Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف loss- وكسب من طريقة وظيفة التي تنطبق على تحديد neogenin بمثابة مستقبلات مرحلة معينة أن يؤدي إلى الأديم الظاهر الغاذي والخلايا الداخلية التمايز الشامل في الأجنة قبل الغرس الماوس.
Introduction
سابق للانغراس التطور الجنيني يمكن تقسيمها إلى عدة مراحل متميزة، من مرحلة خلية واحدة إلى تويتة والكيسة. وتشير أدلة كثيرة على أن الاستقطاب والعظة الموضعية تلعب دورا في أوائل تقرير مصير الخلية إلى الأديم الظاهر الغاذي (TE) وكتلة الخلايا الداخلية (ICM). ومع ذلك، فإن طبيعة العظة، وكيف transduced أنها في الإشارات الخلوية، والسياقات الفسيولوجية التي يمكن لهذه الإشارات هي قادرة على الشروع في خلية النسب التمايز ليست معروفة. هذه الخلايا المتمايزة ثم الخضوع التخصص، بدأت تأخذ على هياكل مميزة والوظائف اللازمة للجنين تشكيل السليم ونمو المشيمة 1-3.
الأجنة ما قبل الزرع قابلة جدا للتلاعب عن طريق الحقن المباشر للمواد الجينية المعدلة مثل سيرنا أو كدنا] الهدف، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة الجزيئات المستهدفة المحددة. هناك فهم متزايد بأن الوراثيةتحليل للأجنة الفقاريات أمر بالغ الأهمية لتعزيز فهمنا من التطور الجنيني 4. مقدمة الدقيق للجينات من النوع البري أو شكل متحولة إلى الجنين في سياق الوقت المناسب لإنجاز gain- أو الخسارة من وظيفة الجين قد سهلت كثيرا من دراسة الجينات ينظم تنمويا. Loss- وكسب من وظيفة عبر Microinjection من المواد الوراثية في الأجنة غير الثدييات والثدييات الفردية في وقت مبكر هو بسيط نسبيا بسبب حجمها الكبير والتقبل الكبير 5. وعادة ما يتم إجراء حقن مكروي باستخدام ناقلات غير الفيروسية. وقد اتخذت ميزة خاصة من سهولة استخدام ناقلات غير الفيروسية عبر ناقلات فيروسية والجينات المحورة. وقد وضعت loss- السريع أو تحقيق مكاسب من وظيفة نظام التعبير في أجنة الفئران التي تسمح لنا لتشريح وفهم وظائف الجينات في الأجنة الفقارية 6،7.
أن وضع العلامات الفلورية الأجنة يسهل إلى حد كبير في اختيار ميكرoinjected أو وراثيا التلاعب الأجنة، وفي الوقت نفسه منح وسيلة لقياس غير مباشر على مستوى التعبير سيرنا microinjected أو كدنا] على أساس كثافة الفلورسنت 8. لإنجاز هذه العلامات، فلوري كدنا] بروتين، GFP أو طلب تقديم العروض، هي شارك في حقن إما يبني الانصهار أو على حدة. كثافة مضان من GFP أو طلب تقديم العروض تكشف عن مدى تعبير عن سيرنا أو الحمض النووي الأجانب لضمان أن loss- أو الحصول على وظيفة، وقد تم إنجازه.
هنا، نقدم بروتوكول المجهرية لloss- والكسب وغالبا تقنية وظيفة التي سمحت لنا لتحديد neogenin بمثابة مستقبلات أن التبديلات العظة خارج الخلية مهمة في تمايز الخلايا في وقت مبكر من الأجنة قبل الغرس الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات اللازمة لتربية الحيوانات وهموم وفقا للوائح IACUC جامعة Sahmyook، سيول، كوريا الجنوبية.
1. فرط الإباضة، تربية وعزل قناة البيض
- الحفاظ الفطرية C57BL / 6 الفئران وفقا للشروط التالية: 22 ± 3 درجة مئوية، ~ 60٪ الرطوبة 12 ساعة ضوء / دورة الظلام، والماء والغذاء الإرضاع بحسب الرغبة.
- حمل فرط الإباضة من إناث الفئران القديم أسابيع 3-5 عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية فرس الحامل موجهة الغدد التناسلية المصل (PMSG) في 0.1 مل / رئيس جاء بعد 48 ساعة عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) في 0.1 مل /رئيس.
