Déficitaires et approche Gain de fonction d'enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

Summary

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Introduction

Préimplantatoire de développement embryonnaire peut être divisé en plusieurs étapes distinctes, à partir du stade d'une cellule à la morula et blastocyste. Beaucoup de preuves suggère que la polarité et les indices de position jouent un rôle au début de la détermination du destin cellulaire dans le trophectoderme (TE) et la masse cellulaire interne (ICM). Cependant, la nature des indices, la façon dont ils sont transduits en signaux cellulaires et les contextes physiologiques dans lesquels ces signaux sont capables d'initier la différenciation de la lignée cellulaire ne sont pas connues. Ces cellules différenciées sont ensuite soumis à la spécialisation, à commencer à prendre des structures caractéristiques et fonctions nécessaires à l' embryon la formation et à la croissance du placenta ^1-3.

embryons de pré-implantation sont particulièrement favorables à la manipulation par injection directe de matériel génétique modifié comme siRNA ou l'ADNc cible et peuvent donc être utilisés pour étudier des molécules cibles spécifiques. Il y a une compréhension croissante que génétiqueanalyse des embryons de vertébrés est essentielle pour faire progresser notre compréhension du développement embryonnaire ^4. l'introduction précise d'un gène de type sauvage ou une forme mutante dans un embryon dans un contexte en temps opportun pour accomplir ou intensité forte perte de fonction du gène a grandement facilité l'étude des gènes régulés par le développement. Et déficitaires gain de fonction par microinjection de matériel génétique dans des embryons non mammifères et mammifères début individuels est relativement simple en raison de leur grande taille et de grande réceptivité ^5. La micro-injection est typiquement réalisée en utilisant des vecteurs non viraux. Un avantage particulier a été pris de la facilité d'utilisation de vecteurs non viraux sur des vecteurs viraux et des transgènes. Un rapide ou déficitaire système d'expression gain de fonction dans des embryons de souris a été développée qui nous permet de disséquer et de comprendre les fonctions des gènes en embryologie vertébré ^6,7.

Le marquage fluorescent des embryons serait grandement faciliter la sélection des microinjected ou génétiquement manipulées et les embryons en même temps , délivrer un moyen pour quantifier indirectement le niveau d'ARNsi ou d' ADNc microinjecté expression basée sur l' intensité de fluorescence ^8. Pour ce faire l'étiquetage, l'ADNc de la protéine fluorescente, la GFP ou RFP, sont co-injectées soit des constructions de fusion ou séparément. L'intensité de fluorescence de la GFP ou RFP révèle l'ampleur de l'expression d'ARNsi ou d'ADN étranger à faire en sorte que déficitaire ou gain de fonction a été accomplie.

Ici, nous présentons un protocole de micromanipulation pour la technique de la fonction déficitaire et le gain-of qui nous a permis d'identifier néogénine comme un récepteur qui transmet des signaux extracellulaires importants dans la différenciation cellulaire précoce chez les embryons de souris préimplantatoire.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures pour l'élevage et soins des animaux ont été effectués selon les règlements de l'Université IACUC Sahmyook, Séoul, Corée du Sud.

1. Superovulation, Elevage et isolement Oviducte

1. Maintenir C57BL / 6 souris consanguines dans les conditions suivantes: 22 ± 3 ° C, ~ 60% d'humidité, 12 h cycle lumière / obscurité, et de l'eau et de la nourriture ad libitum.
2. Provoquer superovulation des souris femelles 3-5 semaines d'âge par une injection intrapéritonéale de 5 UI jument gravide gonadotrophine sérique (PMSG) à 0,1 ml / tête suivie 48 heures plus tard par une injection intrapéritonéale de 5 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) à 0,1 ml /tête.
3. Immédiatement après l'injection hCG, accoupler les femelles induite superovulation-avec des mâles sexuellement matures de la même souche en les gardant dans la même cage pendant la nuit.
4. Le lendemain matin, confirmer l'accouplement par la présence d'un bouchon d'accouplement ou de bouchon vaginal sur l'appareil génital féminin.
5. Sacrifiez les souris femelles enceintespar CO ₂ intoxication suivie cervicale dislocation 18-20 h après l' injection hCG.
6. Ouvrez la cavité abdominale en coupant la peau, puis la couche péritonéale avec des ciseaux fins.
7. Ramassez les cornes utérines avec une pince fine et se détache de l'utérus, l'oviducte, de l'ovaire, et coussinet adipeux doucement de la cavité du corps.
8. Couper la zone située entre l'oviducte et l'ovaire avec des ciseaux fins. Repositionner la pince et couper l'utérus près de l'oviducte, en laissant au moins 1 cm de la partie supérieure de l'utérus fixé.
9. Transférer le ampulla oviducte à une boîte de Pétri de 35 mm contenant du milieu M16 à la température ambiante. Réunir les oviductes de plusieurs souris dans le même plat.
10. Placez les plats sous un stéréomicroscope pour la récupération des embryons.

