Summary
Цель этого протокола заключается в описании убыт- и амплитудно-метода функции, который применим для идентификации neogenin в качестве рецептора стадиеспецифический, что приводит к трофэктодерме и массовая дифференциация внутренней клеточной у эмбрионов предимплантационной мыши.
Introduction
Преимплантационная эмбриональное развитие можно разделить на несколько различных стадий, от стадии одной клетки к морулы и бластоцисты. Многое данные свидетельствуют о том, что полярность и позиционные сигналы играют роль в раннем определении судьбы клеток в трофэктодерме (TE) и массы внутренней клетки (ИВМ). Тем не менее, характер репликами, как они преобразованных в клеточные сигналы, а также физиологические условия, в которых такие сигналы способны инициировать клеточной линии дифференцировки не известны. Эти дифференцированные клетки затем проходят специализацию, начинает приобретать характерные структуры и функции , необходимые для правильного формирования эмбриона и роста плаценты 1-3.
Предимплантационной эмбрионов особенно поддаются манипулированию путем прямой инъекции модифицированных генетических материалов, таких как миРНК или кДНК-мишени и, таким образом, могут быть использованы для изучения конкретных молекул-мишеней. Существует растущее понимание того, что генетическаяанализ эмбрионов позвоночных имеет решающее значение для углубления нашего понимания эмбрионального развития 4. Точное введение гена дикого типа или мутантной формы в эмбрион в своевременном контексте для достижения амплитудно или с потерей функции гена значительно облегчило изучение онтогенетически регулируемых генов. Убыт- и амплитудно-оф-функции с помощью микроинъекции генетических материалов в отдельных ранних эмбрионов не млекопитающих и млекопитающих сравнительно просто из - за их большого размера и большой восприимчивостью 5. Микроинъекция обычно выполняется с использованием не-вирусные векторы. Особое преимущество было принято за легкости использования невирусных векторов над вирусными векторами и трансгенов. Быстрое убыт- или система экспрессии усиления из-функции у эмбрионов мышей была разработана , что позволяет анализировать и понять функции генов в позвоночном эмбриологии 6,7.
Флуоресцентным эмбрионов значительно облегчит выбор MICRoinjected или генетически модифицированных эмбрионов и в то же время предоставляют средство для непрямого количественную оценку уровня экспрессии микроинъецировали миРНК или кДНК , основанный на интенсивности флуоресценции 8. Для выполнения этой маркировки, флуоресцентный белок, кДНК GFP или RFP, являются совместно вводят либо в виде слитых конструкций или по отдельности. Интенсивность флуоресценции GFP или RFP показывает степень экспрессии миРНК или чужеродной ДНК, чтобы гарантировать, что убыт- или получить его функции, было достигнуто.
Здесь мы приводим протокол микроманипуляций для убыт- и усиления посещающих функции методики, которая позволила нам идентифицировать neogenin как рецептор, который передает внеклеточные сигналы важные в начале дифференцировки клеток у эмбрионов предимплантационной мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все процедуры для животноводства и заботами были проведены в соответствии с правилами IACUC из Sahmyook университета, Сеул, Южная Корея.
1. суперовуляции, Селекция и Яйцевод Изоляция
- Поддерживать инбредных мышей C57BL / 6 при следующих условиях: 22 ± 3 ° C, ~ 60% влажности, 12 ч цикл свет / темнота, и вода и пища вволю.
- Побудить суперовуляцию из 3-5-недельных самок мышей путем внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в количестве 0,1 мл / голову с последующим 48 ч позже внутрибрюшинной инъекции 5 МЕ человеческого хорионического гонадотропина (ХГ) в количестве 0,1 мл /глава.
- Сразу же после инъекции ХГЧ, мате суперовуляции индуцированных самок с половозрелых самцов того же штамма, держа их в той же самой клетке в течение ночи.
- На следующее утро, подтверждают успешное спаривание наличием матовую пробки или вагинального пробки на женских половых путей.
- Жертвоприношение беременных самок мышейСО 2 опьянение с последующим смещением шейных позвонков 18-20 ч после инъекции ХГЧ.
- Откройте брюшной полости, разрезав кожу, а затем в брюшную слой с тонкими ножницами.
- Возьмите рога матки с тонким пинцетом и отодвигать матки, яйцеводов, яичник и жировой ткани мягко из полости тела.
