Summary
Målet med denne protokol er at beskrive en underskudsgivende og få-funktion metode, der er anvendelig til at identificere neogenin som en scene-specifik receptor, som fører til trophectoderm og indre cellemasse differentiering i præimplantationsperioden musefostre.
Introduction
Præimplantationsperioden fosterudviklingen kan opdeles i flere særskilte trin, fra en-celle stadiet til morula og blastocyst. Mange beviser tyder på, at polaritet og positionelle signaler spiller en rolle i tidlig celleskæbne bestemmelse i trophectoderm (TE) og den indre cellemasse (ICM). Arten af de tidskoder, hvordan de transducerede til cellulære signaler, og de fysiologiske sammenhænge, hvori sådanne signaler er i stand til at initiere cellelinie differentiering er ikke kendt. Disse differentierede celler derefter undergå specialisering, begyndt at tage på karakteristiske strukturer og funktioner, der er nødvendige for embryo ordentlig dannelse og vækst af moderkagen 1-3.
Præimplantationsembryoner er særligt modtagelige for manipulation ved direkte injektion af modificerede genetiske materialer som siRNA eller target cDNA og således kan anvendes til undersøgelse af specifikke målmolekyler. Der er en voksende forståelse for, at genetiskanalyse af hvirveldyr embryoner er afgørende for at fremme vores forståelse af fosterudviklingen 4. Præcis indførelse af et vildtype-gen eller en mutant form i et embryo i rette sammenhæng at udrette GAIN- eller tab af genets funktion i høj grad har lettet studiet af udviklingsmæssigt regulerede gener. Tabs- og få af funktion via mikroinjektion af genetiske materialer i individuelle tidlige ikke-pattedyr og mammale embryoer er relativt enkel på grund af deres store størrelse og store modtagelighed 5. Mikroinjektion udføres typisk under anvendelse af ikke-virale vektorer. Særlig fordel er taget af den nemme at bruge ikke-virale vektorer i virale vektorer og transgener. En hurtig underskudsgivende eller gevinst af funktion ekspressionssystem i musefostre er blevet udviklet, der giver os mulighed for at dissekere og forstå genfunktioner i hvirveldyr embryologi 6,7.
Fluorescerende mærkning af embryoner ville i høj grad lette udvælgelsen af MICRoinjected eller genetisk manipulerede embryoer og samtidig yde et middel til indirekte at kvantificere ekspressionsniveauet af mikroinjiceres siRNA eller cDNA baseret på fluorescensintensitet 8. For at opnå dette mærkning, fluorescerende protein cDNA, GFP eller RFP, er co-injiceres som enten fusionskonstrukter eller hver for sig. Fluorescensintensiteten af GFP eller RFP afslører omfanget af ekspression af siRNA eller fremmed DNA at sikre, at underskudsgivende eller få af funktion er blevet fuldført.
Her præsenteres en mikromanipulering protokol for underskudsgivende og gain-of-funktion teknik, der tillod os at identificere neogenin som en receptor, som sender ekstracellulære signaler vigtige i begyndelsen af celledifferentiering i præimplantationsperioden musefostre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer for dyreavl og bekymringer blev udført i overensstemmelse med IACUC forskrifter Sahmyook University, Seoul, Sydkorea.
1. superovulation, Avl og æggelederen Isolation
- Oprethold indavlede C57BL / 6-mus under følgende betingelser: 22 ± 3 ° C, ~ 60% fugtighed, 12 timers lys / mørke-cyklus, og vand og foder ad libitum.
- Inducere superovulation af 3-5 uger gamle hunmus ved en intraperitoneal injektion af 5 IU drægtig hoppe-serum gonadotropin (PMSG) ved 0,1 ml / dyr efterfulgt 48 timer senere af en intraperitoneal injektion af 5 IU humant choriongonadotropin (hCG) på 0,1 ml /hoved.
- Umiddelbart efter hCG injektion, mate superovulation-induceret hunner med kønsmodne hanner fra samme stamme ved at holde dem i samme bur natten over.
- Næste morgen, bekræfter vellykket parring ved tilstedeværelsen af et dertil passende stik eller vaginalprop på kvindelige kønsorganer.
- Sacrifice gravid hunmusaf CO 2 forgiftning efterfulgt af cervikal dislokation 18-20 timer efter hCG-injektion.
- Åbne bughulen ved at skære i huden og derefter den peritoneale lag med fine sakse.
- Saml livmoderhornene med fine tænger og trække væk livmoderen, æggeleder, ovarier, og fedt pad forsigtigt fra legemshulen.
