1) una marca de proteína interna presenten a un insecto, proporcionando una dieta enriquecida con proteínas y (2) una marca de proteína externa tópicamente unpplied a un insecto usando un nebulizador médico. A continuación relacionamos una guía paso a paso del sándwich y métodos indirectos de ELISA utilizados para detectar signos de proteínas en los insectos. En esta demostración, se discuten diversos aspectos de la adquisición y la detección de marcadores de proteínas en los artrópodos para la marca de liberación y recaptura, marca de captura, y los tipos de auto-marca-captura de la investigación, junto con las diversas formas en que el procedimiento inmunomarcaje ha sido adaptado para adaptarse a una amplia variedad de objetivos de investigación.

Introduction

Seguimiento de los movimientos de plagas de artrópodos, enemigos naturales (parasitoides y depredadores), y polinizadores en la naturaleza es esencial para comprender mejor la manera de mejorar los servicios de los ecosistemas. El componente clave para la mayoría de tipos de investigación dispersión está teniendo un método fiable para etiquetar el artrópodo (s) de interés. Una variedad de materiales (por ejemplo, pinturas, tintes, polvos de colores, etiquetas, elementos raros, proteínas) se han utilizado para marcar los artrópodos para evaluar su dinámica poblacional, la capacidad de dispersión, la alimentación de comportamientos y otras interacciones ecológicas 1,2.

La idoneidad de un marcador utilizado para cualquier investigación dispersión dada dependerá del tipo de estudio que se llevó a cabo. Hay tres grandes categorizaciones para marcar artrópodos: (1) la marca de liberación y recaptura (MRR), (2) la marca de captura, y (3) la auto-marca-de captura. Para la investigación signo de liberación y recaptura, el investigador normalmente marca los artrópodos colectivamente en el Laboratory y los libera en un punto central en el campo. Los artrópodos son luego recapturados en distintos intervalos espaciales y temporales utilizando diferentes dispositivos de recogida (por ejemplo, la red de barrido, vacío, trampa pegajosa) 3,4,5. Los ejemplares recapturados se examinan a continuación, para la marca específica para distinguir liberado de personas nativas. Para la investigación marca de captura, el investigador normalmente se aplica la marca directamente en el equipo de aspersión campo utilizando (por ejemplo, pulverizador de mochila, la pluma y el pulverizador de boquilla). Los mejores marcadores para la investigación marca de captura son de bajo costo y de fácil aplicación para el hábitat de los artrópodos. Para la investigación propia marca de captura, el investigador suele aplicar marcas a un cebo artrópodos 6,7 o nido de entrada 8. A su vez, el artrópodo marca internamente devorando el cebo marcado o externamente por "cepillado" en contra de la marca a medida que sale del nido.

Como se mencionó anteriormente, muchos tipos de marcadores nos han sidoed para etiquetar una variedad de especies de artrópodos. Sin embargo, muy pocos son útiles para estas tres categorías de investigación de dispersión. El desarrollo del procedimiento inmunomarcaje proteína fue un gran avance para el marcado de los insectos. Inmunomarcaje pone una etiqueta de proteínas en los artrópodos, ya sea interna o externamente, que, a su vez, se detecta mediante un ensayo anti-proteína específica inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Los primeros marcadores tales proteínas utilizadas fueron inmunoglobulina de conejo (IgG) y pollo IgG / IgY 9,10. Demostraron ser marcas muy eficaces para MRR y la investigación propia marca de captura (véase el debate). Por desgracia, las proteínas de IgG / IgY son costosos y por lo tanto no son prácticos para la investigación mark-captura y la mayoría de los tipos de investigación propia marca de captura. Posteriormente, los ELISA de detección de proteínas de segunda generación fueron desarrollados para las proteínas contenidas en la clara de huevo de pollo (albúmina), la leche de vaca (caseína) y la leche de soja (proteína inhibidora de tripsina). Cada ensayo es muy sensible, específico, y, lo másimportante, utiliza las proteínas que son mucho menos costosas que las proteínas de IgG / 11 IgY. Estas proteínas han demostrado ser eficaces para el MRR, marca de captura, y la investigación propia marca de captura (véase el debate).