- مباشرة بعد الحقن قوات حرس السواحل الهايتية، تتزاوج الإناث الناجم عن فرط الإباضة مع الذكور الناضجة جنسيا من نفس السلالة من خلال ابقائها في نفس القفص بين عشية وضحاها.
- صباح اليوم التالي، تأكيد التزاوج الناجح من خلال وجود المكونات التزاوج أو المكونات المهبل على المسالك التناسلية للإناث.
- تضحية إناث الفئران الحواملبواسطة CO 2 التسمم تليها عنق الرحم التفكك 18-20 ساعة بعد الحقن قوات حرس السواحل الهايتية.
- فتح تجويف البطن عن طريق قطع الجلد ثم طبقة البريتوني مع مقص غرامة.
- التقاط قرون الرحم مع ملقط غرامة وسحب بعيدا الرحم، قناة البيض، المبيض، وسادة من الدهون بلطف من تجويف الجسم.
- قطع المنطقة الواقعة بين قناة البيض والمبيض مع مقص غرامة. إعادة ملقط وقطع الرحم بالقرب من قناة البيض، وترك 1 سم على الأقل من الجزء العلوي من الرحم المرفقة.
- نقل أمبولة بوقي إلى 35 مم طبق بتري تحتوي M16 المتوسطة في درجة حرارة الغرفة. تجمع ناقلة البيضات من الفئران عدة في نفس الطبق.
- ضع الأطباق تحت مجهر تشريحي لاسترجاع الأجنة.
2. استرجاع وثقافة 2-Pronuclear (2-PN) الأجنة
- قطع نهاية 30 أو 32 G إبرة تحت الجلد، طحنها إلى طرف غير حادة، واستخدامه بمثابة إبرة التنظيف.
- استعمالملقط غرامة لتنزلق نهاية قناة البيض على إبرة التنظيف. اضغط بلطف على رأس الإبرة بيغ ضد أسفل الطبق ليثبت في مكانه. طرد قناة البيض مع ~ 0.1 مل من M16 المتوسطة للافراج عن الأجنة 2-PN في طبق بيتري.
- استرداد الأجنة 2-PN جنبا إلى جنب مع توضيح الجماهير الركامية من المتوسط M16 مسح تحت مجهر تشريحي باستخدام ماصة زجاجية معقمة ونقلها إلى طبق بيتري جديد.
- فصل الخلايا الركامية من الأجنة 2-PN عن طريق الهضم الأنزيمي مع 1.0 مل من 0.1-0.5٪ هيالورونيداز في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقيقة.
- تعرية الأجنة عن طريق pipetting بلطف مع ماصة الزجاج وإزالة المادية الخلايا الركامية.
- غسل الأجنة الجرداء ثلاث مرات مع 30-50 مل من الطازجة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في الجنين.
- احتضان الأجنة في 35 مم البلاستيك طبق بيتري في وسائل الإعلام M16 تستكمل مع 10 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA، Fractأيون V) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 في حاضنة ترطيب حتى يتم إجراء حقن مكروي، التي عادة ما تكون بعد أقل من 4 ساعات.
3. الأجنة النسخ العكسي (RT) وتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)
- جمع لا يقل عن 10 الأجنة من كل مرحلة وصولا إلى مرحلة الكيسة الأريمية وتجميع لهم في 4.0 ميكرولتر من 5X عكس الناسخ حل قبل مزيج يحتوي على إنزيم النسخ العكسي، ريبونوكلياز المانع، بنسبة ضئيلة DT التمهيدي، 6mers عشوائي، خليط dNTP، ورد فعل العازلة في PCR أنبوب.
- إضافة ريبونوكلياز خالية المقطر H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 20 ميكرولتر ويصوتن الأجنة المجمعة لمدة 30 ثانية في 200 دبليو الشروع في رد فعل RT فورا في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة يليها 5 دقائق حضانة في درجة حرارة 95 درجة مئوية.
- لكل 5.0 ميكرولتر من محلول كدنا] ولدت، إجراء طبيعي PCR التضخيم مع الاشعال لneogenin، Cdx2، Sox2، Tead4، NANOG، Oct3 / 4، أو β-الأكتين (تسلسل التمهيدي الواردة في الجدول 1. PCR يتكون من 40 دورات من الحضانة 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في درجة حرارة الصلب (كما هو موضح في الجدول رقم 1)، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية.