- Skær området mellem æggelederen og ovariet med fine sakse. Flyt pincet og skær livmoderen nær æggelederen, idet dog mindst 1 cm i den øvre del af livmoderen vedlagt.
- Overfør oviductal ampulla til en 35 mm petriskål indeholdende M16 medium ved stuetemperatur. Pool æggelederne fra flere mus i samme skålen.
- Placer retterne under et stereomikroskop til hentning af embryoner.
2. Retrieval og kultur af 2-pronukleær (2-PN) Embryoner
- Skær enden af en 30 eller 32 G kanyle, male det til en stump spids, og bruge det som en rødmen nål.
- Brugfine tænger til at skubbe enden af æggelederen på flushing nål. Tryk forsigtigt spidsen af rødmen nål mod bunden af skålen for at holde det på plads. Skyl æggelederen med ~ 0,1 ml M16 medium at frigive de 2-PN embryoer i en petriskål.
- Recover de 2-PN embryoer sammen med omgivende cumulus masserne fra skyllet M16 medium under stereomikroskop ved anvendelse af en steril glaspipette og overføre dem til en ny petriskål.
- Dissociere cumulusceller fra de 2-PN embryoer ved enzymatisk fordøjelse med 1,0 ml 0,1-0,5% hyaluronidase i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) ved 37 ° C i 5-10 min.
- Denude embryoner ved forsigtigt pipettering med et glas pipette og fysisk fjernelse af cumulus celler.
- Vask nøgne embryoner tre gange med 30-50 ml frisk phosphatpufret saltvand (PBS) pr embryo.
- Inkuber embryoner i en 35 mm plastik petriskål i M16-medier suppleret med 10 mg / ml bovint serumalbumin (BSA, FRACTion V) ved 37 ° C i 5% CO2 i en fugtig inkubator indtil mikroinjektion er fremstillet, som er mindre end 4 timer senere.
3. Embryo Reverse Transcription (RT) og polymerasekædereaktion (PCR)
- Saml mindst 10 embryoner fra hver etape op til blastocyststadiet og samle dem i 4,0 pi 5x revers transkriptase forblanding indeholdende revers transkriptase, RNase-inhibitor, oligo dT primer, tilfældige 6mers, dNTP-blanding, og reaktionen buffer i en PCR-rør.
- Tilføj RNase-fri destilleret H2O til et samlet volumen på 20 pi og sonikeres de puljede embryoner i 30 sekunder ved 200 W. Påbegynd RT-reaktionen straks ved 42 ° C i 1 time efterfulgt af 5 minutters inkubering ved 95 ° C.
- For hver 5,0 pi cDNA opløsning genereret, udføre normale PCR-amplifikation med primere til neogenin, CDX2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, eller β-actin (primersekvenser er angivet i tabel 1. PCR består af 40 cycler af 15 sekunder inkubation ved 95 ° C, 30 sekunder ved annealing temperatur (vist i tabel 1), og 30 sekunder ved 72 ° C.
- Separate PCR-produkter ved elektroforese på en 2% agarosegel og visualisere gelen under UV-lys efter farvning med ethidiumbromid.
- Normalize målgenekspression mod p-actin niveauer.
4. Immuncytokemi af embryoner
- Fix embryoner fra hvert trin med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af en kort vask 3 gange med PBS indeholdende 0,01% BSA.
- Permeabilisere Cellemembraner ved inkubering 10 embryoner i 1,0 ml PBS indeholdende 0,1% Tween 20 og 0,1% Triton X-100 ved stuetemperatur i 10 min.
- For at blokere ikke-specifik binding inkuberes de permeabiliserede embryoner i 1,0 ml PBS suppleret med 10% normalt gedeserum i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkubér blokerede embryoner with kanin-anti-neogenin antistoffer ved 1: 100 fortynding i PBS indeholdende 0,1% BSA natten over ved 4 ° C.
- Efter tre vaske i 30 sek hver i dråber af PBS, inkuberes fostre med enten Alexa 488-konjugeret gede anti-kanin IgG eller Alexa 568-konjugeret gede anti-kanin IgG ved 1: 500 fortynding i PBS / BSA-opløsning natten over ved 4 ° C .
- At visualisere actinfilamenter, inkuber embryoner i 1 ug / ml phalloidin i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Farv kernerne ved tilsætning af 5 ml PBS indeholdende 1 pg / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask embryoner tre gange kortvarigt med PBS.
- Overfør embryoner til et objektglas og dække dem med en dråbe mineralolie.
