Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक नुकसान का वर्णन है और लाभ के समारोह तरीका है कि neogenin एक मंच-विशिष्ट रिसेप्टर ट्रोफेक्टोडर्म और preimplantation माउस भ्रूण में आंतरिक कोशिका द्रव्यमान भेदभाव की ओर जाता है कि के रूप में पहचान करने के लिए लागू होता है के लिए है।
Introduction
Preimplantation भ्रूण विकास morula और ब्लास्टोसिस्ट करने के लिए एक सेल मंच से कई अलग चरणों में विभाजित किया जा सकता है। ज्यादातर प्रमाण बताते हैं polarity और स्थितीय संकेतों ट्रोफेक्टोडर्म (ते) और आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में जल्दी सेल भाग्य निर्धारण में एक भूमिका निभाते हैं। हालांकि, संकेत, कैसे वे सेलुलर संकेतों में transduced रहे हैं की प्रकृति, और शारीरिक संदर्भों में इस तरह के संकेत सेल वंश भेदभाव की शुरुआत नहीं जाना जाता है में सक्षम हैं। ये विभेदित कोशिकाओं तो विशेषज्ञता से गुजरना, विशेषता संरचनाओं और भ्रूण उचित गठन और नाल 1-3 के विकास के लिए आवश्यक कार्यों पर लेने के लिए शुरुआत।
पूर्व आरोपण भ्रूण विशेष रूप से siRNA या लक्ष्य सीडीएनए तरह संशोधित आनुवंशिक सामग्री के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी होते हैं और इस प्रकार विशिष्ट लक्ष्य अणुओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वहाँ एक से बढ़ समझ है कि आनुवंशिक हैकशेरुकी भ्रूण के विश्लेषण भ्रूण विकास 4 के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। एक समय पर संदर्भ में एक भ्रूण में एक जंगली प्रकार के जीन या एक उत्परिवर्ती फार्म का सटीक परिचय पूरा करने के लिए gain- या हानि के समारोह के जीन की बहुत developmentally विनियमित जीन के अध्ययन में मदद की है। नुकसान और लाभ के समारोह व्यक्तिगत जल्दी गैर स्तनधारी और स्तनधारी भ्रूण में आनुवंशिक सामग्री के microinjection के माध्यम से अपने बड़े आकार और महान ग्रहणशीलता 5 की वजह से अपेक्षाकृत सरल है। Microinjection आम तौर पर गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग किया जाता है। विशेष लाभ वायरल वैक्टर और ट्रांसजीन से अधिक गैर-वायरल वैक्टर का उपयोग में आसानी के लिए लिया गया है। एक तेजी से नुकसान या माउस भ्रूण में लाभ के समारोह अभिव्यक्ति प्रणाली विकसित किया गया है कि हमें काटना और कशेरुकी भ्रूण 6.7 में जीन कार्यों को समझने के लिए अनुमति देता है।
भ्रूण के फ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुत माइकर के चयन की सुविधा होगीoinjected या आनुवंशिक रूप से चालाकी से भ्रूण और एक ही समय में एक साधन के परोक्ष रूप से फ्लोरोसेंट तीव्रता 8 पर आधारित microinjected siRNA या सीडीएनए की अभिव्यक्ति के स्तर यों की अनुदान। इस लेबलिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन सीडीएनए, GFP या आरएफपी को पूरा करने के लिए, सह इंजेक्शन या तो संलयन निर्माणों या अलग रूप में कर रहे हैं। GFP या आरएफपी के प्रतिदीप्ति तीव्रता siRNA या विदेशी डीएनए की अभिव्यक्ति की हद तक है कि नुकसान या लाभ सुनिश्चित करने के समारोह पूरा किया गया है पता चलता है।
यहाँ, हम नुकसान और लाभ के- समारोह तकनीक है कि हमें एक रिसेप्टर कि preimplantation माउस भ्रूण में जल्दी सेल भेदभाव में महत्वपूर्ण कोशिकी संकेतों रिले के रूप में neogenin की पहचान करने की अनुमति के लिए एक micromanipulation प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
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Protocol
नोट: पशु प्रजनन और परवाह के लिए सभी प्रक्रियाओं Sahmyook विश्वविद्यालय, सियोल, दक्षिण कोरिया के IACUC नियमों के अनुसार आयोजित की गई।