- Вырезать область между яйцеводе и яичнике с мелкими ножницами. Переставьте пинцета и разрезают матку возле яйцевода, в результате чего по меньшей мере, 1 см от верхней части матки прилагается.
- Перенести яйцевода ампулу на 35 мм чашки Петри, содержащие среду М16 при комнатной температуре. Бассейн яйцеводах от нескольких мышей в том же блюде.
- Поместите посуду под стереомикроскопа для извлечения эмбрионов.
2. Поиск и культура 2-пронуклеарной (2-ПН) Эмбрионы
- Отрежьте конец 30 или 32 G иглы для подкожных инъекций, растереть его в тупой кончик, и использовать его в качестве промывочной иглы.
- использованиетонким пинцетом, чтобы скользить конец яйцевода на промывочной иглы. Слегка нажмите на кончик иглы промывочного против дно тарелки, чтобы удерживать его на месте. Промыть яйцевод с ~ 0,1 мл M16 среды для высвобождения эмбрионов 2-PN в чашку Петри.
- Восстановление эмбрионов 2-ПН наряду с окружающими кучевые массы из промытой среды М16 под стереомикроскопа с использованием стерильного стеклянной пипетки и перенести их в новую чашку Петри.
- Диссоциируют кумулюсных клетки из эмбрионов 2-PN ферментативным расщеплением с 1,0 мл 0,1-0,5% гиалуронидазы в фосфатно-солевом буфере Дульбекко (DPBS) при 37 ° С в течение 5-10 мин.
- Оголять эмбрионов, осторожно пипеткой со стеклянной пипеткой и физического удаления кучевые клеток.
- Промыть Зачищенное эмбрионов три раза с 30-50 мл свежей фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) в эмбрионе.
- Инкубируйте эмбрионов в 35 мм пластиковой чашке Петри в М16, дополненной 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА, Fractиона V) , при 37 ° С в 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе до тех пор , пока микроинъекции сделано, которая, как правило , меньше , чем 4 часа позже.
3. Эмбрион с обратной транскрипцией (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)
- Собирают по крайней мере 10 эмбрионов из каждой стадии вплоть до стадии бластоцисты и объединить их в 4,0 мкл 5х обратной транскриптазы раствора предварительной смеси, содержащей обратной транскриптазы, ингибитор РНКазы, олиго- дТ праймер, случайный 6mers, дНТФ смесь, и реакционный буфер в ПЦР-трубки.
- Добавить РНКазы дистиллированная H 2 O до полного объема 20 мкл , и разрушать ультразвуком Отстоявшийся эмбрионов в течение 30 сек при 200 Вт немедленно начать реакцию RT при 42 ° С в течение 1 ч , а затем 5 мин инкубации при 95 ° С.
- Для каждого 5,0 мкл кДНК раствора генерируемой, проводят обычную ПЦР - амплификации с использованием праймеров для neogenin, Cdx2, Sox2, Tead4, Nanog, последовательности праймеров Oct3 / 4, или β-актина (приведены в таблице 1. ПЦР состоит из 40 циклов 15 сек инкубации при 95 ° С, 30 с при температуре отжига ( как показано в Таблице 1), и 30 с при 72 ° С.
- Отдельные продукты ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле 2% и визуализации геля в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
- Нормализация экспрессию генов мишеней против бета-актина уровней.
4. Иммуноцитохимическая эмбрионов
- Закрепить эмбрионов из каждой стадии 4% параформальдегида в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим кратковременным промывкой 3 раза PBS, содержащим 0,01% BSA.
- Проницаемыми Клеточные мембраны путем инкубирования 10 эмбрионов в 1,0 мл PBS, содержащего 0,1% Tween 20 и 0,1% Тритон Х-100 при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Для того, чтобы блокировать неспецифические связывания инкубировать проницаемыми эмбрионов в 1,0 мл PBS с добавлением 10% нормальной козьей сывороткой в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Выдержите заблокированное эмбрионов остроумиеч кролика против neogenin антител в разведении 1: 100 в PBS, содержащем 0,1% бычьего сывороточного альбумина в течение ночи при 4 ° С.
