Abstract
Filamentosa proteine actina (F-actina) svolge un ruolo importante nella spinogenesis, plasticità sinaptica, e la stabilità sinaptica. Cambiamenti nelle strutture ricche dendritiche F-actina suggeriscono alterazioni nella integrità sinaptica e la connettività. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di ratto primario neuroni corticali, Colorazione falloidina per puncta F-actina, e successive tecniche di quantificazione. Innanzitutto, la corteccia frontale di embrioni di ratto E18 sono dissociato in coltura cellulare a bassa densità, allora i neuroni coltivati in vitro per almeno 12-14 giorni. Dopo il trattamento sperimentale, i neuroni corticali sono macchiati con AlexaFluor 488 falloidina (per etichettare il puncta F-actina dendritiche) e map2 (MAP2, per convalidare le cellule neuronali e l'integrità dendritiche). Infine, il software specializzato è utilizzato per analizzare e quantificare dendriti neuronali selezionati in modo casuale. F-actina strutture ricche sono identificati sul secondo ordine rami dendritiche (range 25-75 lunghezza &# 181; m) con continui immunofluorescenza MAP2. Il protocollo presentato qui sarà un metodo utile per studiare i cambiamenti nelle strutture sinapsi dendritiche successivi trattamenti sperimentali.
Introduction
L'obiettivo primario di questo studio è quello di sviluppare un metodo affidabile di misura (stima) di integrità sinaptica della rete dendritica neuronale. Qui si descrive la quantificazione di puncta F-actina in primari di ratto neuroni in coltura utilizzando una combinazione di falloidina colorazione e rilevamento immunocitochimica (ICC) di dendriti con successiva analisi utilizzando software specializzati (NIS-Elements).
Phallotoxins etichettati hanno un'affinità simile per grandi e piccoli filamenti (F-actina), ma non si legano al monomero globulare actina (G-actina), a differenza di alcuni anticorpi actina 1. Legame non specifico di falloidina è trascurabile, fornendo in tal modo sfondo minima durante l'imaging cellulare. Falloidina è molto più piccolo di anticorpi che viene in genere utilizzato per etichettare proteine cellulari per microscopia a fluorescenza, che consente molto più intenso etichettatura di F-actina by falloidina. Così, immagini dettagliate di localizzazione F-actina nei neuroni possono essereottenuto attraverso l'uso di etichetta falloidina.
Falloidina (F-actina) colorazione dei dendriti neuronali genera discreti "punti caldi" o "puncta" luminosa, che rappresentano una varietà di strutture dendritiche, tra cui spine mature, le sinapsi non spinosi 2 e spine immature. Spine immature includono filopodi sottili e alcune forme di patch di morfologia, e possono rappresentare l'avvio di spinogenesis 3. Spine immature e patch non spinosi mancano PSD95 4. Cambiamenti nella produzione di piombo F-actina alle successive variazioni non solo spine ma anche strutture dendritiche aggiuntivi, rendendo così falloidina uno strumento importante per indagare l'integrità synaptodendritic 5-7. In generale, il numero di falloidina-positivi (F-actina) puncta riflettono un equilibrio tra le sinapsi attive (eccitatori e inibitori), le dinamiche di actina e la stabilità sinapsi 8.
Anche se è importante studiare specifica tipi di sinapsi (cioè, spine eccitatorie), quando la destinazione di un trattamento non è nota, è necessario stimare prima l'integrità generale di una varietà di strutture dendritiche. Dal momento che F-actina è una componente importante di spine dendritiche e altre strutture, tra cui sinapsi inibitorie, un numero alterato di puncta F-actina può indicare una synaptopathy. Questo synaptopathy può quindi essere studiata ulteriormente per le modifiche più specifiche. Il nostro metodo di quantificazione per il rilevamento di più sinaptici tipi / strutture produce una stima complessiva del dendritiche alterazioni sinaptiche (aumenti e le diminuzioni) a seguito di vari trattamenti sperimentali.
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Protocol
Tutti i protocolli degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali presso la University of South Carolina (numero garanzia: A3049-01).
1. a bassa densità neuronale embrionale Cultura
- La preparazione per la cultura neuroni corticali primarie
- soluzioni:
- Preparare soluzione stock Poly-L-lisina sciogliendo 5 mg di poli-L-lisina in 10 ml di tampone borato.
- Preparare la soluzione di lavoro diluendo 1 ml Poly-L-lisina Archivio in 49 ml tampone borato.