1. superovulation, प्रजनन और डिंबवाहिनी अलगाव
- निम्नलिखित परिस्थितियों में जन्मजात C57BL / 6 चूहों बनाए रखें: 22 ± 3 डिग्री सेल्सियस, ~ 60% आर्द्रता, 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र, और पानी और भोजन जी भरकर।
- 0.1 मिलीलीटर में 5 आइयू गर्भवती घोड़ी सीरम gonadotropin (PMSG) के एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 3-5 सप्ताह पुराने मादा चूहों के superovulation प्रेरित / सिर पर 0.1 मिलीलीटर (एचसीजी) 5 आइयू मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 48 घंटे के बाद हुई /सिर।
- इसके तत्काल बाद एचसीजी इंजेक्शन के बाद, रात भर एक ही पिंजरे में उन्हें रखने से ही तनाव का यौन परिपक्व पुरुषों के साथ superovulation प्रेरित महिलाओं दोस्त।
- अगली सुबह, एक संभोग प्लग या मादा जननांग पथ पर योनि प्लग की मौजूदगी से सफल संभोग की पुष्टि करें।
- गर्भवती मादा चूहों बलिदानसीओ द्वारा 2 नशा एचसीजी इंजेक्शन के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था 18-20 घंटा के द्वारा पीछा किया।
- त्वचा और फिर ठीक कैंची के साथ पेरिटोनियल परत काटने से उदर गुहा खोलें।
- ठीक संदंश के साथ गर्भाशय सींग उठाओ और शरीर गुहा से धीरे गर्भाशय, डिंबवाहिनी, अंडाशय, और वसा पैड दूर खींच।
- डिंबवाहिनी और ठीक कैंची के साथ अंडाशय के बीच के क्षेत्र में कटौती। संदंश का स्थान बदलें और डिंबवाहिनी के पास गर्भाशय में कटौती, गर्भाशय संलग्न के ऊपरी भाग के कम से कम 1 सेमी छोड़ने।
- कमरे के तापमान पर M16 मध्यम युक्त एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए oviductal कलसा स्थानांतरण। एक ही थाली में कई चूहों से oviducts पूल।
- भ्रूण की बहाली के लिए एक stereomicroscope के तहत बर्तन रखें।
2. रिट्रीवल और 2-Pronuclear की संस्कृति (2-पीएन) भ्रूण
- एक 30 या 32 ग्राम चमड़े के नीचे सुई के अंत कट एक कुंद टिप में इसे पीसने, और एक निस्तब्धता सुई के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
- उपयोगठीक संदंश निस्तब्धता सुई पर डिंबवाहिनी के अंत करने के लिए स्लाइड। धीरे पकवान यह जगह में पकड़ करने के नीचे के खिलाफ निस्तब्धता सुई की नोक दबाएँ। साथ डिंबवाहिनी फ्लश ~ M16 माध्यम की 0.1 मिलीग्राम एक पेट्री डिश में 2-पी.एन. भ्रूण जारी करने के लिए।
- एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग कर सकते हैं और उन्हें एक नया पेट्री डिश में स्थानांतरित stereomicroscope के तहत प्लावित M16 मध्यम से मेघपुंज आम जनता के साथ-साथ आसपास के 2-पी.एन. भ्रूण की वसूली।
- 2-पी.एन. भ्रूण से मेघपुंज कोशिकाओं 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) में 0.1-0.5% hyaluronidase के 1.0 मिलीलीटर के साथ enzymatic पाचन से अलग कर देना।
- धीरे एक गिलास पिपेट और मेघपुंज कोशिकाओं के भौतिक हटाने के साथ pipetting द्वारा भ्रूण उघाड़ना।
- denuded भ्रूण भ्रूण प्रति ताजा फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 30-50 मिलीलीटर के साथ तीन बार धोएं।
- 10 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin (बीएसए, Fract के साथ पूरक M16 मीडिया में एक 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में भ्रूण सेते5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर आयन वी) एक humidified इनक्यूबेटर तक microinjection किया जाता है, जो कम से कम 4 घंटा बाद में आमतौर पर है।
3. भ्रूण रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)