En este artículo, describimos y demostramos cómo llevar a cabo estudios de retención de laboratorio marca proteína. Tales estudios son la primera fase de la investigación necesaria para cualquier tipo de estudio de campo de dispersión. En concreto, es fundamental que los investigadores saben cuánto tiempo se mantendrá la marca en las especies de artrópodos dirigidos antes de embarcarse en estudios de campo de dispersión. A continuación, describimos y demostramos cómo marcar interna y externamente insectos para MRR, marca de captura, y estudios de campo de tipo auto-marca-de captura. A continuación, mostramos la forma de detectar la presencia de las marcas con los ELISA indirectos y sándwich.

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Protocol

1. Marque Interna, Retención y Procedimiento de Detección

  1. Procedimiento de marcación interna
    1. Recoge los insectos de interés (n ≈ 100 individuos) de una colonia de laboratorio criados con una dieta artificial o desde el campo y se dividen en dos contenedores de cría limpias.
    2. Coloque un paquete regular de 20 ml de dieta (tratamiento control negativo sin marcar) en uno de los contenedores. Suplemento de un segundo paquete de 20 ml artificial dieta con 1,0 ml de una solución de 1,0 mg / ml de IgG de pollo / IgY, mezclar bien, y colocarlo en otro recipiente.
      Nota: Si el insecto de interés no tiene una dieta artificial, la marca se puede colocar sobre o en cualquiera que sea la dieta que normalmente se mantienen en (por ejemplo, judías verdes, huevos de la polilla, el agua, el azúcar, la miel).
    3. Permitir a los insectos para reanudar su actividad de alimentación durante 24 horas.
  2. Procedimiento de retención de marca interna
    1. Retire los paquetes de la dieta de cada contenedor y suministrar los insectos wITH otra fuente de alimento para sostenerlos durante la duración del experimento (por ejemplo, judías verdes).
    2. Recoger una cohorte (n = 20) de los insectos diariamente (o en cualquier intervalo de tiempo deseado) de cada tratamiento y congelar inmediatamente a -20 ° C.
  3. Sandwich procedimiento ELISA
    1. Añadir 50 l de conejo anti-pollo IgY anticuerpo primario diluido 1: 500 en solución salina amortiguadora Tris (TBS) a cada pocillo de una microplaca de ELISA limpia e incubar durante un mínimo de 1 hora a RT (nota: las microplacas también se pueden incubar O / N a 4 ° C).
    2. Desechar el anticuerpo de la placa y bloquear cada pocillo con 300 l de una solución de leche seca no grasa 1,0% durante 30 min.
    3. A la espera de los pasos de incubación anteriores, colocar insectos congelados individualmente en 1,6 ml tubos de microcentrífuga con 1,0 ml de TBS.
    4. Moler cada insecto con una mano limpia hasta que se homogeneizó a fondo y añadir 100 l de cada muestra a un pocillo individual de la prueba ELISAplato. Permitir que las muestras se incuban a temperatura ambiente a durante 1 h.
    5. Añadir 100 l de negativo (TBS solamente) y positivos (claras de huevo en TBS) controles a pozos en la primera columna de cada placa de ELISA. Además, añadir 100 l de controles negativos de insectos (insectos sin marcar) a los 8 pozos en la última columna de cada placa (Figura 1). Permitir que las muestras de control incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Tenga en cuenta que la plantilla proporcionada en la Figura 1 es la plantilla que utilizamos para nuestros ensayos estandarizados. La colocación de las muestras en los pocillos es a la discreción del investigador.
    6. Lavar cada pocillo tres veces con tampón fosfato salino (PBS) Tween y luego añadir 50 l de IgG de conejo anti-pollo / IgY conjugado con peroxidasa de rábano picante diluida 1: 10.000 en solución de leche 1% y se incuba durante 1 hora a RT.
    7. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y añadir 50 l de tetrametilbencidina (TMB) a cada pocillo.
    8. Después de 10 min, leer los pozoscon un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm.

