Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לתאר loss- ולהשיג-של שיטת הפונקציה כי הוא ישים לזהות neogenin כמו קולטן בשלב ספציפי שמוביל trophectoderm ותא פנימי בידול המונים עוברי עכברים preimplantation.
Introduction
ההתפתחות העוברית preimplantation ניתן לחלק מספר שלבים ברורים, החל משלב-תא אחד מורולה ואת הבלסטוציסט. עדויות רבות עולה כי הקוטביות רמזים מיקומית לשחק תפקיד בקביעת גורל התא מוקדם לתוך trophectoderm (TE) ואת מסת התאים הפנימית (ICM). עם זאת, האופי של הרמזים, איך הם transduced לאותות הסלולר, וההקשרים הפיסיולוגיים שבו אותות כאלה מסוגלים ליזום בידול שושלת תא אינם ידועות. תאים מובחנים אלה אז עוברים התמחות, החל לקחת על מבנים אופייניים ופונקציות הדרושים להיווצרות נכונה העובר וצמיחה של השליה 1-3.
עוברי אדם במיוחד למניפולציה על ידי הזרקה ישירה של חומרים גנטיים שונים כמו siRNA או cDNA היעד ולכן יכולים להיות מנוצל כדי ללמוד מולקולות מטרה ספציפיות. יש הבנה גוברת כי גנטיניתוח של עוברי החולייתנים הוא קריטי לקידום הבנתנו התפתחות העוברית 4. מבוא מדויק של גן wild-type או צורת מוטציה לעובר בהקשר בזמן להשיג gain- או פסד של פונקציה של הגן מאוד קל בחקר גנים מוסדרים מבחינה התפתחותית. Loss- ולהשיג של פונקציה באמצעות microinjection של חומרים גנטיים לעוברי פרט מוקדמים שאינם יונקים יונקים הוא יחסית פשוט בגלל הגודל שלהם גדול פתיחות רבה 5. Microinjection טיפוסית מבוצעת וקטורים שאינם ויראלי. יתרון מסוים נלקח של קלות השימוש וקטורים שאינם נגיפי מעל וקטורים transgenes ויראלי. Loss- מהירה או רווח של פונקציה במערכת הביטוי עובר עכברים פותחה המאפשרת לנו לנתח ולהבין פונקציות גני אמבריולוגיה חוליות 6,7.
תיוג פלורסנט של עוברי היה מאוד להקל על הבחירה של microinjected או מניפולציות גנטיות עוברים ובאותו זמן להעניק אמצעי לכמת את רמת הביטוי בעקיפין של microinjected siRNA או cDNA מבוסס על עוצמת פלורסנט 8. כדי להשיג תיוג זה, cDNA חלבון פלואורסצנטי, GFP או RFP, הם כמו שיתוף מוזרק או בונה היתוך או בנפרד. עוצמת הקרינה של ה- GFP או RFP החושף את מידת הביטוי של siRNA או דנ"א זר על מנת להבטיח כי loss- או לזכות של פונקציה הושג.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיקרומניפולציה עבור טכניקה פונקציה loss- ורווח-של- שאפשרה לנו לזהות neogenin כמו קולטן המעביר אותות תאיים חשובים התמיינות תאים מוקדם עוברי עכברים preimplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הנהלים לרבייה החי אכפת נערכו בהתאם לתקנות IACUC של Sahmyook אוניברסיטת סיאול, דרום קוריאה.
1. superovulation, גידול ובידוד oviduct
- לשמור על מולדת C57BL / 6 עכברים בתנאים הבאים: 22 ± 3 מעלות צלזיוס, ~ 60% לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, ו כרצונך מים ומזון.
- להשרות superovulation של עכברות בן שבוע 3-5 על ידי זריקה intraperitoneal של גונדוטרופין בסרום סוסה הרה 5 IU (PMSG) ב 0.1 מ"ל / ראש וכעבור 48 שעות על ידי זריקה intraperitoneal של 5 גונדוטרופין כוריוני אנושי IU (hCG) ב 0.1 מ"ל /רֹאשׁ.