- ब्लास्टोसिस्ट चरण तक प्रत्येक मंच से कम से कम 10 भ्रूण लीजिए और 5x की ट्रांसक्रिप्टेज पूर्व मिश्रण समाधान रिवर्स रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, RNase अवरोध, oligo डीटी प्राइमर, यादृच्छिक 6mers, dNTP मिश्रण युक्त 4.0 μl में उन्हें पूल, और एक में प्रतिक्रिया बफर पीसीआर ट्यूब।
- 200 पर 30 सेकंड के लिए 20 μl की कुल मात्रा के लिए 2 हे जोड़ें RNase मुक्त आसुत एच और sonicate जमा भ्रूण डब्ल्यू 1 घंटा 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत आरटी प्रतिक्रिया आरंभ।
- उत्पन्न सीडीएनए समाधान के प्रत्येक 5.0 μl के लिए, neogenin के लिए प्राइमरों के साथ सामान्य पीसीआर प्रवर्धन का संचालन, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, Oct3 / 4, या β-actin (प्राइमर दृश्यों सारणी में दिए गए 1। पीसीआर 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के ऊष्मायन के 40 चक्रों के होते हैं, annealing तापमान (तालिका 1 में दिखाया गया है) पर 30 सेकंड, और 72 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड।
- एक 2% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग पीसीआर उत्पादों और ethidium ब्रोमाइड के साथ धुंधला के बाद पराबैंगनी प्रकाश के तहत जेल कल्पना।
- β-actin स्तरों के खिलाफ लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति मानक के अनुसार।
4. भ्रूण की Immunocytochemistry
- पीबीएस 0.01% BSA युक्त के साथ एक संक्षिप्त धोने के द्वारा पीछा 3 बार कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde के साथ प्रत्येक मंच से भ्रूण को ठीक करें।
- पीबीएस के 1.0 मिलीलीटर में 10 भ्रूण incubating 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1% बीच 20 और 0.1% TritonX -100 युक्त द्वारा Permeabilize सेल झिल्ली।
- पीबीएस के 1.0 मिलीलीटर में permeabilized भ्रूण सेते बाध्यकारी अविशिष्ट ब्लॉक करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10% सामान्य बकरी सीरम के साथ पूरक।
- अवरुद्ध भ्रूण बुद्धि सेतेज खरगोश विरोधी neogenin 1 पर एंटीबॉडी: पीबीएस में 100 कमजोर पड़ने 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 0.1% BSA युक्त।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पीबीएस / बीएसए समाधान में 500 कमजोर पड़ने: पीबीएस की बूंदों में 30 सेकंड के प्रत्येक के लिए तीन washes के बाद, 1 पर या तो एलेक्सा 488 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी या एलेक्सा 568 संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी के साथ भ्रूण सेते ।
- एक्टिन तंतु कल्पना करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 1 माइक्रोग्राम / एमएल phalloidin में भ्रूण सेते हैं।
- 5 मिलीलीटर पीबीएस कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए युक्त 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) जोड़कर नाभिक दाग।
- धो पीबीएस के साथ तीन बार संक्षिप्त भ्रूण।
- एक गिलास स्लाइड करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण और उन्हें खनिज तेल की एक बूंद के साथ कवर।
- 1,000X बढ़ाई छवियों उचित तरंग लंबाई के एक उत्तेजना के साथ एक confocal खुर्दबीन के साथ ले लो।
5. Neogenin आरएफपी और Neogenin-siRNA GFP प्लास्मिड की तैयारी
- उपक्लोन सीडीएनए एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी), वेक्टर युक्त neogenin झंडा आरएफपी में जिसके परिणामस्वरूप में माउस neogenin एन्कोडिंग।
- Subclone छोटे बाल के लिये कांटा आरएनए एक पन्ना हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EmGFP), वेक्टर युक्त pcDNA-EmGFP-मीर neogenin में जिसके परिणामस्वरूप में neogenin लक्ष्य (चित्र 1 में दिखाया गया है)।