- После трех промывок в течение 30 секунд каждый в каплях PBS, инкубировать эмбрионов либо с Alexa 488-конъюгированного IgG козы к антителам кролика или Alexa 568-конъюгированного козьего анти-кроличьего IgG в разведении 1: 500 в растворе PBS / БСА в течение ночи при температуре 4 ° С ,
- Для визуализации актиновые филаменты, инкубировать эмбрионов в 1 мкг / мл фаллоидином в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Пятно ядра путем добавления 5 мл ПБС, содержащего 1 мкг / мл DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорида) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Вымойте эмбрионов в три раза на короткое время с PBS.
- Перенос эмбрионов на предметное стекло и покрывают их с каплей минерального масла.
- Возьмите изображения при увеличении 1,000X с конфокальной микроскопии с возбуждением соответствующей длины волны.
5. Получение Neogenin-RFP и Neogenin-миРНК GFP плазмид
- Subклонировать кДНК, кодирующей мыши neogenin в белок красный флуоресцентный (RFP) -содержащий вектора, что приводит к neogenin-флаг-ЗП.
- Подклон небольшой шпилька РНК таргетирования neogenin в Protein Emerald Green Fluorescent (EmGFP) -содержащий вектор, в результате pcDNA-EmGFP-MIR-neogenin (показано на рисунке 1).
- Amplify как neogenin флаг-RFP и pcDNA-EmGFP-Mir-neogenin плазмид и очистить их с традиционными методами.
- Отрегулировать конечные концентрации плазмид до ~ 1,0 мкг / мл в стерильном Трис-ЭДТА (ТЕ) буфера.
6. Микроинъекция плазмид в 2-PN Эмбрионы
- Вымойте денудированные 2-ПН эмбрионов один раз, кратко, со свежими СМИ М16.
- Центрифуга эмбрионов 2-PN в течение 10 мин при 1000 х г в настольной центрифуге, чтобы обеспечить наблюдение за пронуклеусов.
- Инкубируйте эмбрионов в микро - капли 20-30 мкл M16 сред на эмбрион под минеральным маслом при температуре 37 ° С в 5% CO 2 в течение дополнительнальная 1-2 ч.
- Изготовление инъекционные пипетки и удерживающие пипетки, потянув боросиликатного стекла капиллярной трубки (OD = 1,2 мм; ID = 0,94 мм) с механическим съемника.
- Изготовить инъекционные пипетки, чтобы иметь тупые советы и полированные отверстия <длина наконечника 500 мкм и 1-2 мкм наконечника внутреннего диаметра, используя микромельница и microforger.
- Изготовить проведение пипеток таким образом, что они имеют тупые советы и полированные отверстия с внутренним диаметром 20 мкм и наружным диаметром 100 мкм.
- инжекционные нагрузки пипеток с достаточным количеством (> 200 нл) плазмидной раствора при 1,0 мкг / мкл.
- Microinject ~ 10 мкл раствора плазмиды для каждого 2-ПН эмбриона в один из пронуклеусов с использованием microinjector, прикрепленную к моторизованным микроманипулятором; В ходе этого процесса, держать эмбрионов в положении с помощью отрицательного давления с удерживающей пипеткой.
- После того, как микроинъекции, мыть эмбрионов 2-PN 3 раза со свежим M16 сред для лESS чем 1 мин каждый раз.
- Культура зародыши 2-PN в капле свежей среде М16 на пластиковую чашку для культивирования, покрытой каплей минерального масла, чтобы предотвратить испарение средств массовой информации.
- Обратите внимание эмбрионов на 24 интервалов ч в дифференциально-интерференционного контраста (DIC) инвертированным микроскопом при увеличении 200X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы обнаружили , что neogenin временно экспрессируется на ранних стадиях развития эмбрионов предимплантационной мыши, появляются уже на стадии 2-клеточного и прочного до начала морулы , но становится дефицитом на поздней морулы и бластоцисты этапов (рис 2А). Кроме того, пространственное распределение neogenin было ограничено, главным образом, за пределами клетки. Результаты анализа ОТ-ПЦР согласовывались с ранней и переходной природы neogenin выражения, достигая максимума на 4-клеточной стадии , но совершенно не хватает на 16-клеточной стадии или позже (Фигура 2В). В отличие от этого, F-актин не выявили такую переходную и поляризованный характер экспрессии.