2. Extraction et culture de 2-pronucléaire (2-PN) Embryons

1. Coupez l'extrémité d'une aiguille hypodermique G 30 ou 32, moudre en une pointe émoussée, et l'utiliser comme une aiguille de rinçage.
2. Utilisationune pince fine pour faire glisser l'extrémité de l'oviducte sur l'aiguille de rinçage. Appuyez doucement sur la pointe de l'aiguille de rinçage contre le fond du plat pour le maintenir en place. Rincer l'oviducte avec ~ 0,1 ml de milieu M16 pour libérer les embryons 2-PN dans une boîte de Pétri.
3. Récupérer les embryons 2-PN avec entourant les masses cumulus du milieu M16 rincée sous la loupe binoculaire à l'aide d'une pipette en verre stérile et de les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri.
4. Dissocier les cellules du cumulus à partir des embryons de 2-PN par digestion enzymatique avec 1,0 ml de 0,1 à 0,5% d'hyaluronidase dans un tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS) à 37 ° C pendant 5 à 10 min.
5. Dénudent embryons par pipetage doucement avec une pipette en verre et l'élimination physique des cellules du cumulus.
6. Laver les embryons dénudés trois fois avec 30-50 ml de solution saline tamponnée au phosphate frais (PBS) par embryon.
7. Incuber les embryons dans une boîte de Petri en plastique de 35 mm dans un milieu M16 additionné de 10 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA, Fraction V) à 37 ° C dans 5% de _CO2 dans un incubateur humidifié jusqu'à ce que la micro - injection est effectuée, ce qui est généralement inférieure à 4 heures plus tard.

3. Embryo transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR)

1. Recueillir au moins 10 embryons provenant de chaque étape jusqu'à l'étape blastocyste et mettre en commun les dans 4,0 pi de 5x inverse solution de pré-mélange transcriptase contenant la transcriptase inverse, un inhibiteur de la RNase, amorce oligo dT, 6mers aléatoire, d'un mélange de dNTP et le tampon de réaction dans un tube PCR.
2. Ajouter RNase-H ₂ O distillée à un volume total de 20 pi et sonication les embryons mis en commun pendant 30 secondes à 200 W. Initier la réaction RT immédiatement à 42 ° C pendant 1 heure puis 5 minutes d' incubation à 95 ° C.
3. Pour chaque 5,0 ul de solution d'ADNc généré, effectue une amplification par PCR avec des amorces normales pour néogénine, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, ou β-actine (séquences d' amorce donnés dans le tableau 1. PCR comprend 40 cycles de 15 sec d' incubation à 95 ° C, 30 s à la température de recuit (indiqué dans le Tableau 1) et 30 s à 72 ° C.
4. Les produits de PCR séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% et de visualiser le gel sous lumière UV après coloration au bromure d'éthidium.
5. Normaliser l'expression du gène cible par rapport aux niveaux de ß-actine.