- المنتجات PCR منفصلة من قبل الكهربائي على هلام الاغاروز 2٪ وتصور هلام تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بعد تلطيخ مع بروميد إيثيديوم.
- تطبيع التعبير الجيني الهدف ضد مستويات β أكتين.
4. سيتولوجية مناعية من الأجنة
- إصلاح الأجنة من كل مرحلة مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها غسل وجيزة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ BSA.
- الأغشية Permeabilize الخلية التي يحتضنها 10 الأجنة في 1.0 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ توين 20 و 0.1٪ TritonX-100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- لمنع انوعي ملزمة احتضان الأجنة permeabilized في 1.0 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 10٪ مصل الماعز العادي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان سدت الأجنة خفة دمح أرنب أضداد neogenin في 1: 100 التخفيف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- بعد ثلاثة يغسل لمدة 30 ثانية في كل من قطرات من برنامج تلفزيوني، واحتضان الأجنة مع إما اليكسا 488 مترافق مفتش الماعز المضادة للأرنب أو اليكسا 568 مترافق مفتش الماعز المضادة للأرنب في 1: 500 التخفيف في حل PBS / جيش صرب البوسنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية .
- لتصور خيوط الأكتين، واحتضان الأجنة في 1 ميكروغرام / مل phalloidin في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- وصمة عار في نوى بإضافة 5 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ميكروغرام / مل دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole، هيدروكلوريد) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الأجنة ثلاث مرات لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني.
- نقل الأجنة إلى شريحة زجاجية وغطاء لهم مع قطرة من الزيوت المعدنية.
- التقاط صور في 1،000X التكبير مع المجهر متحد البؤر مع الإثارة من طول موجة المناسب.
5. إعداد Neogenin-طلب تقديم العروض وNeogenin سيرنا GFP البلازميدات
- الفرعيةاستنساخ [كدنا ترميز neogenin الماوس إلى بروتين أحمر فلوري (RFP) المحتوية على ناقلات، مما أدى إلى neogenin العلم، طلب تقديم العروض.
- Subclone صغير دبوس الشعر RNA تستهدف neogenin إلى البروتين الأخضر الزمردي نيون (EmGFP) المحتوية على ناقلات، مما أدى إلى pcDNA-EmGFP-مير neogenin (كما هو موضح في الشكل رقم 1).
- تضخيم كلا neogenin العلم، طلب تقديم العروض والبلازميدات pcDNA-EmGFP-مير neogenin وتنقية بينها وبين الطرق التقليدية.
- ضبط تركيزات النهائي من البلازميدات إلى ~ 1.0 ميكروغرام / مل في المخزن العقيمة تريس، EDTA (TE).
6. Microinjection من البلازميدات إلى 2-PN الأجنة
- غسل الجرداء 2-PN الأجنة مرة واحدة، لفترة وجيزة، مع وسائل الاعلام M16 جديدة.
- أجهزة الطرد المركزي الأجنة 2-PN لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي للسماح للمراقبة من pronuclei.
- احتضان الأجنة في انخفاض الجزئي من 20-30 ميكرولتر من وسائل الإعلام M16 في جنين تحت الزيوت المعدنية عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 لadditiاونال 1-2 ساعة.
- تصنيع ماصات الحقن وماصات عقد عن طريق سحب أنابيب البورسليكات الزجاج الشعرية (OD = 1.2 مم؛ ID = 0.94 ملم) مع مجتذب الميكانيكية.
- تلفيق الماصات الحقن لديك نصائح صريحة وفتحات مصقول من <500 ميكرون طول الحافة و1-2 ميكرون قطر الحافة الداخلية باستخدام microgrinder وmicroforger.
- افتعال عقد ماصات مثل أن لديهم نصائح صريحة وفتحات مصقول مع قطرها الداخلي 20 ميكرون ويبلغ قطرها الخارجي من 100 ميكرون.
- ماصات حقن الحمل مع كمية كافية (> 200 نيكولا لانغ) من الحل البلازميد عند 1.0 ميكروغرام / ميكرولتر.
- Microinject ~ 10 رر من الحل البلازميد لكل جنين 2-PN إلى واحدة من pronuclei باستخدام microinjector تعلق على micromanipulator بمحركات. خلال هذه العملية، والحفاظ على الأجنة في الموقف من خلال تطبيق الضغط السلبي مع ماصة القابضة.