Далее мы исследовали, может ли уровни neogenin можно манипулировать с помощью микроинъекции либо neogenin векторов кДНК (neogenin усиление) или векторов, несущих shRNA ориентации neogenin (neogenin Лос-s) в 2-PN зиготы. Для того, чтобы визуально дифференцировать neogenin выигрыш от neogenin потерь, RFP и GFP были совместно выражены как индикаторы (рисунок 3), и полученный neogenin уровень экспрессии был подтвержден как иммунофлюоресценции и иммуноблоттинга (Рисунок 4).
На рисунке 5 показаны репрезентативные изображения эмбрионов на каждом этапе после получения либо neogenin shRNA или neogenin кДНК на стадии 2-PN. Там не было никаких явных грубых морфологических различий между neogenin потерей и neogenin эмбрионов усиления, а также без каких - либо различий в развитии потенциала по крайней мере до стадии бластоцисты (таблица 2). На самом деле, как число выживших эмбрионов на каждом этапе, а число арестованных эмбрионов существенно не отличались.
Однако развитие ИВМ был менее выражен в neogenin потери, чем neogenin эмбрионов получить како чем свидетельствует более высокой экспрессии ИВМ специфических Oct3 / 4 в neogenin эмбрионов усиления (6А) и более высокими номерами Oct3 / 4-положительных клеток на ИВМ бластоцисты в neogenin усилением , чем neogenin эмбрионов потери (рис 6б). Кроме того, анализ ОТ-ПЦР показал сильную корреляцию между уровнем экспрессии трех факторов транскрипции и что из neogenin. В neogenin бластоцисты потери, немного Oct3 / 4, Sox2 и Nanog были обнаружены, что резко контрастирует с существенным увеличением в экспрессии всех трех факторов транскрипции в neogenin усиления над контрольными эмбрионами (рис 6в). Неожиданно оказалось, что уровни экспрессии Cdx2 и Tead4, транскрипционные факторы участвуют в ТЕ дифференциации / обслуживания 6,7, были менее подвержены влиянию уровня экспрессии neogenin, проверки того, что до регуляции neogenin приводит к активации транскрипционных регуляторов специфических для МКД , но не для установления TE. Все данные указаны м odified из ссылки 9.
Рисунок 1: Структура pcDNA-EmGFP-Mir-neogenin. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Экспрессия Neogenin Во время эмбрионального развития мышей (A) конфокальной микроскопии изображений neogenin экспрессии в предимплантационной эмбрионов на разных стадиях развития. (Б) обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции мРНК neogenin в предимплантационной эмбрионов на разных стадиях развития. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля.96fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Зеленый флуоресцентный белок (GFP) и красный флуоресцентный белок (RFP) Выражение в качестве индикаторов для потери Neogenin и Neogenin Gain соответственно после микроинъекции в neogenin таргетирования shRNA вектора , несущего сопряженную GFP или микроинъекции в neogenin кДНК вектора , несущего RFP в 2-PN зиготы, экспрессию GFP и RFP визуализировали под флуоресцентным микроскопом на 2-клеточных и 4-клеточных стадий. Левая панель, фазового контраста изображения; среднего и правая панели, флуоресцентные изображения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
На рис . 4: Экспрессия Neogenin в бластоцисты После микроинъекции либо shRNA Targeting Neogenin или Neogenin кДНК (А) После того, как микроинъекции в neogenin нацеливания shRNA вектора в 2-PN зигот, уровень экспрессии neogenin в отдельных бластоцисты клеток оценивали с помощью иммунным с анти-флаг антител. В левой панели, вскарабкался neogenin векторы shRNA были микроинъекции (контроль). В правой панели, были микроинъекции neogenin таргетирования векторы shRNA. DAPI, DAPI (синий) использовали для окрашивания ядра; Анти-флаг, визуализация тега флага на neogenin (красный); GFP, зеленый флуоресцентный белок (зеленый); слиты, накладывание DAPI, анти-флага, и GFP. (Б) лизатов целых клеток бластоцист были иммуноблоттинг с анти-флаг антител. GFP, был использован в качестве нагрузочного контроля. Яичница shRNA, омлет neogenin shRNA инъекции; Ng shRNA, neogenin таргетирования shRNA INJEC ции. (С) Векторы neogenin кДНК или в neogenin-векторы ориентации shRNA были микроинъекций в зиготы 2-PN и полученные бластоцисты были подвергнуты иммунным с анти-антителами neogenin для измерения уровня экспрессии neogenin. В верхней панели, neogenin таргетирования shRNA впрыскивали. Бластоцисты иммуноокрашиванию с анти-neogenin антител (красный цвет). GFP, зеленый флуоресцентный белок (зеленый); Объединять, накладывание DAPI, анти-neogenin и GFP. В нижней панели, были микроинъекции neogenin векторы кДНК. Бластоцисты иммуноокрашиванию с анти-neogenin антител (зеленый цвет). DAPI, DAPI ядерное окрашивание (синий); RFP, красный флуоресцентный белок (красный); Объединять, накладывание DAPI, RFP и анти-neogenin. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