4. Immunocytochimie des Embryons

1. Fixer les embryons provenant de chaque étage avec 4% de paraformaldehyde dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, suivie par un bref lavage 3 fois avec du PBS contenant 0,01% de BSA.
2. Les membranes cellulaires perméabiliser par incubation d'embryons 10 dans 1,0 ml de PBS contenant 0,1% de Tween 20 et 0,1% de Triton X-100 à température ambiante pendant 10 min.
3. Pour bloquer la liaison non spécifique incuber les embryons perméabilisées dans 1,0 ml de PBS additionné de 10% de sérum de chèvre normal pendant 30 minutes à température ambiante.
4. Incuber l'embryon d'esprit bloquéh anticorps de lapin anti néogénine à dilution 1: 100 dans du PBS contenant 0,1% de BSA pendant une nuit à 4 ° C.
5. Après trois lavages pendant 30 secondes chacune dans des gouttes de PBS, laisser incuber les embryons soit avec Alexa IgG de chèvre anti-lapin 488 conjugué ou Alexa 568 conjugué de chèvre anti-IgG de lapin à dilution 1: 500 dans une solution PBS / BSA pendant une nuit à 4 ° C .
6. Pour visualiser les filaments d'actine, incuber les embryons in 1 pg / ml dans du PBS phalloïdine pendant 1 heure à température ambiante.
7. Colorer les noyaux en ajoutant 5 ml de PBS contenant 1 pg / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochlorure) pendant 5 min à température ambiante.
8. Laver les embryons trois fois brièvement avec du PBS.
9. Transfert d'embryons à une lame de verre et les couvrir avec une goutte d'huile minérale.
10. Prenez des images à 1,000X grossissement avec un microscope confocal avec une excitation de la longueur d'onde appropriée.

5. Préparation de néogénine-DP et néogénine-siRNA GFP Plasmides

1. Sousclone ADNc codant néogénine de la souris dans une protéine fluorescente rouge (RFP) contenant vecteur, résultant en néogénine-flag-DP.
2. Subclone petit ARN en épingle à cheveux ciblage néogénine dans une protéine Emerald Green Fluorescent (EmGFP) contenant vecteur, résultant en pcDNA-EmGFP-miR-néogénine (voir figure 1).
3. Amplifier les deux néogénine-flag-DP et plasmides pcDNA-EmGFP-miR-néogénine et les purifier par des méthodes classiques.
4. Ajuster les concentrations finales des plasmides à ~ 1,0 pg / ml dans un tampon stérile Tris-EDTA (TE).

6. microinjection de Plasmides en 2-PN Embryons

1. Laver les 2 dénudées-PN embryons une fois, brièvement, avec les médias M16 frais.
2. Centrifuger les embryons 2-PN pendant 10 min à 1000 xg dans une centrifugeuse de table pour permettre l'observation de la pronuclei.
3. Incuber les embryons dans une micro goutte de 20 à 30 pi de milieux M16 par embryon dans l' huile minérale à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pour un additional 1-2 heures.
4. Fabrication pipettes d'injection et pipettes de maintien en tirant un tube capillaire borosilicate de verre (DO = 1,2 mm; ID = 0,94 mm) avec un extracteur mécanique.
5. Fabriquez pipettes d'injection pour avoir des conseils contondants et ouvertures polies de <500 um longueur de la pointe et 1-2 pointe um diamètre intérieur en utilisant un micromoteur et un microforger.
6. Fabriquer tenant pipettes de telle sorte qu'ils ont des extrémités franches et des ouvertures polies avec un diamètre intérieur de 20 um et un diamètre externe de 100 um.
7. pipettes d'injection de charge avec une quantité suffisante (> 200 nl) de solution de plasmide à 1,0 pg / pl.
8. Micro-injection ~ 10 pi de solution de plasmide de chaque embryon 2-PN dans l'une des pronuclei en utilisant un micro-injecteur attaché à un micromanipulateur motorisé; au cours de ce processus, conserver les embryons en position en appliquant une pression négative avec une pipette de maintien.
9. Après microinjection, laver les embryons 2-PN 3 fois avec des milieux frais M16 pour less de 1 min à chaque fois.
10. Culture des embryons 2-PN dans une goutte de milieu M16 frais sur une boîte de culture en plastique recouverte d'une goutte d'huile minérale pour éviter l'évaporation des médias.
11. Observer les embryons à intervalles de 24 heures sous un contraste d'interférence différentiel (DIC) de microscope inversé au grossissement de 200x.