- दोनों neogenin झंडा आरएफपी और pcDNA-EmGFP-मीर neogenin plasmids बढ़ाना और उन्हें पारंपरिक तरीकों के साथ शुद्ध।
- plasmids के अंतिम सांद्रता को समायोजित करने के लिए ~ 1.0 बाँझ Tris EDTA (ते) बफर में / एमएल माइक्रोग्राम।
2-पी.एन. भ्रूण में plasmids के 6. Microinjection
- denuded 2-पी.एन. भ्रूण एक बार, संक्षेप में, ताजा M16 मीडिया के साथ धोएं।
- एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में 1,000 XG पर 10 मिनट के लिए 2-पी.एन. भ्रूण अपकेंद्रित्र pronuclei के अवलोकन के लिए अनुमति देने के लिए।
- एक additi के लिए 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर खनिज तेल के तहत भ्रूण प्रति M16 मीडिया के 20-30 μl के एक सूक्ष्म बूंद में भ्रूण सेतेonal 1-2 घंटा।
- borosilicate ग्लास केशिका ट्यूबिंग खींच द्वारा इंजेक्शन pipettes और पकड़े pipettes निर्माण (आयुध डिपो = 1.2 मिमी, आईडी = 0.94 मिमी) एक यांत्रिक खींचने के साथ।
- इंजेक्शन pipettes बनाना कुंद सुझावों और <500 माइक्रोन टिप लंबाई और 1-2 माइक्रोन नोक भीतरी व्यास की पॉलिश के उद्घाटन के एक microgrinder और एक microforger का उपयोग कर दिया है।
- pipettes पकड़े वे 20 माइक्रोन की एक आंतरिक व्यास और 100 माइक्रोन के एक बाहरी व्यास के साथ कुंद सुझावों और पॉलिश के उद्घाटन है कि इस तरह के बनाना।
- 1.0 माइक्रोग्राम / μl में प्लाज्मिड समाधान की एक पर्याप्त राशि के साथ लोड इंजेक्शन pipettes (> 200 NL)।
- Microinject ~ एक microinjector एक मोटर चालित micromanipulator से जुड़ी का उपयोग कर pronuclei में से एक में प्रत्येक 2-पी.एन. भ्रूण के लिए प्लाज्मिड समाधान के 10 पी एल; इस प्रक्रिया के दौरान, एक होल्डिंग पिपेट के साथ नकारात्मक दबाव लागू करने से स्थिति में भ्रूण रखें।
- microinjection के बाद, मैं के लिए ताजा M16 मीडिया के साथ 2-पी.एन. भ्रूण 3 बार धोने1 मिनट के लिए हर बार की तुलना में ईएसएस।
- संस्कृति एक खनिज तेल बूंद मीडिया वाष्पीकरण को रोकने के द्वारा कवर एक प्लास्टिक की संस्कृति पकवान पर ताजा M16 मीडिया की एक बूंद में 2-पी.एन. भ्रूण।
- एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत तहत 24 घंटा के अंतराल (डीआईसी) 200X बढ़ाई उलटा माइक्रोस्कोप में भ्रूण का निरीक्षण करें।
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Representative Results
हमें पता चला है कि क्षणिक neogenin, preimplantation माउस भ्रूण के प्रारंभिक विकास के चरणों के दौरान व्यक्त किया जाता है के रूप में जल्दी 2 सेल मंच पर के रूप में और स्थायी जल्दी morula तक दिखाई दे रहा है, लेकिन देर morula और ब्लास्टोसिस्ट चरणों (2A चित्रा) में कमी हो रहा है। इसके अलावा, neogenin के स्थानिक वितरण मुख्य रूप से बाहर की कोशिकाओं के लिए प्रतिबंधित किया गया था। आरटी पीसीआर विश्लेषण के परिणाम neogenin अभिव्यक्ति की जल्दी और क्षणिक प्रकृति के साथ संगत कर रहे थे, 4 सेल मंच पर बढ़ता जा, लेकिन पूरी तरह से 16 सेल मंच पर (चित्रा 2 बी) की कमी या बाद में। इसके विपरीत, एफ actin इस तरह के एक क्षणिक और ध्रुवीकृत अभिव्यक्ति पैटर्न का खुलासा नहीं किया।
हम अगले जांच की कि neogenin स्तर (लॉस neogenin या तो neogenin सीडीएनए वैक्टर (neogenin लाभ) या वैक्टर shRNA neogenin को निशाना बनाने को शरण देने के microinjection से छेड़छाड़ की जा सकती हैएस) 2-पी.एन. युग्मनज में। नेत्रहीन neogenin हानि, आरएफपी से neogenin लाभ अंतर और GFP थे के रूप में संकेतक (चित्रा 3) के सह व्यक्त की, और अभिव्यक्ति के स्तर neogenin जिसके परिणामस्वरूप दोनों immunofluorescence द्वारा और (चित्रा 4) immunoblotting द्वारा पुष्टि की गई।