- بعد حقن مكروي، وغسل الأجنة 2-PN 3 مرات مع وسائل الاعلام M16 جديدة للتروفاق سطيف من 1 دقيقة في كل مرة.
- ثقافة الأجنة 2-PN في قطرة من وسائل الاعلام M16 جديدة على طبق ثقافة البلاستيك التي كتبها قطرة الزيت المعدني لمنع التبخر وسائل الإعلام تغطيتها.
- مراقبة الأجنة في 24 فترات ساعة تحت المقابل تدخل الفرق (DIC) مجهر مقلوب في 200X التكبير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
اكتشفنا وأعرب عن أن neogenin عابر خلال مراحل النمو المبكرة للأجنة قبل الغرس الماوس، والتي تظهر في وقت مبكر في مرحلة 2-الخلية وتستمر لحين تويتة في وقت مبكر ولكن أن تصبح ناقصة في أواخر تويتة ومراحل الكيسة الأريمية (الشكل 2A). وبالإضافة إلى ذلك، اقتصر التوزيع المكاني للneogenin أساسا إلى خارج الخلايا. وكانت نتائج تحليل RT-PCR تتناسب مع طبيعة المبكرة وعابرة التعبير neogenin، وتبلغ ذروتها في مرحلة 4 خلايا ولكنها تفتقر تماما في المرحلة 16 خلية أو في وقت لاحق (الشكل 2B). على النقيض من ذلك، فإن F-الأكتين لم يكشف عن مثل هذا النمط التعبير عابرة والاستقطاب.
ونحن التحقيق المقبل ما إذا كانت مستويات neogenin يمكن التلاعب بها من قبل Microinjection من أي ناقلات neogenin كدنا] (ربح neogenin) أو ناقلات إيواء shRNA استهداف neogenin (neogenin لوسق) في البيضة الملقحة 2-PN. للتمييز بصريا مكاسب neogenin من فقدان neogenin، طلب تقديم العروض وكانت GFP المشارك أعرب كمؤشرات (الشكل 3)، وما ينجم عنها من neogenin مستوى التعبير وأكد كل من المناعي وimmunoblotting (الشكل 4).
ويبين الشكل 5 صور تمثيلية من الأجنة في كل مرحلة بعد تلقي إما neogenin shRNA أو neogenin كدنا] في المرحلة 2-PN. لا توجد فروق شكلية الجسيمة الواضحة بين فقدان neogenin والأجنة مكاسب neogenin، وعدم وجود اختلافات محتملة التنموية على الأقل حتى مرحلة الكيسة الأريمية (الجدول 2). في الواقع، كان كل من عدد الباقين على قيد الحياة الأجنة في كل مرحلة وعدد الأجنة القبض لا يختلف كثيرا.
ومع ذلك، تم تطوير ICM أقل وضوحا في فقدان neogenin من neogenin الأجنة مكاسب كمايتضح من التعبير أعلى من ICM محددة Oct3 / 4 في الأجنة مكاسب neogenin (الشكل 6A) وارتفاع أعداد الخلايا ICM Oct3 / 4 الإيجابية في الكيسة في كسب neogenin من الأجنة فقدان neogenin (الشكل 6B). وعلاوة على ذلك، كشف تحليل RT-PCR وجود علاقة قوية بين مستوى التعبير من ثلاثة عوامل النسخ، وأنه من neogenin. في الكيسات الأريمية فقدان neogenin، والقليل Oct3 / 4، تم الكشف عن Sox2، وNANOG، والتي هي في تناقض حاد مع زيادة كبيرة في التعبير عن كل عوامل النسخ الثلاث في كسب neogenin على الأجنة سيطرة (الشكل 6C). بشكل غير متوقع، ومستويات التعبير عن Cdx2 وTead4، عوامل النسخ المتورطين في TE التمايز / صيانة 6،7، كانت أقل تأثرا مستوى التعبير من neogenin والتأكد من صحتها أن يصل تنظيم neogenin يؤدي إلى تفعيل المنظمين النسخي محددة لICM لكن ليس لإنشاء الشركة المصرية للاتصالات. جميع البيانات المعروضة هي م odified من الإشارة 9.