- מייד לאחר הזרקת hCG, להזדווג נקבות נגרם superovulation עם זכרים בוגרים מינית מאותו הזן ידי שמירה על אותם באותו הכלוב הלילה.
- למחרת בבוקר, לאשר הזדווגות מוצלחת על ידי הנוכחות של תקע הזדווגות או תוסף נרתיק על בדרכי המין הנשית.
- להקריב עכברות בהריוןשיכרון 2 על ידי ה- CO ואחריו hr 18-20 נקע בצוואר הרחם לאחר ההזרקה hCG.
- פתח את חלל הבטן על ידי חיתוך העור ולאחר מכן שכבת הצפק עם מספריים בסדר.
- תרימי את קרני הרחם עם מלקחיים בסדר למשוך את הרחם, השחלה, השחלה, ואת כרית שומן בעדינות מחלל הגוף.
- חותכים את השטח שבין oviduct ואת השחלה עם מספריים בסדר. מיקום מחדש של מלקחיים ולחתוך הרחם ליד השחלה, משאיר לפחות 1 ס"מ של החלק העליון של הרחם המצורפת.
- מעבירים את ampulla oviductal לצלחת פטרי 35 מ"מ המכיל בינוני M16 בטמפרטורת החדר. לרכז את oviducts מכמה עכברים באותה צלחת.
- מניחים את הצלחות מתחת סטראו לשליפה של עוברים.
2. אחזור והתרבות של 2-Pronuclear (2-PN) עוברים
- חותכים את הקצה של מחט המזרק G 30 או 32, לטחון אותו לתוך קצה קהה, ולהשתמש בו בתור מחט שטיפה.
- להשתמשמלקחיים בסדר להחליק סוף oviduct על מחט שטיפה. לחץ בעדינות את קצה מחט השטיפה נגד התחתון של המנה כדי להחזיקו במקום. שטוף את oviduct עם ~ 0.1 מ"ל של מדיום M16 לשחרר את העוברים 2-PN לתוך צלחת פטרי.
- לשחזר את עוברי 2-PN יחד עם סובבי המונים קומולוס ממדיום M16 הסמוק תחת סטראו בעזרת פיפטה זכוכית סטרילית ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי חדשה.
- לנתק תאי קומולוס מן העוברים 2-PN ידי עיכול אנזימטי עם 1.0 מיליליטר של hyaluronidase 0.1-0.5% ב פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- לערטל העוברים על ידי pipetting בעדינות עם טפטפת זכוכית והסרה פיזית של תאי קומולוס.
- לשטוף עוברי ערומים שלוש פעמים עם 30-50 מיליליטר של תמיסת מלח שנאגר פוספט טרי (PBS) לכל עובר.
- דגירה עוברים בצלחת פלסטיק 35 מ"מ פטרי במדיה M16 בתוספת 10 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום שור (BSA, Fractיון V) על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור humidified עד microinjection הוא עשה, שהיא בדרך כלל פחות מ 4 שעות מאוחר יותר.
3. העובר שעתוק לאחור (RT) ואת תגובת שרשרת פולימראז (PCR)
- אסוף לפחות 10 עוברי של כל שלב עד שלב הבלסטוציסט ובריכת אותם 4.0 μl של 5x הפוכה פתרון transcriptase מראש תערובת המכילה transcriptase הפוכה, מעכב RNase, פריימר dT אוליגו, 6mers אקראי, תערובת dNTP, ואת חיץ התגובה בתוך צינור PCR.
- להוסיף מזוקקים RNase ללא H 2 O ל בהיקף כולל של 20 μl ו sonicate את העוברים ונקווה למשך 30 שניות ב 200 W. ליזום את התגובה RT מיד על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ואחריו הדגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
- עבור כל 5.0 μl של פתרון cDNA שנוצר, לנהל הגברה PCR רגילה עם צבעי יסוד neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, או β-אקטין (רצפים פריימר מתפרסמים בלוח 1. PCR מורכב מ -40 מחזורי דגירה 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 30 שניות בטמפרטורת חישול (שניתן לראות בטבלה 1), ו -30 שניות על 72 מעלות צלזיוס.