- Tage billeder på 1.000X forstørrelse med et konfokalt mikroskop med en excitation af den passende bølgelængde.
5. Udarbejdelse af Neogenin-RFP og Neogenin-siRNA GFP plasmider
- Subklone cDNA kodende muse neogenin til et rødt fluorescerende protein (RFP) -holdige vektor, hvilket resulterer i neogenin-flag-RFP.
- Subklone lille hårnål RNA målretning neogenin i en Emerald grønt fluorescerende protein (EmGFP) -holdige vektor, hvilket resulterer i pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin (vist i figur 1).
- Forstærk både neogenin-flag-RFP og pcDNA-EmGFP-miR-neogenin plasmider og rense dem med konventionelle metoder.
- Juster slutkoncentrationerne af plasmider til ~ 1,0 ug / ml i sterilt Tris-EDTA (TE) buffer.
6. mikroinjektion af plasmider i 2-PN embryoer
- Vask de blottede 2-PN embryoer gang, kortvarigt, med frisk M16 medier.
- Centrifuger 2-PN embryoner til 10 minutter ved 1.000 xg i en table-top centrifuge for at muliggøre observation af pronuclei.
- Inkubér embryonerne i en mikro dråbe 20-30 pi M16 media per embryo under mineralolie ved 37 ° C i 5% CO2 i en additional 1-2 timer.
- Fremstilling injektion pipetter og holder pipetter ved at trække borsilikat glas kapillar rør (OD = 1,2 mm ID = 0,94 mm) med en mekanisk aftrækker.
- Fabrikere injektion pipetter til at have stumpe tips og polerede åbninger på <500 um spids længde og 1-2 um spids indre diameter bruger microgrinder og en microforger.
- Fabrikere holding pipetter, således at de har stumpe tips og polerede åbninger med en indvendig diameter på 20 um og en ydre diameter på 100 pm.
- Load injektion pipetter med en tilstrækkelig mængde (> 200 nl) af plasmid-opløsning ved 1,0 pg / pl.
- Microinject ~ 10 pl plasmid løsning for hver 2-PN embryo i en af pronuclei bruger mikroinjektor fastgjort til en motoriseret mikromanipulator; under denne proces, holde embryoner i position ved at påføre undertryk med en bedrift pipette.
- Efter mikroinjektion, vaskes 2-PN embryoner 3 gange med frisk M16 medier til less end 1 min hver gang.
- Kultur de 2-PN embryoner i en dråbe frisk M16 medier på en plast dyrkningsskål dækket af en mineralolie slip for at forhindre, at mediet fordampning.
- Overhold embryoner med 24 timers mellemrum under en differential interferens kontrast (DIC) inverteret mikroskop ved 200X forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi opdagede, at neogenin er forbigående udtrykkes i de tidlige udviklingsstadier af præimplantationsperioden musefostre, optræder så tidligt som ved 2-celle stadiet og varig indtil begyndelsen morula men bliver mangelfuld på det sene morula og blastocyst stadier (figur 2A). Desuden blev den rumlige fordeling af neogenin begrænset hovedsagelig til eksterne celler. Resultaterne af RT-PCR-analyse stemte overens med den tidlige og forbigående karakter neogenin ekspression og toppede ved 4-celle stadiet, men helt mangler ved 16-celle stadiet eller senere (figur 2B). Derimod havde F-actin ikke afsløre sådan forbigående og polariseret ekspressionsmønster.
Derefter undersøgte vi, om neogenin niveauer kan manipuleres ved mikroinjektion af enten neogenin cDNA vektorer (neogenin gain) eller vektorer huser shRNA målrettet neogenin (neogenin loser) i 2-PN zygote. For visuelt skelne neogenin gevinst fra neogenin tab, RFP og GFP blev co-udtrykt som indikatorer (figur 3), og den resulterende neogenin ekspressionsniveauet blev bekræftet både ved immunofluorescens og ved immunoblotting (figur 4).
Figur 5 viser repræsentative billeder af embryoner på hvert trin efter at have modtaget enten neogenin shRNA eller neogenin cDNA ved 2-PN scenen. Der var ingen synlige grove morfologiske forskelle mellem neogenin tab og neogenin gain embryoner, og ingen udviklingsmæssige potentielle forskelle i det mindste indtil blastocyst-stadiet (tabel 2). Faktisk både antallet af overlevende embryoner i hver fase og antallet af arresterede embryoner var ikke signifikant forskellige.