चित्रा 5 2-पी.एन. स्तर पर या तो shRNA neogenin या सीडीएनए neogenin प्राप्त करने के बाद प्रत्येक चरण में भ्रूण के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता। वहाँ neogenin हानि और लाभ neogenin भ्रूण, और ब्लास्टोसिस्ट चरण (तालिका 2) जब तक कम से कम में कोई विकास संभावित मतभेद के बीच कोई स्पष्ट सकल रूपात्मक मतभेद थे। वास्तव में, दोनों प्रत्येक चरण में जीवित भ्रूण की संख्या और गिरफ्तार भ्रूण की संख्या में काफी अलग नहीं थे।
हालांकि, आईसीएम विकास कम के रूप में लाभ भ्रूण neogenin से neogenin नुकसान में घोषित किया गया थाआईसीएम विशेष Oct3 / 4 neogenin लाभ भ्रूण (चित्रा 6A) में की एक उच्च अभिव्यक्ति से और neogenin नुकसान भ्रूण (चित्रा 6B) की तुलना में neogenin लाभ में ब्लास्टोसिस्ट प्रति Oct3 / 4 पॉजिटिव आईसीएम कोशिकाओं की उच्च संख्या इसका सबूत है। इसके अलावा, आरटी पीसीआर विश्लेषण तीन प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति के स्तर और neogenin के बीच एक मजबूत संबंध का पता चला। Neogenin नुकसान ब्लास्टोसिस्ट्स में, थोड़ा Oct3 / 4, Sox2, और Nanog का पता लगाया गया है, जो नियंत्रण भ्रूण (चित्रा 6C) पर neogenin लाभ में सभी तीन प्रतिलेखन कारक की अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि के लिए इसके विपरीत में है। अप्रत्याशित रूप से, Cdx2 और Tead4 की अभिव्यक्ति के स्तर, प्रतिलेखन कारक ते भेदभाव / रखरखाव 6.7 में फंसा है, कम neogenin की अभिव्यक्ति के स्तर से प्रभावित थे, मान्य अप-रेगुलेशन neogenin की आईसीएम के लिए विशिष्ट transcriptional नियामकों लेकिन के सक्रियण की ओर जाता है नहीं ते स्थापना के लिए। दिखाए गए सभी डेटा मीटर कर रहे हैं संदर्भ 9 से odified।
चित्रा 1: की संरचना pcDNA-EmGFP-मीर neogenin। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। माउस भ्रूण विकास के दौरान Neogenin की अभिव्यक्ति (ए) Confocal सूक्ष्म विभिन्न विकासात्मक चरणों में preimplantation भ्रूण में neogenin अभिव्यक्ति की छवियों। (बी) रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन neogenin mRNA की preimplantation भ्रूण में विभिन्न विकासात्मक चरणों में प्रतिक्रिया। β-actin एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।96fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) Neogenin घटाने और Neogenin लाभ, क्रमशः के लिए संकेतक के रूप में अभिव्यक्ति संयुग्मित GFP या एक neogenin सीडीएनए वेक्टर में आरएफपी को शरण देने के microinjection को शरण देने के लिए एक neogenin-लक्ष्य shRNA वेक्टर के microinjection के बाद 2-पी.एन. युग्मनजों, GFP और आरएफपी की अभिव्यक्ति 2-सेल और 4 सेल चरणों में एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे कल्पना की गई थी। वाम पैनल, चरण विपरीत छवियों; मध्य और सही पैनल, प्रतिदीप्ति छवियों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4:। एक ब्लास्टोसिस्ट में Neogenin की अभिव्यक्ति या तो shRNA लक्ष्य निर्धारण Neogenin या Neogenin सीडीएनए के microinjection के बाद (ए) 2-पी.