- מוצרי ה- PCR נפרד על ידי אלקטרופורזה על ג'ל 2% agarose ולדמיין את הג'ל תחת אור UV לאחר מכתים עם ברומיד ethidium.
- לנרמל ביטוי גן המטרה נגד רמות β-אקטין.
4. Immunocytochemistry של עוברים
- תקן עובר כל שלב עם paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחריו כביסה קצרה 3 פעמים עם PBS המכיל 0.01% BSA.
- קרום התא Permeabilize ידי דוגרים 10 עוברים 1.0 מ"ל של PBS המכיל 0.1% Tween 20 ו -0.1% TritonX-100 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- כדי לחסום ספציפי מחייב דגירה עוברים permeabilized ב 1.0 מ"ל של PBS השלימו עם 10% נסיוב עז נורמלי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירת שנינות עוברת החסומותh ארנב נוגדנים נגד neogenin ב 1: 100 דילול ב PBS המכיל BSA 0.1% לילה בשעה 4 ° C.
- אחרי שלושה שוטף במשך 30 שניות כל בטיפות של PBS, דגירה עוברים גם עם Alexa 488 מצומדות עז IgG נגד ארנב או אלקסה 568 מצומדות IgG נגד ארנב עז ב 1: 500 דילול בתמיסה PBS / BSA לילה ב 4 ° C .
- כדי להמחיש סיבי אקטין, דגירה עוברים 1 מיקרוגרם / מ"ל phalloidin ב PBS עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- הכתם גרעינים ידי הוספת 5 מ"ל PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף עובר שלוש פעמים בקצרה עם PBS.
- העבר עובר לשקופית זכוכית ומכסה אותם עם טיפה של שמן מינרלים.
- קח תמונות בהגדלה 1,000X עם מיקרוסקופ confocal עם עירור של אורך הגל המתאים.
5. הכנת Neogenin-RFP ו Neogenin-siRNA GFP פלסמידים
- תַתלשבט cDNA קידוד העכבר neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) המכילים וקטור, וכתוצאה מכך-RFP neogenin-דגל.
- Subclone RNA סיכת הראש הקטן מיקוד neogenin לתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק ברקת (EmGFP) המכיל וקטור, וכתוצאה מכך pcDNA-EmGFP מיר-neogenin (שמוצג באיור 1).
- להגביר הן פלסמידים neogenin-דגל-RFP ו pcDNA-EmGFP מיר-neogenin ולטהר אותם עם שיטות קונבנציונליות.
- התאם את ריכוזי הסופי של פלסמידים ~ 1.0 מיקרוגרם / מ"ל ב חיץ סטרילי טריס-EDTA (TE).
6. Microinjection של פלסמידים לתוך 2-PN עוברים
- לשטוף את עוברי 2-PN הערום פעם בחטף, עם תקשורת M16 טריה.
- צנטריפוגה עוברים 2-PN במשך 10 דקות XG ב 1000 בצנטריפוגה בטבלה העליונה כדי לאפשר תצפית של pronuclei.
- דגירה עוברת בטיפת מייקרו של 20-30 μl של תקשורת M16 לכל עובר תחת שמן מינרלים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור additihr 1-2 onal.
- ייצור טפטפות הזרקת טפטפות מחזיק ידי משיכת צינור נימי בורוסיליקט זכוכית (OD = 1.2 מ"מ; ID = 0.94 מ"מ) עם חולץ מכני.
- לפברק טפטפות הזריק לקבל טיפים בוטים ופתחים מלוטשים באורך טיפ <500 מיקרומטר ו 1-2 קוטר פנימי טיפ מיקרומטר באמצעות microgrinder וכן microforger.
- לפברק מחזיק טפטפות כאלה שיש להם טיפים בוטים ופתחים מלוטשים בקוטר פנימי של 20 מיקרומטר קוטר חיצוני של 100 מיקרומטר.
- טפטפות הזרקה טען עם כמות מספקת (> 200 nl) של פתרון פלסמיד ב 1.0 מיקרוגרם / μl.
- Microinject ~ 10 pl של פתרון פלסמיד עבור כל העובר 2-PN לאחת pronuclei באמצעות microinjector המצורפת micromanipulator ממונע; במהלך תהליך זה, לשמור עובר במצב על ידי הפעלת לחץ שלילי עם פיפטה מחזיק.