- Preparare borato Buffer, pH 8.4 partendo da 395 ml di dH 2 O e quindi l'aggiunta di tutti gli ingredienti (1,24 g di acido borico + 1,9 g di borace). Regolare il pH a 8,4 con 1 M NaOH. Regolare a 400 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano.
- Preparare la soluzione HBSS, pH 7,2 iniziando con 445 ml di dH 2 O e l'aggiunta di tutti gli altri ingredienti (50 ml 10X HBSS archivio + 1,2 g HEPES). Regolare il pH a 7,2 con 1 N HCl, bring a 500 ml e filtrare con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano.
- Preparare mezzo di placcatura: DMEM / F12 con il 10% di siero fetale bovino. Filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano.
- Preparare terreno di coltura completo: a 50 ml di mezzo Neurobasal, aggiungere i supplementi (500 microlitri Glutamax (100X) + 500 ml di glucosio + 1 ml di B-27 (50X) + 500 ml di soluzione di antibiotici contro funghi (100X) + 100 ml 7,5% Bicarbonato di sodio. filtro con filtro a membrana in nylon 0,2 micron sotto il cofano.
- Due giorni prima della cultura:
- Coat dodici 35 mm piatti con fondo di vetro con 2 ml di soluzione di lavoro Poli-L-lisina, e tenere sotto il cofano O / N.
- Un giorno prima della cultura:
- Vuoto agente di rivestimento dai piatti e risciacquare con DDH 2 O. Lasciare asciugare i piatti per un'ora sotto il cofano.
- Preparare mezzo di placcatura (DMEM / F12 con siero fetale bovino 10% (10% di soluzione totale). Pipettare 2 ml di mezzo inogni piatto, e incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO 2.
Nota: È importante evitare piatti di plastica coltura durante la coltura. L'utilizzo di piatti con fondo di vetro (per microscopi invertiti) o vetrini (per microscopi verticali) produce immagini chiare e nitide. Rispetto ad un piatto di plastica-basso, il piatto fondo di vetro consente di evitare riflessi indesiderati o abbagliamento durante la microscopia a fluorescenza.
- soluzioni:
- Protocollo Colture cellulari:
- Messo in frigorifero HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm di Petri piatti, pinze, forbici, provette da 50 ml e 15 ml tubi sotto la luce UV a cappuccio.
- Euthanize ratto in gravidanza con l'inalazione letale di 5% sevoflurano sotto il cofano al di fuori della stanza della cultura.
- Sterilizzare con il 70% EtOH, tenda la pelle del basso addome con pinze durante il taglio della coda fino a metà del addominale cavity.Open l'utero con le forbici per esporre la placenta.
- Rimuovere 8-10 feti E18. PlaCe 8-10 feti in capsule di Petri contenenti soluzione HBSS.
- Tenere la parte posteriore della testa del feto con una pinza, quindi utilizzare le forbici per tagliare la testa dal corpo. Mettere in un altro capsula di Petri riempite con 5-7 ml di HBSS. Trasferimento piatto a cappuccio.
- Riempire due ulteriori capsula di Petri 100 mm con HBSS freddo.
- Peel parte del cranio, il cervello e scoop in una nuova capsula di Petri riempite con HBSS.
- Utilizzare pinze curve taglienti, cervelletto e tronco cerebrale separata dal cervello, poi il trasferimento cervello a una nuova capsula di Petri con HBSS freddo in esso.
- Utilizzare le pinzette per fissare, separare gli emisferi con una pinza curve. Rimuovere meningi; isolare corteccia frontale e pezzi di trasferimento in provette da 15 ml centrifuga segnati.
- Riempire il tubo da 15 ml con il fresco 2 ml HBSS e aggiungere 20 microlitri tripsina EDTA (10x miscela concentrata con 0,5% tripsina e EDTA 5,3 mm.) Ad ogni provetta 15 ml.
- Incubare 10-15 minuti a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente tubo ogni pochi minuti, non consentono di stabilirsi.
- After 10-15 minuti, l'uso pipetta di vetro per rimuovere vecchia HBSS e lavare due volte con HBSS nuova.
- Immergere in inibitore della tripsina (1 mg / ml, 2 mg di inibitore della tripsina in 2 ml HBSS), mescolare bene e lasciate riposare 5 minuti. Lavare due volte con HBSS fresco.