pload / 53696 / 53696fig5.jpg "/>
Рисунок 5: Последствия потери Neogenin или прибыль эмбрионального развития. 2-ПН эмбрионов мышей были микроинъекции либо с небольшим шпилька РНК (shRNA) ориентации neogenin (neogenin потери) или с помощью векторов, несущих neogenin кДНК (neogenin усиления) и культивировали до достижения стадии бластоцисты. Для того, чтобы дифференцировать neogenin потери от neogenin эмбрионов усиления, GFP и RFP были совместно выражены, соответственно. Фазового контраста изображения эмбрионов на разных стадиях развития показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Neogenin Гиперэкспрессия Благоприятная ИВМ Дифференциация (А) ICM клеток в бластоцисты рассматривались иммунным для Oct3 / 4.. DAPI был использован для STAв ядре. (В) Количество / 4-положительных клеток ИВМ Oct3 в бластоцисты контроля, neogenin потери и neogenin эмбрионов усиления представлены как среднее ± SEM из трех независимых экспериментов , причем , по меньшей мере 10 эмбрионов , используемых в каждом эксперименте. * Значительные отличия от контроля при р <0,05 по т -TEST Стьюдента. (C) RT-PCR анализ Oct3 / 4, Sox2, Nanog, Cdx2 и Tead4 из бластоцисты мРНК из neogenin потери, neogenin усиления и контрольных эмбрионов. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1: Последовательности праймеров и ПЦР - услови х, используемых для RT-PCR.
Таблица 2: Количество Выживание эмбрионов мыши на каждом стадии развития После приема Neogenin shRNA или Neogenin кДНК на 2-PN Stage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем протоколе, мы демонстрируем новые способы микроинъекции генетических материалов, либо кДНК или shRNA, в эмбрионах 2-ПН мыши, чтобы исследовать роль neogenin в ранней дифференцировки клеток во время эмбриогенеза мыши. Генетическая модификация предимплантационной эмбрионов является мощным средством в раскрытии ключевой информации о базовых молекулярных механизмов, например, первого определения клеточных клонов. Генетическая модификация является одним из наиболее часто используемых методов для выяснения функции гена. При относительно больших receptibility эмбрионов 2-PN для иностранных генетических материалов и осуществимости микроинъекции кДНК и shRNA в эмбрионах 2-PN, этот метод манипуляции эмбрион может быть реализован с минимальным физическим нарушением в эмбрион, не говоря уже о характеристическую взаимодополняемость, связанный с этой генетической манипуляции.
Учитывая то, что цитоплазматические инъекции является более простым и менее вреднымна выживание, чем ядерной инъекции, но, тем не менее, более высокая экспрессия чужеродной ДНК, связанной с ядерной инъекцией, одно усовершенствование, которое следует подчеркнуть, является использование центрифугирования для позиционирования пронуклеусы, прежде чем микроинъекции в ядро. Самым технически сложным и требовательным шагом является микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетке. Этот шаг имеет решающее значение и требует значительных технических навыков и интенсивное обучение, чтобы освоить процедуру микроинъекции. После того, как этот навык приобретается однако, техническая изменчивость и ошибки становятся минимальными. Процедура выживания микроинъекции эмбрионов составляет от 80-90% в нашем учреждении.
В отличие от этого исследования, другие исследователи расположены эмбрионов, держа пипетку таким образом, что пронуклеус вблизи мембраны плазмы близка к микроиглы. Микро-игла затем вставляется в пронуклеус 10,11. Мы испытывали некоторые трудности с визуализацией проЯдро правильно под микроскопом без центрифугирования. Очевидно, что центрифугирование приводит ядра близко к мембране для лучшей идентификации. В то же время, должны быть некоторые возможности для улучшения для лучшей визуализации, таким образом, лучшего позиционирования пронуклеусом.