Figura 1
Figura 1. Un diagrama esquemático que muestra las designaciones así estandarizados utilizados para una típica de 96 pocillos ELISA microplaca. Cada placa contiene 7 pozos dedicados a controles negativos de solución salina tamponada con Tris (TBS), un pozo dedicados a un control de la proteína positivo (Pos Ctrl), 80 pozos individuales dedicadas a insectos recapturados (muestra 1 ... 80), y 8 pozos dedicados a controles sin marcar (negativos) de insectos (Neg Ctrl 1 ... 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Marque externa, Retención y Procedimiento de Detección

  1. Procedimiento de marcado externo
    1. Recoge los insectos de interés (n ≈ 100individuos) de una colonia de laboratorio o de campo y el lugar en dos recipientes de plástico 1.0 L con un agujero de 2,5 cm de diámetro perforados por el lado de cada contenedor.
    2. Pulverizar los insectos en el primer recipiente con 1,0 ml de dH 2 O (tratamiento control negativo) utilizando un nebulizador médico. Pulverizar los insectos en el segundo recipiente con 1,0 ml de una solución 5,0% de claras de huevo de pollo usando un nebulizador médico.
    3. Conecte la manguera del nebulizador a una toma de aire estándar de laboratorio y luego insertar la desembocadura del nebulizador en el agujero de 2,5 cm del recipiente. A continuación, encienda la salida de aire gradualmente hasta que el nebulizador produce un vapor.
    4. Continuar pulverización (marcado) hasta que la solución claras de huevo se ha dispensado (aprox. 2-5 minutos).
    5. Retire el nebulizador y colocar un tapón en el orificio del recipiente de plástico. Permita que los insectos que están a temperatura ambiente hasta que la solución se haya secado completamente.
  2. Procedimiento de retención de marca externa
    1. Coloque cada tratamiento de los insectos secos en un recipiente de cría limpia separada para evitar una mayor exposición a la marca.
    2. Añadir alimentos y agua a los recipientes limpios para sostener los insectos durante la duración del estudio.
    3. Recoge una cohorte (n = 20) de los insectos de cada tratamiento diario y congelar inmediatamente a -20 ° C.
  3. Procedimiento ELISA indirecto
    1. Coloque los insectos congelados individualmente en tubos de microcentrífuga de 1,6 ml y añadir 1,0 ml de TBS.
    2. Remoje las muestras durante 1 hora en un conjunto agitador orbital a 120 rpm.
    3. Añadir controles positivos y negativos como se describe en el Paso 1.3.5.
    4. Después de remojar, pipetear una parte alícuota de 100 l de cada muestra en uno de los 80 pocillos de muestras designadas en una nueva placa de ELISA de 96 como se muestra en la Figura 1 Permitir que las muestras se incuban durante 1 hora a RT (nota:. Las microplacas También puede haber O incubado / N a 4 ° C).
    5. Lavar éstos tres veces conPBS-Tween y luego añadir 300 l de fosfato salino tamponada que contiene 1% de albúmina de suero bovino (PBS-BSA) a cada pocillo.
    6. Después de 30 min a TA lavar dos veces con PBS-Tween.
    7. Añadir 50 l de conejo anti-albúmina de huevo anticuerpo primario diluido 1: 8000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) a cada pocillo e incubar durante 1 hora a RT.
    8. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y luego añadir 50 l de IgG de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano diluida 1: 2000 en PBS-BSA-Silwet (0,05%) durante 1 hora a RT.
    9. Lavar cada pocillo tres veces con PBS-Tween y se añaden 50 l de sustrato TMB a cada pocillo.
    10. Después de 10 min, leer los pocillos con un espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 650 nm.

Análisis 3. Datos

  1. Calcular el valor medio de absorbancia de los insectos de control negativo 8 en cada placa ELISA y luego calcular la desviación estándar a partir de los controles negativos agrupados lado a otrom todas las placas de ELISA de un estudio dado 12.
  2. Añadir seis veces la desviación estándar combinada con la media obtenida para cada placa ELISA para obtener un valor umbral positivo ELISA. Cualquier muestra de insectos obteniéndose un valor de absorbancia igual o mayor que este valor se considera que es positivo para la presencia de la marca de la proteína.

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Representative Results

Marcado interno:

Los resultados de la prueba de retención marca interna se muestran en la Figura 2A. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.054. En general (en todas las cuatro fechas muestra combinada), los insectos tratados sin proteínas dieron valores constantemente bajos de ELISA (x = 0,038 ± 0,002, n = 80). Por el contrario, todos los insectos alimentados con la dieta enriquecida proteína produjo valores consistentemente fuerte ELISA (x = 0,475 ± 0,221, n = 80).