- Uso pipetta di vetro con bulbo di gomma, pezzi cerebrali Triturare 10-15 volte molto lentamente in modo da evitare bubbles.Triturate nuovamente utilizzando una pipetta calibrata e una punta sterile con una punta di diametro ridotto molto lentamente fino ad omogeneità.
- Trasferimento dissociato cellule a densità desiderata di pre-preparati piatti della cultura rivestiti (50 cellule / mm2). Incubare O / N a 37 ° C, 5% di CO2.
- Dopo 24 ore, sostituire medio DMEM / F12 con il mezzo privo di siero Neurobasal completa crescita appena fatto.
- Mantenere le cellule in ogni momento in un CO 2/95% incubatore umidificato aria ambiente 5% per almeno 12-14 giorni prima della sperimentazione. Supplemento cellule ogni 5-6 giorni con terreno fresco Neurobasal sostituzione circa il 50% del vecchio mezzo.
2. fluorescenti etichettatura e Immunocitochimica
Nota: L'etichettatura immunofluorescenza di colture cellulari primarie corticali stata effettuata in vetro piatti di coltura cellulare fondo 35 mm con un volume di lavoro di 1 ml.
- Lavare il piatto fondo di vetro due volte con tampone fosfato salina pH 7.4 (PBS).
- Fissare cellule con 4% paraformaldeide per 15 minuti a RT.
- Lavare le cellule due volte con PBS e permeabilize con 0,1% Triton X-100 in PBS per 5 min.
- Trattare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente con una macchia specifica F-actina, AlexaFluor 488 falloidina (1:40, 25 ml di falloidina in 1 ml di PBS).
- Lavare le cellule due volte con PBS e bloccare con il 10% di siero normale di capra a temperatura ambiente per 1-2 ore.
- Diluire l'anticorpo pollo policlonale anti-MAP2 (1: 2.500) in PBS con il 2% di siero normale di capra e incubare O / N a 4 ° C.
- Dopo l'incubazione, lavare in PBS due volte.
- Diluire l'anticorpo secondario (Alexa REd 594 coniugato capra anti-IgG di pollo (1: 500) con il 2% di siero normale di capra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
- Risciacquare con PBS e aggiungere 10 ml / piatto di colorante Hoescht.
- Incubare 3 minuti a temperatura ambiente e lavare con PBS due volte.
Nota: Le cellule marcate ora pronto per il passaggio 3 (F-actina conteggio puncta). - Conserva campione di cellule con 100 ml di antifade reattivo come agente coprioggetto e mantenerlo a 4 ° C al buio per la conservazione a lungo termine.
Nota: falloidina è relativamente stabile in PBS a 4 ° C al buio fino a 1 settimana e la fluorescenza può essere conservato con antifade reagenti copertura dei vetrini. Tuttavia, per ottenere immagini ottimali da 1-3 giorni dopo la colorazione da falloidina può iniziare a diffondere con stoccaggio prolungato.
3. F-actina Puncta conteggio
- Accendere microscopio a fluorescenza e passare a 20 × obiettivo. Aprire il software microscopio, e impostare il programma a 1280 × 960 pixel di dimensioni dell'immagine, e 0,1risoluzione dell'immagine / pixel 7 micron a 1 ×.
- Acquisire le immagini di co-marcato F-actina / neuroni MAP2 in verde (495 nm) / rosso (613 nm) canali fluorescenti.
- Scegli 5 Green (F-actina) / Red (MAP2) immunolabeled / blu (Hoescht) immagini fluorescenti di singolo neurone con pergole dendritiche chiaramente definiti.
- Identificare i F-actina strutture ricche di secondo ordine segmento dendritiche (intervallo di lunghezza 25-75 micron), con continui immunofluorescenza MAP2.
- Ruotare la regione selezionata di immagini a un livello orizzontale. Copia e incolla come nuova immagine.
- Sottrarre il fondo delle immagini, utilizzando un aggiustamenti coerenti per ogni piatto.
- Contare il brillante puncta F-actina verde e tracciare la lunghezza del segmento dendritiche selezionato manualmente da osservatori indipendenti addestrati. Esportare i dati in un file foglio di calcolo.
- Calcolare la densità dividendo totale F-actina puncta marcato (N) per la lunghezza (L) della MAP2 etichettato dendriti. i dati espressi come numero di F-acpuncta latta per 10 micron di dendriti
Nota: Puncta (dimensioni ≤1.5 micron) della fluorescenza F-actina con una intensità di picco di almeno 50% rispetto all'intensità media della colorazione nel pozzo dendritica sono stati inclusi in ciascun segmento dendritica selezionato.