В отличие от трансгенных мышей, наш протокол для микроинъекции плазмид в эмбрионах является временная трансфекция по своей природе, и, таким образом, подходит для рассечения функции генов во время предимплантационной эмбрионального развития. Таким образом, наш протокол для убыт- и получить его функции, метод может быть дополнительно обобщена для идентификации молекул, участвующих в ранних стадиях эмбрионального развития сигнализации.
Кроме того, neogenin сигнализация может быть весьма полезным для развития линии эмбриональных стволовых клеток, учитывая, что neogenin и его лиганды могут усилить специфические стволовых клеток факторы транскрипции, такие как Oct3 / 4, Sox2 и Nanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов раскрывать.
Acknowledgments
Авторы также хотели бы отметить группу доктора Сюна в Грузии медицинских наук университета для производства и обмена конструкций для neogenin кДНК и shRNA векторов. Это исследование было поддержано грантами Программы фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A4A01012572), финансируемого Фондом Корейского научно-исследовательского и научно-исследовательского гранта от Sahmyook университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M16 medium, | Gibco BRL (Grand Island, NY) | M7292 LOT# 11A832 | |
| Goat serum, | Dako (Glostrup, Denmark) | X0907 | |
| PMSG | Folligon, Intervet, Holland | G4877-1000IU LOT#SLBD0719V | |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | CG5-1VL LOT# SLBC6783V | |
| human chorionic gonadotropin and pregnant mare serum gonadotropin | (Intervet, Holland) | (invitrogen , 15596-026) | |
| SuperScript® III Reverse Transcriptase | lifetechnologies | 18080-044 | |
| PCR pre mixture | (Bioneer, Daejon, S. Korea) | GenDEPOT , A0224-050 | |
| Agarose (molecular grade) | BioRad | 161-3101 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix USA | 19943 | |
| polyclonal rabbit anti-neogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, US | SC-15337 | |
| Alexa fluor 488 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-11094 | |
| Alexa fluor 555 labeled anti-rabbit antibody | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen, USA) | A34055 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen, USA | D1306 | |
| Recombinant Human RGM-C/Hemojuvelin | R&D systems | 3720-RG | |
| all plasmid constructs | Prof. Wen Cheng Xiong at Georgia Health Sciences University (Agusta, GA). | for the present studies were kindly provided by | |
| Neon® Transfection System | lifetech | MPK10096 | |
| Stereo Microscrope | Nikon | SMZ1000 | |
| Micromainpulation system with Nikon | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| Micro Injector | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| Holder | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| Microfuge | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| grinder | Narishige | EG400 | |
| Puller | Sutter Instrumnet company | P-97 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384-Well Thermal Cycler | lifetechnologies | 4388444 |
References
- Yamanaka, Y., Ralston, A., Stephenson, R. O., Rossant, J. Cell and molecular regulation of the mouse blastocyst. Dev. Dyn. 235 (9), 2301-2314 (2006).
- Sasaki, H. Mechanisms of trophectoderm fate specification in preimplantation mouse development. Dev. Growth Differ. 52 (3), 263-273 (2010).
- Nishioka, N., Yamamoto, S., Kiyonari, H., Sato, H., Sawada, A., Ota, M., et al. Tead4 is required for specification of trophectoderm in pre-implantation mouse. Mech. Dev. 125 (3-4), 270-283 (2008).
- Ovitt, C. E., Schöler, H. R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. Mol. Hum. Reprod. 4 (11), 1021-1031 (1998).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851 (2011).
- Shin, M. R., Cui, X. S., Jun, J. H., Jeong, Y. J., Kim, N. H. Identification of mouse blastocyst genes that are down regulated by double-stranded RNA-mediated knockdown of Oct-4 expression. Mol. Reprod. Dev. 70 (4), 390-396 (2005).
- Khang, I., Sonn, S., Park, J. -H., Rhee, K., Park, D., Kim, K. Expression of epithin in mouse preimplantation development: Its role in compaction. Dev. Biol. 281, 134-144 (2005).
- Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769 (2015).
- Lee, J. H., Choi, S. S., Kim, H. W., Xiong, W. C., Min, C. K., Lee, S. J. Neogenin as a receptor for early cell fate determination in preimplantation mouse embryos. PLoS One. 9 (7), e101989 (2014).
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 4438-4442 (1985).