एन. युग्मनजों में एक neogenin-लक्ष्य shRNA वेक्टर के microinjection के बाद, व्यक्तिगत ब्लास्टोसिस्ट कोशिकाओं में neogenin की अभिव्यक्ति के स्तर द्वारा मूल्यांकन किया गया था विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ immunostaining। बाएं पैनल में, तले हुए neogenin shRNA वैक्टर (नियंत्रण) microinjected किया गया। सही पैनल में, neogenin-लक्ष्य shRNA वैक्टर microinjected किया गया। DAPI, DAPI (नीला) नाभिक दाग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था; विरोधी झंडा, neogenin पर झंडा टैग के दृश्य (लाल); GFP, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (हरा); विलय कर दिया, DAPI, विरोधी झंडा, और GFP के superimposition। (बी) ब्लास्टोसिस्ट के पूरे सेल lysates विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ immunoblotted थे। GFP एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। तले shRNA, shRNA इंजेक्शन neogenin तले; एनजी shRNA, neogenin-लक्ष्य shRNA injec tion। (सी) neogenin सीडीएनए वैक्टर या neogenin-लक्ष्य shRNA वैक्टर 2-पी.एन. युग्मनजों में microinjected रहे थे और जिसके परिणामस्वरूप ब्लास्टोसिस्ट्स विरोधी neogenin एंटीबॉडी के साथ immunostaining neogenin अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए के अधीन थे। ऊपरी पैनल में, neogenin-लक्ष्य shRNA इंजेक्ट किया गया था। Blastocysts विरोधी neogenin एंटीबॉडी (लाल) के साथ immunostained गया। GFP, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (हरा); विलय कर दिया, DAPI, विरोधी neogenin, और GFP के superimposition। कम पैनल में, neogenin सीडीएनए वैक्टर microinjected किया गया। Blastocysts विरोधी neogenin एंटीबॉडी (हरा) के साथ immunostained गया। DAPI, DAPI परमाणु धुंधला (नीला); आरएफपी, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (लाल); विलय कर दिया, DAPI, आरएफपी, और विरोधी neogenin के superimposition। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 5: Neogenin हानि या भ्रूण विकास पर लाभ के प्रभाव। 2-पी.एन. माउस भ्रूण या तो छोटे बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) neogenin को निशाना (हानि neogenin) के साथ या सीडीएनए (neogenin लाभ) neogenin शरण वैक्टर के साथ microinjected और ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुँचने तक सुसंस्कृत थे। neogenin लाभ भ्रूण से neogenin नुकसान को अलग करने के लिए, GFP और आरएफपी सह व्यक्त कर रहे थे, क्रमशः। चरण विपरीत विकास के विभिन्न चरणों में भ्रूण की छवियों को दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: Neogenin overexpression एहसान आईसीएम भेदभाव ब्लास्टोसिस्ट्स में (ए) आईसीएम कोशिकाओं Oct3 / 4 के लिए immunostaining द्वारा देखा गया।। DAPI स्टेशन के लिए इस्तेमाल किया गया थानाभिक में। (बी) के नियंत्रण, neogenin हानि, और neogenin लाभ भ्रूण की एक ब्लास्टोसिस्ट में Oct3 / 4 पॉजिटिव आईसीएम कोशिकाओं की संख्या कम से कम 10 प्रत्येक प्रयोग में इस्तेमाल भ्रूण के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से ± SEM के मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। * छात्र टी -Test द्वारा पी <0.05 पर नियंत्रण से महत्वपूर्ण मतभेद। (सी) आरटी पीसीआर neogenin हानि, neogenin लाभ, और नियंत्रण भ्रूण के ब्लास्टोसिस्ट से Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2, और Tead4 mRNAs का विश्लेषण। β-actin एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: प्राइमरों और पीसीआर स्थितियों आरटी पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया दृश्यों।
तालिका 2: प्रत्येक विकास के चरण में माउस भ्रूण जीवित 2-पी.एन. स्टेज पर Neogenin shRNA या Neogenin सीडीएनए प्राप्त करने के बाद की संख्या।