- לאחר microinjection, לשטוף את העוברים 2-PN 3 פעמים עם התקשורת M16 טרי lESS מ -1 דקות בכל פעם.
- תרבות עובר 2-PN בטיפת תקשורת M16 הטרי על צלחת פלסטיק תרבות המכוסית על ידי ירידת שמן מינרלים כדי למנוע אידוי תקשורת.
- שים את העוברים על 24 מרווחי hr תחת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופ הפוכה בהגדלה 200X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גילינו כי neogenin מתבטא זמני במהלך שלבי ההתפתחות המוקדמים של עוברי עכברים preimplantation, המופיע מוקדם ככל בשלב 2 תאים ומתמשך עד מורולה מוקדם אבל הופך לקוי בבית מורולה מאוחר ושלבי הבלסטוציסט (איור 2 א). בנוסף, הפריסה המרחבית של neogenin הוגבלה בעיקר לתאים בחוץ. תוצאות ניתוח RT-PCR היו תואמים את האופי המוקדם וחולפת ביטוי neogenin, לשיא בשלב 4 תאים אבל חסר לחלוטין בשלב 16 התאים או במאוחר (תרשים 2B). לעומת זאת, ה- F- אקטין לא גילה דפוס ביטוי חולף ומקוטבת כזה.
אנחנו הבאים בודקים האם רמות neogenin ניתן להשפיע על ידי microinjection או של וקטורי cDNA neogenin (רווח neogenin) או וקטורי מחסה shRNA מיקוד neogenin (neogenin losים) לתוך הזיגוטה 2-PN. כדי חזותית להבדיל רווח neogenin מנשירת neogenin, RFP ו- GFP היו שיתוף הביע כאינדיקטורים (איור 3), ואת וכתוצאה neogenin רמת הביטוי אושרה הן על ידי immunofluorescence ועל ידי immunoblotting (איור 4).
איור 5 מראה תמונות נציג של עוברים בכל שלב לאחר קבלת או neogenin shRNA או neogenin cDNA בשלב 2-PN. לא היו הבדלים מורפולוגיים ברוטו לכאורה בין אובדן neogenin ועוברים רווח neogenin, ואין הבדלים הפוטנציאל ההתפתחותי לפחות עד שלב הבלסטוציסט (טבלה 2). למעשה, הן את מספר העוברים לשרוד בכל שלב ואת מספר העוברים נעצר לא היו שונים משמעותית.
עם זאת, פיתוח ICM היה פחות בולט לאובדן neogenin מ neogenin עוברים רווח כמושמעיד ביטוי גבוה של ICM הספציפי Oct3 / 4 בעוברי רווח neogenin (איור 6 א) ועל ידי מספרים גבוהים יותר של Oct3 / 4 חיובי תאי ICM לכל הבלסטוציסט ברווח neogenin שאינו עובר אובדן neogenin (איור 6). יתר על כן, ניתוח RT-PCR חשף מתאם חזק בין רמת הביטוי של שלושה גורמי שעתוק וכי של neogenin. בשנת blastocysts אובדן neogenin, מעט Oct3 / 4, Sox2, ו Nanog אותרו, אשר עומדת בניגוד מוחלט לגידול משמעותי בביטוי של שלושת הגורמים שעתוק רווח neogenin מעל עוברים בקרת (איור 6 ג). באופן בלתי צפוי, את רמות הביטוי של Cdx2 ו Tead4, גורמי שעתוק המעורבים בידול TE / התחזוקה 6,7, הושפעו פחות על ידי רמת הביטוי של neogenin, אימות כי עד-רגולציה של neogenin מוביל ההפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים ICM אבל לא עבור הקמת TE. כל הנתונים המוצגים הם מ odified מהתייחסות 9.