Imidlertid blev ICM udvikling mindre udtalt i neogenin tab end neogenin gain fostrefremgår af en højere ekspression af ICM-specifikke Oct3 / 4 i neogenin gain embryoner (figur 6A) og ved højere antal Oct3 / 4-positive ICM celler pr blastocyst i neogenin gevinst end neogenin tab embryoner (figur 6B). Desuden RT-PCR-analyse afslørede en stærk korrelation mellem ekspressionsniveauet af tre transkriptionsfaktorer og af neogenin. I neogenin tab blastocyster, lille Oct3 / 4, Sox2, og Nanog blev påvist, hvilket står i skarp kontrast til en betydelig stigning i ekspressionen af alle tre transkriptionsfaktorer i neogenin gevinst i forhold til kontrol embryoer (Figur 6C). Uventet ekspressionsniveauerne af CDX2 og Tead4, transkriptionsfaktorer impliceret i TE differentiering / vedligeholdelse 6,7, blev mindre påvirket af ekspressionsniveauet af neogenin, validere, at opregulering af neogenin fører til aktivering af transkriptionelle regulatorer specifikke for ICM men ikke for TE etablering. Alle viste data er m odified fra henvisning 9.
Figur 1: Struktur pcDNA-EmGFP-miR-neogenin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Ekspression af Neogenin Under mus embryonale udvikling (A) Konfokal mikroskopiske billeder af neogenin udtryk i præimplantations embryoner på forskellige udviklingsstadier. (B) Revers transkription polymerasekædereaktion af neogenin mRNA i præimplantations embryoner på forskellige udviklingsstadier. β-actin blev anvendt som en intern kontrol.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Grønt fluorescerende protein (GFP) og Red fluorescerende protein (RFP) Udtryk som indikatorer for Neogenin Tab og Neogenin Gain henholdsvis Efter mikroinjektion af en neogenin målretning shRNA vektor huser konjugeret GFP eller mikroinjektion af en neogenin cDNA vektor huser RFP ind 2-PN zygoter, ekspressionen af GFP og RFP blev visualiseret under et fluorescensmikroskop ved 2-celle og 4-celle stadier. Venstre panel, fase-kontrast billeder; midterste og højre paneler, fluorescens billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Ekspression af Neogenin i en blastocyst Efter mikroinjektion af enten shRNA Targeting Neogenin eller Neogenin cDNA (A) Efter mikroinjektion af en neogenin-targeting shRNA vektor i 2-PN zygoter blev ekspressionsniveauet af neogenin i individuelle blastocyst-celler vurderet ved immunfarvning med anti-fLAG-antistoffer. I venstre panel, krypteret neogenin shRNA vektorer blev mikroinjiceret (kontrol). I højre panel, blev neogenin målretning shRNA vektorer mikroinjiceret. DAPI, DAPI (blå) blev anvendt til at farve kernen; Anti-flag, visualisering af flag tag på neogenin (rød); GFP, grønt fluorescerende protein (grøn); fusioneret, overlejring af DAPI, anti-flag, og GFP. (B) Hele cellelysater af blastocyster blev immunoblottet med anti-FLAG-antistoffer. GFP blev anvendt som en loading kontrol. Scrambled shRNA, krypteret neogenin shRNA injektion; Ng shRNA, neogenin målretning shRNA injec tion. (C) De neogenin cDNA vektorer eller de neogenin-targeting shRNA vektorer blev mikroinjiceret i de 2-PN zygoter og de resulterende blastocyster blev underkastet immunfarvning med anti-neogenin antistoffer til måling neogenin ekspressionsniveau. I det øverste panel, blev neogenin målretning shRNA injiceres. Blastocyster blev immunfarvet med anti-neogenin antistoffer (rød). GFP, grønt fluorescerende protein (grøn); Fusioneret, overlejring af DAPI, anti-neogenin, og GFP. I den nederste panel, blev neogenin cDNA vektorer mikroinjiceret. Blastocyster blev immunfarvet med anti-neogenin antistoffer (grøn). DAPI, DAPI nuklear farvning (blå); RFP, rødt fluorescerende protein (rød); Fusioneret, overlejring af DAPI, RFP, og anti-neogenin. Klik her for at se en større version af dette tal.