Representative Results

Nous avons découvert que néogénine est transitoirement exprimée au cours des premiers stades de développement des embryons préimplantatoire de souris, apparaissant dès au stade 2 cellules et durable jusqu'au début du morula , mais devenir déficient à la fin morula et stades blastocyste (Figure 2A). En outre, la répartition spatiale des néogénine a été limitée principalement à l'extérieur des cellules. Les résultats de l' analyse par RT-PCR étaient compatibles avec la nature précoce et transitoire de l' expression néogénine, avec un pic au stade 4 cellules mais complètement dépourvue au stade 16 cellules ou plus (figure 2B). En revanche, la F-actine n'a pas révélé d'un tel motif d'expression transitoire et polarisée.

Nous avons ensuite cherché à savoir si les niveaux de néogénine pourraient être manipulés par microinjection soit des vecteurs néogénine d'ADNc (gain néogénine) ou vecteurs hébergeant shRNA ciblant néogénine (néogénine loss) dans le zygote 2-PN. Pour différencier visuellement le gain néogénine de la perte néogénine, DP et GFP ont été co-exprimées en indicateurs (figure 3), et le résultat néogénine niveau d'expression a été confirmée à la fois par immunofluorescence et par immunotransfert (Figure 4).

La figure 5 montre des images représentatives d'embryons à chaque étape après avoir reçu soit néogénine shRNA ou néogénine ADNc au stade 2-PN. Il n'y avait pas de différences morphologiques brutes apparentes entre la perte néogénine et d' embryons de gain néogénine, et aucune différence potentiels de développement au moins jusqu'à ce que le stade de blastocyste (tableau 2). En fait, le nombre de survivants des embryons à chaque étape et le nombre d'embryons arrêtés ne sont pas significativement différents.

Cependant, le développement ICM a été moins prononcé dans la perte néogénine que néogénine embryons de gain quemis en évidence par une expression plus élevée de l' ICM spécifique Oct3 / 4 dans les embryons de gain néogénine (figure 6A) et par un plus grand nombre de cellules ICM Oct3 / 4-positives par blastocyste dans le gain néogénine que les embryons de perte néogénine (figure 6B). En outre, l'analyse par RT-PCR a révélé une forte corrélation entre le niveau d'expression de trois facteurs de transcription et celle de néogénine. Dans blastocystes de perte néogénine, peu Oct3 / 4, Sox2 et Nanog ont été détectés, ce qui est en contraste frappant avec une augmentation significative de l'expression de tous les trois facteurs de transcription dans le gain néogénine sur des embryons de contrôle (Figure 6C). De façon inattendue, les niveaux de Cdx2 et Tead4 expression, des facteurs de transcription impliqués dans la différenciation TE / maintenance ^6,7, ont été moins influencés par le niveau de néogénine d'expression, de la validation que la régulation des néogénine conduit à l'activation des régulateurs de transcription spécifiques pour ICM , mais pas pour l'établissement TE. Toutes les données sont m odified de référence ^9.