איור 1: מבנה pcDNA-EmGFP מיר-neogenin. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. ביטוי של Neogenin במהלך העכבר עוברי פיתוח (א) תמונות מיקרוסקופיות Confocal ביטוי neogenin בעוברי preimplantation בשלבי התפתחותיים שונים. (ב) RT-PCR של mRNA neogenin בעוברים preimplantation בשלבים התפתחותיים שונים. β-תקטין שמש בקרה פנימית.96fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ו חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) הביטוי כאינדיקטורים עבור הפסד Neogenin ו Neogenin רווח, בהתאמה לאחר microinjection של וקטור shRNA מיקוד-neogenin מחסה GFP או microinjection מצומדות של וקטור cDNA neogenin מחסה RFP לתוך zygotes 2-PN, ביטוי של GFP ו RFP היה דמיינו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלבים 2 תאים ו -4 תאים. בחלונית השמאלית, תמונות שלב ניגודיות; לוחות ביניים ועל שמאל, תמונות קרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. הביטוי של Neogenin בתוך הבלסטוציסט לאחר Microinjection של או shRNA מיקוד Neogenin או Neogenin cDNA (א) לאחר microinjection של וקטור shRNA מיקוד-neogenin לתוך zygotes 2-PN, את רמת הביטוי של neogenin בתאים הבלסטוציסט הפרט הוערך על ידי immunostaining עם נוגדנים נגד דגל. בחלונית השמאלית, מקושקש neogenin וקטורי shRNA היו microinjected (שליטה). בלוח הימני, וקטורים shRNA מיקוד-neogenin היו microinjected. DAPI, DAPI (כחול) שימש להכתים את הגרעין; Anti-דגל, ויזואליזציה של תג דגל על neogenin (אדום); GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק (ירוק); התמזגה, אימפוזיציה של DAPI, אנטי-דגל, ו- GFP. (ב) lysates שלמות התא של blastocysts היו immunoblotted עם נוגדנים נגד דגל. GFP שימש כביקורת הטעינה. shRNA מקושקשת, מקושקש neogenin הזרקת shRNA; נג shRNA, injec shRNA מיקוד neogenin tion. (ג) וקטורים cDNA neogenin או וקטורים shRNA מיקוד-neogenin היו microinjected לתוך zygotes 2-PN ואת blastocysts וכתוצאה מכך היו נתונים immunostaining עם נוגדנים נגד neogenin למדוד את רמת הביטוי neogenin. בחלונית העליונה, neogenin מיקוד shRNA הוזרק. Blastocysts היו immunostained עם נוגדנים נגד neogenin (אדום). GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק (ירוק); מוזגה, אימפוזיציה של DAPI, אנטי neogenin, ו- GFP. בחלונית התחתונה, וקטורי cDNA neogenin היו microinjected. Blastocysts היו immunostained עם נוגדנים נגד neogenin (ירוק). DAPI, מכתים גרעיני DAPI (כחול); RFP, חלבון פלואורסצנטי אדום (אדום); מוזגה, אימפוזיציה של DAPI, RFP, ו-neogenin אנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
pload / 53,696 / 53696fig5.jpg "/>
איור 5: אפקטים של Neogenin הפסד או רווח ההתפתחות העוברית. עוברי עכברים 2-PN היו microinjected גם עם RNA סיכת ראש קטן (shRNA) מיקוד neogenin (neogenin הפסד) או עם וקטורים מחסה neogenin cDNA (רווח neogenin) והיו בתרבית עד שיעלו לשלב הבלסטוציסט. להבדיל אובדן neogenin מעוברים רווח neogenin, GFP ו RFP היו שיתוף לידי ביטוי, בהתאמה. תמונות בניגוד שלב של עובר בשלבי התפתחותיים שונים מוצגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: Neogenin התבטאות יתר מצדדים ICM בידול (א) תאים ICM ב blastocysts נצפו על ידי immunostaining עבור Oct3 / 4.. DAPI שימש STAבגרעין. (ב) מספר Oct3 / 4 חיובי תאי ICM בתוך הבלסטוציסט שליט, אובדן neogenin, ועובר רווח neogenin מיוצג כממוצע ± SEM משלושה ניסויים עצמאיים עם 10 עובר לפחות בשימוש בכל ניסוי. * הבדלים משמעותיים בין שליטה על p <0.05 על ידי -test t של סטודנט. (ג) ניתוח RT-PCR של Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2, ו Tead4 mRNAs מ blastocysts של אובדן neogenin, רווח neogenin, ועוברים שליטה. β-תקטין שמש בקרה פנימית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: רצפים של תחל PCR התנאים משמשים RT-PCR.