Señalización exterior:

Los resultados de la prueba de retención marca externa se muestran en la Figura 2B. El valor umbral crítico ELISA calculado era 0.082. En general, los insectos tópicamente marcados con sólo agua arrojaron consistentemente baja ELIValores SA (x = 0,048 ± 0,007, n = 80). Por el contrario, todos los insectos tópicamente marcados con la solución de claras de huevo produjo valores consistentemente fuerte ELISA (x = 0,746 ± 0,232, n = 80).

Figura 2
Figura 2. La media (± DE) ELISA valores de densidad óptica de insectos (A) marcados internamente con IgY de pollo y (B) los insectos marcados externamente con clara de huevo de gallina (albúmina). Las barras negras son los valores medios ± DE ELISA densidad óptica produjeron por insectos sin marcar. Tamaño de la muestra del insecto por cada tratamiento diario de proteína fue de 20 personas. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El procedimiento inmunomarcaje proteína artrópodos fue descrita por primera vez casi un cuarto de siglo atrás 9. Desde entonces, el procedimiento se ha adaptado para estudiar los patrones de dispersión de una amplia variedad de artrópodos utilizando administrados tanto interna como externamente IgG / IgY. Estas proteínas han demostrado marcadores firmes para la amplia variedad de especies de insectos ensayadas hasta el momento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la principal limitación para el uso de IgG / IgY es que son muy caros. En consecuencia, IgG / IgY sólo son útiles para MRR y los estudios de tipo auto-marcado con la que grandes cantidades de insectos pueden ser marcados en un pequeño espacio o las marcas se pueden incorporar en una dieta o cebo. Aquí, proporcionamos una simple demostración de cómo una marca interna puede ser administrado por la alimentación de la diana de insectos una dieta artificial enriquecida con IgG de pollo / IgY. A su vez, la IgG / IgY se detectó utilizando un sándwich ELISA. Este sistema puede ser especialmente ventajosa para los investigadores que ya utilizan undieta que contenga huevos de gallina desde el ensayo detectará de forma natural la IgG / IgY encuentra en los huevos. Además, pequeñas cantidades de proteína IgG / IgY se pueden administrar por vía tópica a los insectos utilizando el nebulizador médico descrito anteriormente (Figura 3A). Un nebulizador se utilizó primero en parasitoides marca de masa muy delicados y diminutos con IgG de conejo para el tipo MRR investigación 3. Desde entonces, otros métodos han sido utilizados para administrar marcas de IgG / IgY para los artrópodos para la investigación dispersión. Por ejemplo, un atomizador de perfume ha sido utilizado para aplicar marcas de IgG / IgY en otras especies de parasitoides 13,14. Otros han marcado internamente varios insectos por la alimentación de ellos (es decir, la auto-marcado) IgG de conejo marcado miel o azúcar agua 14,15 16 (Figura 3B). Por último, Baker et al. 7 cartón alimentado a las termitas que se impregnan con IgG de conejo (Figura 3C). Estas termitas fácilmente auto marcados -como ingirieron el alimento cebotelas.

figura 3
Figura 3. Varios métodos utilizados para administrar una marca de proteína de: (A) parasitoides delicados siendo marcados con IgY de pollo usando un nebulizador médico, (B) un parasitoide alimentándose de solución de miel IgG enriquecida conejo, (C) termitas alimentándose de una de cartón IgG enriquecida conejo cebo, (D) las abejas auto marcado con leche en polvo a medida que avanzan a través de un dispositivo de formación de polvo colocado en la entrada de una colmena, (E) insectos nativos están marcados con leche en un campo de algodón utilizando una plataforma de pulverización tractor convencional, (F ) insectos nativos están marcados con claras de huevo de pollo con un dispositivo de auge y boquilla montada en un vehículo todo terreno, (G) insectos nativos en una franja de la alfalfa se marcó con claras de huevo de gallina con una espaldadispositivo pulverizador mochila y (H, I) insectos nativos en alfalfa se marcan con claras de huevo de pollo utilizando aplicadores aéreos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Proteínas IgG / IgY simplemente no se han utilizado para el estudio de la dispersión de insectos. Ellos también se han utilizado para el seguimiento de enlaces tróficos en la cadena alimentaria artrópodo. Hagler y Durand 17 primero propusieron el concepto de marca presa con IgG / IgY y, a su vez, la realización de un contenido de IgG / IgY específica intestino ELISA sándwich de depredadores que consumen la marcada presa. Esta técnica ha ganado recientemente popularidad entre los investigadores de análisis intestino porque es menos tediosa y costosa que la realización de ELISA o reacción en cadena de polimerasa-presa específica (PCR) de tipo análisis de contenido intestinal moleculares (ver Hagler 18 y Fournier et al. 19 para las revisiones de THe pros y los contras de las diversas técnicas de ensayo intestino). En la última década, la técnica inmunomarcaje presa se ​​ha utilizado para identificar la actividad de alimentación de los depredadores de algodón de IgG de conejo marcado plagas 18,20,21, trophallaxis y relaciones de alimentación en las colonias de termitas utilizando un conejo fuente de alimento de papel 22 IgG-tratada, granivoría de un conjunto de artrópodos en las semillas de diente de león de malezas invasoras marcados con IgG de conejo 23, apestar tasas de errores de depredación sobre gusanos picudos del tomate IgG marcados recogidos en las parcelas sometidas a diversos tratamientos semioquímicas 24, y la actividad de eliminación de depredadores de carroña IgG / IgY marcada-25.