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Representative Results
Nelle attuali metodi, in primo luogo abbiamo la cultura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare i dendriti dei singoli neuroni. Nella figura 1, il contrasto di interferenza differenziale (DIC) immagini mostrano le variazioni morfologiche nello sviluppo fetale di ratto neuroni corticali nei giorni 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Si noti che la lunghezza e il numero di dendriti aumentano con la maturazione dei neuroni di ratto primari in coltura. I neuroni sono utilizzati in esperimenti solo dopo 14 giorni di maturazione.
Per rilevare i cambiamenti dendritiche e sinaptici, uniamo l'etichettatura falloidina F-actina con la rilevazione di anticorpi MAP2 dei dendriti. Poiché etichettatura falloidina di F-actina è molto rapida (20-30 min), è possibile stimare visivamente l'integrità della rete synaptodendritic prima di procedere con etichettatura anticorpi ICC (Figura 2
Successivamente, abbiamo acquisire immagini ad alta risoluzione di co-marcato falloidina (F-actina) / MAP2 neuroni e analizzato i neuroni selezionati in modo casuale. Bene filopodi, sporgenze della colonna vertebrale, e le patch F-actina sono stati considerati strutture ricche F-actina e sono stati inclusi nei nostri studi (Figura 3). Segmenti del secondo ordine dendriti (MAP2 positivi) sono stati selezionati per l'analisi di densità puncta F-actina. MAP2 colorazione positiva viene utilizzato per confermare la localizzazione neuronale del puncta F-actina. il rilevamento e il conteggio di falloidina (F-actina) marcato (canale fluorescenza verde) assistita da computer puncta sinaptica è stata effettuata attraverso l'utilizzo di software specializzati. C'è un passo per passo dettagliato protocollo in figura 4 2 = 0,97).
In precedenza, abbiamo utilizzato la quantificazione di puncta F-actina per valutare lesioni synaptodendritic indotta da HIV-1 Tat 9 e il recupero da synaptopathy HIV-1 Tat-indotta 10. Nella Figura 5, neuroni corticali di ratto sono stati co-etichettati con falloidina e MAP2 anticorpi dopo 50 Nm di trattamento per l'HIV-1 Tat. MAP2 colorazione rivelato un minor numero di rami dendritici e diminuita F-actina seguente HIV-1 Tat-trattamento.
Abbiamo scoperto che puncta F-actina può aumentare o diminuire in risposta a trattamenti sperimentali. Nella Figura 6, neuroni in coltura sono stati trattati con the non competitiva NMDA antagonista del recettore memantina, aumentando in modo significativo puncta positivo F-actina. Al contrario, il trattamento con una combinazione di metamfetamina + HIV-1 Tat ha comportato una significativa perdita di puncta F-actina.
Figura 1. fetali neuroni corticali di ratto in coltura cellulare contrasto interferenziale (DIC) immagini differenziali di ratto fetale i neuroni corticali tra 4 -. 27 giorni in vitro (20x). I neuroni sembrano maturi a 14 giorni in vitro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. falloidina / MAP2 co-etichettatura nei neuroni corticali di ratto. Neuroni coltivati etichettati con MAP2 anticorpi (rosso) e falloidina (verde). Fusione di immagini consentono la determinazione che la colorazione falloidina è localizzato a dendriti neuronali (20x). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. F-actina strutture sinaptiche dei neuroni corticali di ratto. (A) sinistra - strutture positivi F-actina etichettati con falloidina (60X). Le frecce indicano le strutture etichettati F-actina includono spine a fungo (viola), patch-come morfologia (blu) e lungo filopodi (arancione). Medio - immagine fusa che dimostrano queste strutture F-actina sono localizzate a dendriti (20x). Destra - Box in basso a destra indica il ramo dendritiche secondo ordine selezionato per l'analisi (20X) (B) segmenti dendritiche di falloidina (F-actina) (verde) / MAP2. (Red) co-marcato i neuroni corticali (20x) vengono utilizzati per verificare l'origine neuronale di puncta F-actina. L'unica immagine verde (falloidina / F-actina) viene ulteriormente elaborato. (C) falloidina / F-actina (verde) le immagini di tre segmenti dendritiche selezionati per il conteggio puncta. Densità è determinato dividendo N / L. N = numero di puncta, L = lunghezza del segmento dendritiche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Dimostrazione di