Figure 1: La structure du pcDNA-EmGFP-miR-néogénine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2:. Expression de néogénine Pendant le développement embryonnaire de souris (A) images microscopiques confocales d'expression néogénine dans les embryons préimplantatoires à différents stades de développement. (B) La transcription polymerase chain reaction inverse de l' ARNm néogénine dans des embryons de pré - implantation à différents stades de développement. β-actine a été utilisée comme contrôle interne.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3:. Green Fluorescent Protein (GFP) et Red Fluorescent Protein (RFP) Expression comme indicateurs pour la perte néogénine et néogénine Gain, respectivement Après microinjection d'un shRNA vecteur néogénine ciblant l' hébergement GFP conjugué ou microinjection d'un vecteur d'ADNc néogénine hébergeant RFP en 2-PN zygotes, l'expression de la GFP et RFP ont été visualisées sous un microscope à fluorescence aux étapes 2 et 4 de cellules à cellules. Le panneau de gauche, les images à contraste de phase; panneaux du milieu et de droite, des images de fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4:. Expression de néogénine dans un blastocyste Après microinjection soit shRNA Ciblage néogénine ou néogénine ADNc (A) Après microinjection d'un shRNA vecteur néogénine-ciblage dans zygotes 2-PN, le niveau de néogénine dans les cellules de blastocystes individuelles d'expression a été évaluée par immunocoloration avec des anticorps anti-drapeau. Dans le panneau de gauche, brouillés néogénine vecteurs shRNA ont été microinjection (contrôle). Dans le panneau de droite, vecteurs shRNA néogénine ciblage ont été microinjection. DAPI, DAPI (bleu) a été utilisé pour colorer le noyau; Anti-drapeau, la visualisation de l'étiquette de drapeau sur néogénine (rouge); GFP, protéine fluorescente verte (vert); fusionné, superposition de DAPI, anti-drapeau, et la GFP. (B) Des lysats de cellules entières de blastocystes ont été immunotransfert avec des anticorps anti-drapeau. GFP a été utilisé comme témoin de chargement. Scrambled shRNA, brouillées néogénine injection shRNA; Ng shRNA, néogénine ciblage shRNA injec tion. (C) Les vecteurs néogénine ADNc ou les vecteurs shRNA néogénine-ciblage ont été micro - injecté dans les zygotes 2-PN et les blastocystes obtenus ont été soumis à une immunocoloration avec des anticorps anti-néogénine pour mesurer le niveau d'expression néogénine. Dans le panneau supérieur, néogénine ciblage shRNA a été injecté. Blastocystes ont été immunocolorées avec des anticorps anti-néogénine (rouge). GFP, protéine fluorescente verte (vert); Fusionné, superposition de DAPI, anti-néogénine et GFP. Dans le panneau inférieur, les vecteurs d'ADNc néogénine ont été microinjection. Blastocystes ont été immunocolorées avec des anticorps anti-néogénine (vert). coloration nucléaire DAPI, DAPI (bleu); DP, la protéine fluorescente rouge (rouge); Fusionné, surimposition de DAPI, RFP, et anti-néogénine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5: Effets de la perte ou du gain néogénine sur le développement embryonnaire. 2-PN embryons de souris ont été microinjection soit avec de l'ARN en épingle à cheveux petite (shRNA) ciblant néogénine (néogénine perte) ou avec des vecteurs hébergeant néogénine ADNc (gain néogénine) et ont été cultivées jusqu'à atteindre le stade de blastocyste. Pour différencier la perte néogénine à partir d'embryons de gain néogénine, GFP et RFP ont été co-exprimées, respectivement. Contraste de phase images d'embryons à différents stades de développement sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6: néogénine surexpression Favors ICM Différenciation Les cellules (A) de l' ICM en blastocystes ont été vu par immunocoloration pour Oct3 / 4.. DAPI a été utilisé pour stadans le noyau. (B) Le nombre de cellules ICM / 4-positif Oct3 dans un blastocyste de contrôle, perte néogénine, et les embryons de gain néogénine sont représentés comme la moyenne ± écart - type de trois expériences indépendantes avec au moins 10 embryons utilisés dans chaque expérience. * Des différences significatives de contrôle à p <0,05 par t la -test de Student. (C) Analyse par RT-PCR d'Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2 et Tead4 mARN à partir de blastocystes de la perte néogénine, le gain néogénine, et les embryons témoins. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1: Séquences des amorces et des conditions de PCR utilisées pour la RT-PCR.

Tableau 2: Nombre de survivants embryons de souris à chaque stade de développement après avoir reçu néogénine shRNA ou néogénine ADNc au stade 2-PN.

Discussion

Dans le présent protocole, nous démontrons de nouvelles méthodes de microinjection du matériel génétique, soit l'ADNc ou shRNA, dans les embryons 2-PN souris pour explorer le rôle de néogénine dans la différenciation cellulaire précoce au cours de l'embryogenèse de la souris. La modification génétique des embryons préimplantatoires est une technique puissante dans la découverte des informations clés sur les mécanismes sous-jacents moléculaires pour, par exemple, la première détermination de la lignée cellulaire. La modification génétique est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer la fonction des gènes. Avec relativement grande receptibility des embryons 2-PN pour le matériel génétique étranger et la faisabilité de microinjection d'ADNc et shRNA dans les embryons 2-PN, cette technique de manipulation de l'embryon peut être mis en œuvre avec une perturbation physique minimale à l'embryon, sans parler de la valeur intrinsèque complémentarité associée à cette manipulation génétique.