Una segunda generación de los ELISA indirectos de detección de proteínas se desarrollaron hace casi una década. Estas pruebas ELISA fueron diseñados específicamente para detectar las proteínas contenidas en los productos alimenticios "off-the-shelf", como la proteína albúmina de huevo en las claras de huevo de pollo, proteína de soja inhibidor de tripsina en la leche de soya y proteína de caseínaen la leche bovina. Los inmunomarcadores proteínas de segunda generación han demostrado ser útiles para MRR, marca de captura y el tipo de auto-marca de la investigación. Por ejemplo, Irvin et al. 26 demostraron que era factible para marcar tópicamente delicados parasitoides con estas proteínas off-the-shelf. Por otra parte, Hagler et al. 8,27 mostró que las abejas pueden auto-marca con clara de huevo y leche bovina polvos secos cuando salen a través de un distribuidor de proteína colocado en la entrada de una colmena (Figura 3D). Tal vez el uso más creativo de la proteína marcado involucrado focalización palmaditas vaca con claras de huevo utilizando un pulverizador de chorro de 28. A su vez, los adultos de mosca rostro adquirió un auto-marca, ya que salieron de su estado de pupa y salieron de la palmadita de la vaca.

La característica más importante de las proteínas inmunomarcadores segunda generación es que son fácilmente disponibles en cantidades masivas y en una fracción del costo de las proteínas IgG / 11 IgY. Esta característica tiene revolutionized la forma en que se llevó a cabo tipo de marca de captura de la investigación en toda la zona. En concreto, los investigadores tienen ahora un método fiable para los artrópodos rápida y uniforme de etiqueta en vastas áreas en el campo utilizando una amplia variedad de equipos de plataforma de pulverización convencional (Figura 3E). Por ejemplo, los insectos plagas se han marcado directamente en huertos y campos utilizando pulverizadores arma de mano portátil Tipo 29,30, pulverizadores Airblast tractor impulsado por 31,32, y pulverizadores de arrastre 33. Horton et al. 34 utilizaron un dispositivo de pulverización eléctrico montado en un vehículo todo terreno para identificar las aplicaciones de las claras de huevo a los insectos que ocupan los cultivos de cobertura embebidas en una huerta de la pera (Figura 3F). Del mismo modo, Swezey et al. 5,35 usó un pulverizador de mochila para aplicar las aplicaciones precisas de claras de huevo de pollo a las filas de un cultivo trampa de alfalfa (una planta huésped preferido) incrustado en un campo de fresas de cultivo ecológico para marcar una plaga y sus enemigos naturales ( et al. 36 aplica una aplicación de difusión de la leche bovina y la clara de huevo a 29 y 16 ha de alfalfa floración, respectivamente (Figura 3H, I). El objetivo de ese estudio fue marcar los artrópodos residentes en la alfalfa, y luego, después de la alfalfa fue cosechada por siega (provocando un evento de dispersión), para realizar un seguimiento de los patrones de dispersión de los artrópodos en los campos de algodón adyacentes (un cultivo susceptible a la especies de plagas).