pacchetto software:. Istruzioni passo per passo Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 5. HIV-1 Tat mediato lesioni synaptodendritic nei neuroni corticali di ratto. Le colture cellulari sono stati co-colorate per F-actina e MAP2 dopo il trattamento della proteina Tat di HIV-1 (50 Nm). Superiore panels- neuroni non trattati mostrano robusto F-actina, modelli di ramificazione complessi e vasti processi neuronali sottili. pannelli inferiori - i neuroni trattati proteina Tat di HIV-1 con ridotta F-actina e diminuzione ramificazioni dendritiche. (20X) Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. puncta F-actina nei neuroni corticali di ratto:. Effetti diversi prodotti da Memantina rispetto al trattamento metamfetamina + Tat Immagini (20x) di neuroni in coltura non trattati, i neuroni trattati con Memantina (10 micron), e neuroni trattati con MethamphEtamine (20 micron) +10 nM di Tat (10nM). trattamento con memantina ha aumentato la colorazione F-actina, mentre il trattamento metamfetamina + HIV-1 Tat diminuita colorazione F-actina e diminuita ramificazioni dendritiche. trattamento con memantina ha aumentato significativamente la densità puncta F-actina, rispetto a colture di controllo non trattati. Al contrario, i trattamenti metamfetamina + HIV-1 Tat è diminuito in modo significativo la densità puncta F-actina, rispetto a colture di controllo non trattati. Media + SEM, * p <0.05. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo, si descrive la coltura neuroni corticali di ratto a bassa densità in piatti con fondo di vetro da 35 mm, che ci permette di identificare dendriti dei singoli neuroni. Avanti, usiamo falloidina e MAP2 colorazione per rilevare i cambiamenti dendritiche. Poi, abbiamo utilizzato un software specializzato per quantificare i cambiamenti in puncta F-actina.
Per determinare le variazioni di puncta F-actina tutta la rete neuronale di un singolo neurone deve essere chiaramente visibile, permette la selezione di opportuni segmenti dendritiche del secondo ordine da un singolo neurone. placcatura a bassa densità è critica per entrambi visualizzarne singoli neuroni così da ridurre al minimo la presenza di cellule gliali. Gli astrociti contengono anche F-actina e senza un marcatore neuronale, potrebbe confondere l'analisi di puncta positivo F-actina. culture bassa densità e l'uso del mezzo Neurobasal sono utili nel ridurre la proliferazione astrocitari nelle colture cellulari. Tuttavia, dato l'avvertenza che la proteina F-actina ènon specifiche per i neuroni, marcatori proteici neuronali specifici, come MAP2, dovrebbe essere usato insieme con falloidina. Altri anticorpi proteine possono essere utilizzati anche in combinazione con falloidina, come TH (tirosina idrossilasi) per l'identificazione di specifiche popolazioni neuronali in coltura.
Una tecnica generale per studiare le sinapsi e la morfologia sinaptica è immunocitochimica (ICC). ICC è popolare poiché molti anticorpi per le proteine sinaptiche sono prontamente disponibili compreso PSD 95, NMDAR (post-sinaptica) nonché synaptophysin, fagotto e sinapsina I (pre-sinaptica) 11. Tuttavia, alcune strutture non può essere rilevato da ICC (ad esempio sottile filopodi), ma una combinazione di etichettatura falloidina F-actina con rilevamento di anticorpi (o doppia marcatura con due anticorpi differenti) possono consentire un'indagine specifica e complessa di sottopopolazioni sinaptiche e le risposte differenziali ai trattamenti sperimentali.
puncta F-actina può essere particlare sensibili ai trattamenti sperimentali. Abbiamo recentemente riportato che il trattamento con HIV-1 proteina Tat ha prodotto una diminuzione della puncta F-actina (24 ore) prima di qualsiasi prova di morte neuronale palese (48 ore) 10. E 'da notare che i trattamenti sperimentali possono sia aumentare (memantina) o diminuire (metanfetamina + HIV-1 Tat) F-actina puncta. Abbiamo anche trovato che la perdita puncta F-actina è una risposta reversibili dopo specifici trattamenti sperimentali 10. Come tale, F-actina puncta quantificazione è uno strumento prezioso per monitorare non solo synaptopathy acuta, ma anche per lo studio di recupero sinaptica e processi neurorestoration sperimentali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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