Considérant que l'injection cytoplasmique est plus facile et moins préjudiciableà la survie que l'injection nucléaire, mais néanmoins une plus forte expression de l'ADN étranger associé à l'injection nucléaire, une amélioration qui doit être souligné est l'utilisation d'une centrifugation pour positionner les pronuclei avant que la micro-injection dans le noyau. L'étape la plus techniquement exigeant et sophistiqué est le microinjection d'ADN étranger dans le pronucleus d'un ovule fécondé. Cette étape est critique et nécessite une maîtrise technique considérable et une formation poussée pour maîtriser la procédure de microinjection. Une fois que cette compétence est acquise cependant, la variabilité et les erreurs techniques deviennent minimes. La survie de routine d'embryons microinjection est comprise entre 80-90% dans notre établissement.

A la différence de cette étude, d'autres chercheurs positionnés embryons en maintenant la pipette de telle sorte qu'un pronucleus près de la membrane plasmatique était proche de la microaiguille. La micro-aiguille est ensuite insérée dans le pronucleus ^10,11. Nous avons connu quelques difficultés à visualiser le pronoyau correctement sous le microscope sans centrifugation. De toute évidence, la centrifugation amène le noyau à proximité de la membrane du plasma pour une meilleure identification. Dans le même temps, il devrait y avoir une certaine marge d'amélioration pour une meilleure visualisation ainsi un meilleur positionnement du pronucleus.

Contrairement à la production de souris transgéniques, notre protocole pour la microinjection de plasmides dans des embryons est une transfection transitoire par nature, et donc approprié pour disséquer la fonction des gènes au cours du développement embryonnaire préimplantatoire. Par conséquent, notre protocole pour une technique et déficitaire gagner de fonction pourraient encore être généralisées pour identifier des molécules impliquées dans le développement embryonnaire précoce de signalisation.

En outre, la signalisation néogénine pourrait être très bénéfique pour le développement de lignées de cellules souches embryonnaires, étant donné que néogénine et ses ligands sont susceptibles d'améliorer les facteurs de transcription spécifiques des cellules souches telles que Oct3 / 4, Sox2, et Nanog.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
M16 medium,	Gibco BRL (Grand Island, NY)	M7292 LOT# 11A832
Goat serum,	Dako (Glostrup, Denmark)	X0907
PMSG	Folligon, Intervet, Holland	G4877-1000IU LOT#SLBD0719V
Mineral oil	Sigma Aldrich	CG5-1VL LOT# SLBC6783V
human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin	(Intervet, Holland)	(invitrogen , 15596-026)
SuperScript® III Reverse Transcriptase	lifetechnologies	18080-044
PCR pre mixture	(Bioneer, Daejon, S. Korea)	GenDEPOT , A0224-050
Agarose (molecular grade)	BioRad	161-3101
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix USA	19943
polyclonal rabbit anti-neogenin antibody	Santa Cruz Biotechnology, US	SC-15337
Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A-11094
Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A-21428
Alexa Fluor® 555 Phalloidin	Molecular Probes (Invitrogen, USA)	A34055
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen, USA	D1306
Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin	R&D systems	3720-RG
all plasmid constructs	Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA).		for the present studies were kindly provided by
Neon®  Transfection System	lifetech	MPK10096
Stereo Microscrope	Nikon	SMZ1000
Micromainpulation system with Nikon	Nikon	Narishige ONM-1
Micro Injector	Nikon Narishige	GASTIGHT #1750
Holder	Nikon Narishige	Narishige IM 16
Microfuge	Nikon Narishige	Narishige MF-900
grinder	Narishige	EG400
Puller	Sutter Instrumnet company	P-97
CO2 incubator	Thermo Scientific Forma	EW-39320-16
Veriti® 384-Well Thermal Cycler	lifetechnologies	4388444