الشكل 1: بنية pcDNA-EmGFP-مير neogenin. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير عن Neogenin خلال الماوس التنمية الجنينية (A) وصور مجهرية متحد البؤر التعبير neogenin في الأجنة سابق للانغراس في مراحل النمو المختلفة. (ب) عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل من neogenin مرنا في الأجنة سابق للانغراس في مراحل النمو المختلفة. β-الأكتين وتستخدم الرقابة الداخلية.96fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وبروتين أحمر فلوري (RFP) التعبير كمؤشرات لNeogenin الخسارة وNeogenin كسب على التوالي بعد حقن مكروي من shRNA ناقلات استهداف neogenin إيواء GFP مترافق أو Microinjection من ناقلات كدنا] neogenin إيواء طلب تقديم العروض إلى وتصور 2-PN بيضات ملقحة، والتعبير عن GFP وطلب تقديم العروض تحت المجهر مضان في المراحل 2-الخلية و4 خلايا. اللوحة اليسرى، والصور على النقيض من المرحلة. لوحات المتوسطة واليمين، والصور مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: التعبير عن Neogenin في الكيسة بعد Microinjection من إما shRNA استهداف Neogenin أو Neogenin كدنا] (A) بعد حقن مكروي من shRNA ناقلات استهداف neogenin إلى بيضات ملقحة 2-PN، تم تقييم مستوى التعبير من neogenin في الخلايا الكيسة الفردية المناعية مع الأجسام المضادة ضد العلم. في اللوحة اليسرى، سارعت neogenin تم microinjected ناقلات shRNA (مراقبة). في اللوحة اليمنى، تم microinjected ناقلات shRNA استهداف neogenin. دابي، كانت تستخدم دابي (الأزرق) وصمة عار على نواة. ضد العلم، والتصور للعلامة العلم على neogenin (الأحمر)؛ GFP والبروتينات الفلورية الخضراء (الأخضر)؛ اندمجت، استعلاء دابي، ضد العلم، وGFP. (ب) وimmunoblotted لست] خلية كاملة من الكيسات الأريمية مع الأجسام المضادة ضد العلم. وقد استخدم GFP كعنصر تحكم التحميل. تدافعت shRNA، سارعت neogenin حقن shRNA. نانوغرام shRNA، التي تستهدف neogenin shRNA injec نشوئها. تم microinjected (C) وناقلات neogenin كدنا] أو ناقلات shRNA استهداف neogenin في بيضات ملقحة 2-PN وتعرضوا للالكيسات الأريمية مما أدى إلى المناعية مع أضداد neogenin لقياس مستوى التعبير neogenin. في لوحة العلوي، تم حقن تستهدف neogenin-shRNA. و immunostained الكيسات الأريمية مع أضداد neogenin (الحمراء). GFP والبروتينات الفلورية الخضراء (الأخضر)؛ اندمجت، استعلاء دابي، ومكافحة neogenin، وGFP. في اللوحة السفلى، وmicroinjected ناقلات كدنا] neogenin. و immunostained الكيسات الأريمية مع أضداد neogenin (الخضراء). تلطيخ النووي دابي، دابي (الأزرق)؛ طلب تقديم العروض، أحمر ببروتين (الأحمر)؛ اندمجت، استعلاء دابي، طلب تقديم العروض، ومكافحة neogenin. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
pload / 53696 / 53696fig5.jpg "/>
الرقم 5: آثار Neogenin خسارة أو ربح من التطور الجنيني. تم microinjected 2-PN أجنة الفئران إما مع الحمض النووي الريبي الصغيرة دبوس (shRNA) تستهدف neogenin (neogenin الخسارة) أو مع ناقلات إيواء neogenin كدنا] (ربح neogenin) وكان مثقف حتى الوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. للتمييز فقدان neogenin من الأجنة مكاسب neogenin، GFP وطلب تقديم العروض اشتركت فى أعرب، على التوالي. وتظهر الصور من أجنة في مراحل النمو المختلفة على النقيض من المرحلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الحسنات Neogenin Overexpression ICM تمايز الخلايا (أ) ICM في الكيسات الأريمية تم عرضها من قبل المناعية للOct3 / 4: الرقم 6. وقد استخدم دابي لستافي النواة. (ب) ويمثل عدد الخلايا ICM إيجابية 4 / Oct3 في الكيسة السيطرة، وفقدان neogenin، والأجنة مكاسب neogenin كمتوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة مع لا يقل عن 10 الأجنة المستخدمة في كل تجربة. * خلافات كبيرة من السيطرة على ف <0.05 كتبها t -test الطالب. تحليل (C) RT-PCR من Oct3 / 4، Sox2، NANOG، Cdx2، وTead4 من mRNAs من الكيسات الأريمية من فقدان neogenin، وزيادة neogenin، والأجنة السيطرة. β-الأكتين وتستخدم الرقابة الداخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: متواليات من الترب و شروط PCR تستخدم لRT-PCR.