Algunos usuarios de la marca de procedimiento de captura de segunda generación han modificado el procedimiento original algo para satisfacer sus necesidades específicas de investigación. El tipo y tamaño del cuerpo tél dirigido de insectos, junto con sus características de comportamiento, dictará el volumen y la concentración de la marca necesaria y cómo la marca se administra 37. Por otra parte, el método utilizado para recuperar los insectos en el campo será contingente en estos factores. Hasta la fecha, casi cada método utilizado (por ejemplo, trampas pegajosas, redes de barrido, aspiradoras) para recoger los insectos ha sido utilizado con éxito para recolectar insectos marcados 3,5,8,11,29,31,32,35,38. Sin embargo, debido a las sensibilidades extremas de las pruebas ELISA de detección de proteínas, hacemos hincapié en que el gran cuidado se debe tomar para asegurarse de que los especímenes sin marcar no se contaminan durante la recogida o clasificación procesos 38.

El estudio original 11 que describe la segunda generación de sistemas de proteínas marcado (por ejemplo, albúmina de huevo, caseína de la leche, y el inhibidor de tripsina de soja) informó los factores que afectan la sensibilidad del ensayo puede variar entre los tipos de marcador. En concreto, demostraron que difrentes fuentes de agua, aditivos (surfactantes), e incluso el tipo de placa de ELISA utilizadas afectados (positiva o negativamente) el ensayo. Por otra parte, este estudio y estudios posteriores mostraron que 37,39,40 los ensayos de detección de marca de tres proteínas varían en eficacia. El marcador de la clara de huevo se mantuvo más tiempo que el marcador de la leche, que se retuvo más de marcador de leche de soja. Estos resultados destacan la importancia de la retención de marca de proteína pruebas en cualquier insecto dado antes de embarcarse en la investigación de campo. Además, estas pruebas ELISA indirectas de segunda generación a veces muestran un bajo nivel de ruido de fondo con ciertos tipos de insectos (por ejemplo, los herbívoros) (obs pers.). Este ruido de fondo puede ser reducido mediante la adición de 100 l de peróxido de hidrógeno a cada pocillo de la placa ELISA durante 30 minutos entre la etapa 2.3.4 y 2.3.5 Paso en el protocolo anterior (datos no publ.).

Cabe señalar que las pruebas ELISA indirectos utilizados para detectar las marcas de proteínas de segunda generaciónson muy eficaces en la detección de la proteína de insectos empapadas en el tampón de muestra. Sin embargo, las pruebas ELISA indirectos no son tan eficaces como el sándwich ELISA para detectar marcas de proteínas internas o proteínas presa de insectos. Los estudios han demostrado que los ELISA indirectos no son tan eficientes como los ELISA de sándwich en la detección de proteína en muestras de insectos homogeneizadas 34,41.

Un factor importante a considerar con cualquier ELISA es que el procedimiento se muestra a menudo placa a placa (atribuido principalmente a la del día a día efectos de correr un ensayo) 42,43 variabilidad. Por lo tanto, es esencial que cada placa de ELISA incluye: (1) uno o más de TBS controles sólo negativas, (2) uno o más TBS + proteínas puras controles positivos, y (3) al menos ocho controles de insectos negativos (es decir, individuos conocidos no para contener una marca de proteína). El TBS solamente, proteína de TBS +, y los controles negativos de insectos aseguran que el tampón no es una fuente de error, los reactivos están funcionando correctamente, unand que no hay proteínas en el insecto que se cruzan reaccionar con los reactivos de ELISA, respectivamente. Por otra parte, los controles negativos de insectos son esenciales para el cálculo de los valores de umbral de ELISA (véase más adelante). El diseño de la placa se muestra en esta demostración incluyó 7 espacios en blanco TBS, 1 + proteína de control positivo TBS (en la primera columna) y ocho controles negativos (en la última columna) en cada placa de ELISA (Figura 1).