טבלה 2: מספר שורדים עוברי עכברים בכל שלב התפתחותי לאחר קבלת Neogenin shRNA או Neogenin cDNA בבית 2-PN שלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטות חדשניות של microinjection של חומרים גנטיים, או cDNA או shRNA, לתוך עוברי עכברים 2-PN כדי לחקור את תפקיד neogenin ב התמיינות תאים מוקדם במהלך העובר העכבר. הנדסה גנטית של עבר preimplantation היא טכניקה רבה עצמה בחשיפת מידע חשוב על מנגנונים מולקולריים שבבסיס עבור, למשל, קביעת שושלת התא הראשונה. הנדסה גנטית היא אחת השיטות הנפוצות ביותר עבור בירור תפקוד גן. עם receptibility גדול יחסית של עוברים 2-PN לחומרים גנטיים זרים ועל כדאיות של microinjection של cDNA ו shRNA לתוך עוברים 2-PN, טכניקה מניפולציה העובר זה יכול להיות מיושם עם הפרעה פיזי מינימלי לעובר, שלא לדבר על מהותי השלמה קשורה מניפולציה גנטית זו.
בהתחשב בכך הזרקת ציטופלסמית קל יותר ופחות מזיקלהישרדות מאשר זריקה גרעינית אבל, בכל זאת, ביטוי גבוה של דנ"א זר הקשורים הזרקה גרעינית, שיפור אחד כי יש להדגיש הוא השימוש צנטריפוגה כדי למקם את pronuclei לפני microinjection לתוך הגרעין. הצעד המתוחכם ביותר מבחינה טכנית ודורש הוא microinjection של דנ"א זר לתוך pronucleus של ביצית מופרית. שלב זה הוא קריטי ודורש מיומנות טכנית רבה והכשרה מקיפה להשתלט על הליך microinjection. לאחר מיומנות זו נרכשת עם זאת, השתנות טכניות ושגיאות להיות מינימאליות. ההישרדות השגרתית של עבר microinjected היא בין 80-90% במתקן שלנו.
בניגוד במחקר זה, חוקרים אחרים ממוצבת העוברים על ידי מחזיק פיפטה כזה כי pronucleus ליד הממברנה היה קרוב microneedle. המחט מיקרו-מכן מוכנס לתוך pronucleus 10,11. חווינו כמה קושי להבין את פרוגרעין כראוי תחת מיקרוסקופ ללא צנטריפוגה. ברור, צנטריפוגה מביא הגרעין קרוב קרום הפלזמה לזיהוי טוב יותר. במקביל, לא אמור להיות קצת מקום לשיפור עבור ויזואליזציה טובה יותר ובכך מיקום טוב יותר של pronucleus.
בניגוד הייצור עכברים מהונדס, פרוטוקול שלנו microinjection של פלסמידים לעוברי הוא transfection חולף מטבעו, ולכן מתאים לנתח תפקוד הגן במהלך ההתפתחות העוברית preimplantation. לכן, הפרוטוקול שלנו עבור loss- ולהשיג של פונקצית טכניקה ניתן להכליל נוסף לזהות מולקולות איתות מעורבות התפתחות עוברית מוקדמת.
בנוסף, איתות neogenin יכול להיות מאוד מועיל להתפתחות של שורות תאים גזע עובריים בהתחשב בעובדה neogenin ו ligands שלה צפויים לשפר גורמי שעתוק ספציפיים בתאי גזע כגון Oct3 / 4, Sox2, ו Nanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין המחברים אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים גם רוצים להכיר החוקרים שיונג ורג 'יה למדעי הבריאות באוניברסיטת לייצור ושיתוף בונה עבור neogenin וקטורים cDNA ו shRNA. מחקר זה נתמך על ידי תרומות של תוכנית המחקר במדע בסיסי (2013R1A1A4A01012572) במימון קרן מחקר קוריאה על ידי מענק מחקר מן Sahmyook האוניברסיטה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