pload / 53.696 / 53696fig5.jpg "/>
Figur 5: Virkninger af Neogenin Tab eller Gevinst ved fosterudvikling. 2-PN museembryoer blev mikroinjiceret enten med lille hårnål RNA (shRNA) målretning neogenin (neogenin tab) eller med vektorer huser neogenin cDNA (neogenin gevinst) og blev dyrket indtil den når blastocyststadiet. For at differentiere neogenin tab fra neogenin gain embryoner, GFP og RFP blev co-udtrykt henholdsvis. Fase-kontrast billeder af fostre på forskellige udviklingsstadier, vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Neogenin Overekspression favoriserer ICM Differentiering (A) ICM celler i blastocyster blev set af immunfarvning for Oct3 / 4.. DAPI blev anvendt til stai kernen. (B) Antallet af Oct3 / 4-positive ICM-celler i en blastocyst af kontrol, neogenin tab, og neogenin gain embryoner er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg med mindst 10 embryoner anvendes i hvert forsøg. * Betydelige forskelle fra kontrol på p <0,05 ved Students t-test. (C) RT-PCR-analyse af Oct3 / 4, Sox2, Nanog, CDX2, og Tead4 mRNA fra blastocyster af neogenin tab, neogenin gevinst, og kontrol embryoer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Sekvenser af primerne og anvendte PCR-betingelser for RT-PCR.
Tabel 2: Antal Surviving Mouse embryoner på Hver Developmental Stage Efter Modtagelse Neogenin shRNA eller Neogenin cDNA ved 2-PN Stage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nærværende protokol, vi demonstrere nye metoder til mikroinjektion af genetisk materiale, enten cDNA eller shRNA, ind i de to-PN museembryoer at udforske rolle neogenin i begyndelsen celledifferentiering under mus embryogenese. Genetisk modifikation af præimplantations embryoer er en kraftfuld teknik at afdække centrale oplysninger om underliggende molekylære mekanismer for, for eksempel, den første celle afstamning beslutsomhed. Genetisk modifikation er en af de mest almindeligt anvendte metoder til sikring genfunktion. Med relativt stor receptibility af de 2-PN embryoner til fremmede genetiske materialer og mulighederne for mikroinjektion af cDNA og shRNA ind i de to-PN embryoner kan denne embryo manipulation teknik implementeres med minimal fysisk forstyrrelse af embryonet, for ikke at nævne den iboende komplementaritet forbundet med denne genetiske manipulation.
I betragtning af at cytoplasmatisk injektion er lettere og mindre skadeligtil overlevelse end nuklear injektion, men ikke desto mindre en højere ekspression af fremmed DNA er forbundet med nuklear indsprøjtning, en forbedring, der skal understreges, er brugen af centrifugering for at placere pronuclei før mikroinjektion ind i kernen. Den mest teknisk avancerede og krævende trin er mikroinjektion af fremmed DNA i pronucleus af et befrugtet æg. Dette trin er kritisk og kræver betydelig teknisk dygtighed og omfattende uddannelse til at mestre mikroinjektion procedure. Når denne færdighed er erhvervet dog teknisk variation og fejl bliver minimal. Den rutinemæssige overlevelse mikroinjicerede embryoer er mellem 80-90% i vores anlæg.
I modsætning denne undersøgelse, andre forskere placeret embryoner ved at holde pipetten således, at en pronukleus nær plasmamembranen var tæt på mikronål. Mikronålesiden indsættes derefter i pronucleus 10,11. Vi oplevede nogle vanskeligheder visualisere prokerne korrekt under mikroskopet uden centrifugering. Det er klart, centrifugering bringer kernen tæt til plasmamembranen for bedre identifikation. Samtidig bør der være plads til forbedring for bedre visualisering dermed bedre positionering af prokernen.
I modsætning til transgene mus produktion, vores protokol til mikroinjektion af plasmider i embryoer er en transient transfektion af natur, og således egnede til dissekere genfunktion under præimplantationsperioden embryonale udvikling. Derfor er vores protokol for et underskudsgivende og få af funktion teknik kunne yderligere generaliseres til at identificere signalmolekyler involveret i den tidlige fosterudvikling.
Desuden kunne neogenin signalering være yderst gavnligt for udviklingen af embryonale stamcellelinjer givet, at neogenin og dets ligander vil sandsynligvis øge stamceller specifikke transkriptionsfaktorer såsom Oct3 / 4, Sox2, og Nanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser til at videregive.
Acknowledgments
Forfatterne vil også gerne anerkende dr Xiong gruppe på Georgia Health Sciences University for produktion og deling af konstruktionerne for neogenin cDNA og shRNA vektorer. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Basic Science Research Program (2013R1A1A4A01012572) finansieret af den koreanske Grundforskningsfond og ved en forskningsbevilling fra Sahmyook University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