Otro factor importante a considerar al manejo de los datos de ELISA es determinar un valor umbral para anotar un insecto de la presencia o ausencia de una marca de proteína. El método propuesto originalmente por Stimmann 44 al eliminar insectos rubidio-marcado se define como el nivel medio de marcador en un charco de insectos sin marcar más tres veces la desviación estándar de los individuos sin marcar. Este método también se ha utilizado como el método convencional al eliminar insectos para la presencia de marcas de proteína 9,17. Sin embargo, en algunos cases, los investigadores han seleccionado intuitivamente valores de umbral más conservadores para reducir la probabilidad de obtener falsos positivos. El método más sencillo es añadir sólo cuatro a seis desviaciones estándar de la media de los controles negativos en lugar de tres 18,34. Un método más sofisticado para reducir aún más la posibilidad de obtener falsos positivos fue propuesto por Sivakoff et al. 12. Este método implica el cálculo del valor de la absorbancia media de los insectos de control negativo ocho en cada placa ELISA y luego calculando la desviación estándar sobre la base de los controles negativos agrupados de todas las placas de ELISA de un estudio dado.

En resumen, un método fiable para etiquetar los artrópodos es crítico para el éxito de la mayoría de los estudios de dispersión. Varios métodos han sido utilizados para marcar los artrópodos con proteínas en las últimas dos décadas. Inmunomarcaje de proteínas y la detección de las marcas son relativamente fácil y barato y muy adaptable a una miríada de sos estudios. Los futuros usuarios de la técnica inmunomarcaje deben asegurarse de que su metodología es adecuada a las características específicas de su investigación. La concentración y el volumen de la marca necesaria y cómo se aplica la marca dependerá de factores como el comportamiento, tipo de cuerpo y el tamaño de la especie objetivo 40.

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Disclosures

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el Departamento de Agricultura de Estados Unidos. USDA es un proveedor de igualdad de oportunidades.

Acknowledgments

El financiamiento fue proporcionado por el USDA CRIS 5347-22620-021-00D y, en parte, por la Agricultura y la Alimentación de Investigación Iniciativa Competitiva subvención no. 2011-67009-30141 del Instituto Nacional del USDA de la Agricultura y la Alimentación. Estamos muy agradecidos por el apoyo técnico de Johanna Nassif. También queremos agradecer a Paul Baker, David Horton, Diego Nieto, y Frances Sivakoff para proporcionar algunas de las imágenes utilizadas en la Figura 3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Food storage container (for insect rearing) Rubbermaid/Tupperware Various sizes Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window
Small volume nebulizer (Micro Mist) Teleflex-Hudson RCI 1881 Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.
Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap Continental Lab Products 4445.X Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.
Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid) RPI Corp. 145746 This design is nice because it doesn't crowd the tubes.
Dispenser, repeater Eppendorf 4982000322 Anything similar will help speed up the dispensing.
Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml Kimble Chase 749521-1500 Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.
BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) BD 351172
Ovation pipette, manual (20-200 µl) VistaLab 1057-0200 or 1070-0200 Any similar type will work. This model is ergonomic.
Reservoirs, sterile reagent VistaLab 4054-1000 Anything similar will work.
Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730391 If you had to pick one electronic model, this size is most useful.
Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) Sartorius 730361 Anything similar will work.
Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) Sigma-Aldrich Z369802  Anything similar will work for manual plate washing.
Microplate reader with absorbance detection Molecular Devices SpectraMax 250 Anything similar will work.
Chicken IgG/IgY United States Biological I1903-15R Also available from other sources
Egg whites Grocery store “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. Mix 5 ml with 95 ml dH2O for 5% solution
Tris (Trizma Base) Sigma-Aldrich T1503 2.42 g/L to make TBS
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g⁠/⁠L for PBS
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Sigma-Aldrich S0876 1.14 g/L for PBS
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 0.2 g/L for PBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 0.2 g/L for PBS
Tween 20, EIA grade Sigma-Aldrich P1379 Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.
PBS with 1% BSA Sigma-Aldrich P3688 Mix 1 packet in 1 L dH2O
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) Sigma-Aldrich C6409 Mix 100 µl in 50 ml TBS
Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) Grocery store Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution
Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000) Sigma-Aldrich A9046 Mix 100 µl in 1 L of 1% milk
Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000) Sigma-Aldrich C6534 Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA
Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000) Sigma-Aldrich A6154 Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer Lehle Seeds VIS-01 Add as last ingredient
TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate SurModics TMBW-1000-01

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References

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Hagler, J. R., Machtley, S. A.… More

Hagler, J. R., Machtley, S. A. Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research. J. Vis. Exp. (107), e53693, doi:10.3791/53693 (2016).

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