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम माउस embryogenesis दौरान जल्दी सेल भेदभाव में neogenin की भूमिका का पता लगाने के लिए 2-पी.एन. माउस भ्रूण में आनुवंशिक सामग्री के microinjection के उपन्यास तरीकों, या तो सीडीएनए या shRNA, प्रदर्शित करता है। preimplantation भ्रूण के आनुवंशिक संशोधन उदाहरण के लिए के लिए अंतर्निहित आणविक तंत्र, पहली सेल वंश दृढ़ संकल्प के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी को उजागर करने में एक शक्तिशाली तकनीक है। आनुवंशिक संशोधन जीन समारोह का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है। विदेशी आनुवंशिक सामग्री के लिए 2-पी.एन. भ्रूण और सीडीएनए और shRNA के microinjection की व्यवहार्यता 2-पी.एन. भ्रूण में की अपेक्षाकृत बड़ी receptibility के साथ, इस भ्रूण हेरफेर तकनीक भ्रूण के लिए कम से कम शारीरिक विघटन के साथ लागू किया जा सकता है, आंतरिक उल्लेख नहीं इस आनुवंशिक हेरफेर के साथ जुड़े पूरकता।
कि cytoplasmic इंजेक्शन को ध्यान में रखते आसान और कम हानिकारक हैपरमाणु इंजेक्शन से अस्तित्व के लिए लेकिन, फिर भी, परमाणु इंजेक्शन के साथ जुड़े विदेशी डीएनए के एक उच्च अभिव्यक्ति, एक सुधार है कि जोर दिया जाना चाहिए centrifugation के उपयोग के नाभिक में microinjection से पहले pronuclei की स्थिति है। सबसे तकनीकी रूप से परिष्कृत और मांग कदम के लिए एक निषेचित डिंब की pronucleus में विदेशी डीएनए के microinjection है। यह कदम महत्वपूर्ण है और काफी तकनीकी दक्षता और व्यापक प्रशिक्षण microinjection प्रक्रिया में महारत हासिल करने की आवश्यकता है। एक बार जब इस कौशल हालांकि अधिग्रहण कर लिया है, तकनीकी परिवर्तनशीलता और त्रुटियों को कम से कम हो जाते हैं। microinjected भ्रूण की दिनचर्या अस्तित्व हमारे सुविधा में 80-90% के बीच है।
इस अध्ययन के विपरीत, अन्य शोधकर्ताओं पिपेट ऐसी है कि प्लाज्मा झिल्ली के पास एक pronucleus Microneedle के करीब था धारण करके भ्रूण तैनात हैं। सूक्ष्म सुई तो pronucleus 10,11 में डाला जाता है। हम समर्थक visualizing कुछ कठिनाई का अनुभवसही ढंग से centrifugation बिना माइक्रोस्कोप के नीचे नाभिक। जाहिर है, centrifugation बेहतर पहचान के लिए प्लाज्मा झिल्ली नाभिक करीब लाता है। एक ही समय में, वहाँ pronucleus के बेहतर दृश्य इस तरह बेहतर स्थिति के लिए सुधार के लिए कुछ कमरे में होना चाहिए।
ट्रांसजेनिक चूहों उत्पादन के विपरीत, भ्रूण में plasmids के microinjection के लिए हमारे प्रोटोकॉल स्वभाव से एक क्षणिक अभिकर्मक है, और इस तरह preimplantation भ्रूण विकास के दौरान जीन समारोह विदारक के लिए उपयुक्त है। इसलिए, एक नुकसान के लिए हमारे प्रोटोकॉल और लाभ के समारोह तकनीक आगे जल्दी भ्रूण के विकास में शामिल संकेतन अणुओं की पहचान करने के सामान्यीकरण नहीं किया जा सकता है।
इसके अलावा, neogenin सिगनल भ्रूण स्टेम सेल को देखते हुए लाइनों के विकास के लिए बेहद फायदेमंद हो सकता है neogenin और उसके ligands ऐसे Oct3 / 4, Sox2, और Nanog के रूप में स्टेम सेल विशिष्ट प्रतिलेखन कारक बढ़ाने की संभावना हैं।
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Disclosures
लेखकों वित्तीय हितों की होड़ में कोई खुलासा किया है।
Acknowledgments
लेखकों को भी विनिर्माण और सीडीएनए और shRNA वैक्टर neogenin के लिए निर्माणों को बांटने के लिए जॉर्जिया स्वास्थ्य विज्ञान विश्वविद्यालय में डॉ Xiong के समूह को स्वीकार करना होगा। इस अध्ययन में बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2013R1A1A4A01012572) कोरियाई रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित से अनुदान द्वारा और Sahmyook विश्वविद्यालय से शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
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