الجدول 2: عدد الباقين على قيد الحياة أجنة الفئران في كل مرحلة التطوير بعد تلقي Neogenin shRNA أو Neogenin كدنا] في المرحلة 2-PN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح أساليب جديدة للMicroinjection من المواد الجينية، إما كدنا] أو shRNA، إلى الأجنة 2-PN الماوس لاستكشاف دور neogenin في تمايز الخلايا في وقت مبكر خلال مرحلة التطور الجنيني الماوس. التعديل الوراثي للأجنة قبل الغرس هي تقنية قوية في الكشف عن المعلومات الأساسية عن الآليات الكامنة الجزيئية ل، على سبيل المثال، أول تقرير خلية النسب. التعديل الوراثي هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا للتحقق من وظيفة الجين. مع استقبالية كبيرة نسبيا من الأجنة 2-PN للمواد الوراثية الأجنبية وجدوى Microinjection من كدنا] وshRNA في الأجنة 2-PN، هذه التقنية الجنين التلاعب يمكن تنفيذها مع اضطراب البدني إلى الحد الأدنى من الجنين، ناهيك عن جوهري التكامل المرتبطة بهذا التلاعب الجيني.
وبالنظر إلى أن حقن حشوية أسهل وأقل ضرراالبقاء على قيد الحياة من حقن النووي لكنها، مع ذلك، تعبير أعلى من الحمض النووي الأجنبية المرتبطة حقن النووي، وتحسين واحدة ينبغي التشديد هو استخدام الطرد المركزي لوضع pronuclei قبل microinjection في النواة. الخطوة الأكثر تطورا من الناحية التقنية وتطالب هي Microinjection من الحمض النووي الأجنبية في طليعة النواة من بويضة مخصبة. هذه خطوة حاسمة وتتطلب مهارة فنية كبيرة وتدريب مكثف لإتقان الإجراء حقن مكروي. مرة واحدة يتم الحصول على هذه المهارة مع ذلك، وتقلب التقني والأخطاء أصبح الحد الأدنى. البقاء على قيد الحياة الروتيني للأجنة microinjected ما بين 80-90٪ في منشأتنا.
وخلافا لهذه الدراسة، وضع باحثون آخرون الأجنة عن طريق عقد ماصة مثل أن طليعة النواة بالقرب من غشاء البلازما كانت قريبة من إبرة مجهرية. ثم يتم إدخال إبرة صغيرة في طليعة النواة 10،11. عانينا من بعض الصعوبة تصور للمحترفيننواة بشكل صحيح تحت المجهر دون الطرد المركزي. ومن الواضح أن الطرد المركزي يجلب ختام نواة لغشاء البلازما لتحديد أفضل. وفي الوقت نفسه، ينبغي أن يكون هناك مجال للتحسين لتحديد المواقع أفضل تصور بالتالي أفضل من طليعة النواة.
وخلافا لإنتاج الفئران المعدلة وراثيا، لدينا بروتوكول ل microinjection من البلازميدات إلى الأجنة هو ترنسفكأيشن عابرة بطبيعتها، وبالتالي مناسبة للتشريح وظيفة الجين خلال التطور الجنيني قبل الغرس. لذلك، لدينا بروتوكول لloss- وتقنية الحصول على وظيفة، يمكن زيادة معممة لتحديد الجزيئات مما يشير تشارك في التطور الجنيني المبكر.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يشير neogenin يكون مفيدا للغاية في تطوير خطوط الخلايا الجذعية الجنينية بالنظر إلى أن neogenin وبروابط لها من المرجح أن يعزز الخلايا الجذعية عوامل النسخ محددة مثل Oct3 / 4، Sox2، وNANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أيضا أن نعترف مجموعة الدكتور شيونغ في جامعة العلوم الصحية جورجيا لتصنيع وتقاسم البنى لneogenin كدنا] وshRNA ناقلات. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A4A01012572) بتمويل من مؤسسة أبحاث الكورية ومنحة بحثية من جامعة Sahmyook.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
