Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Kvantificering af Filamentøs actin (F-actin) puncta i Rat kortikale neuroner

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Filamentøs actin-protein (F-actin) spiller en stor rolle i spinogenesis, synaptisk plasticitet, og synaptisk stabilitet. Ændringer i dendritiske F-actin rige strukturer foreslå ændringer i synaptisk integritet og tilslutningsmuligheder. Her giver vi en detaljeret protokol til dyrkning primær rotte kortikale neuroner, Phalloidin farvning for F-actin puncta, og efterfølgende kvantificering teknikker. Først den frontale cortex hos E18 rotteembryoer dissocieres i lav massefylde cellekultur, så neuronerne dyrkes in vitro i mindst 12-14 dage. Følgende eksperimentelle behandling er de corticale neuroner farvet med AlexaFluor 488 Phalloidin (at mærke dendritiske F-actin puncta) og mikrotubulus-associeret protein 2 (MAP2; at validere de neuronale celler og dendritiske integritet). Endelig er specialiseret software, der bruges til at analysere og kvantificere tilfældigt udvalgte neuronale dendritter. F-actin rige strukturer identificeres på anden ordens dendritiske grene (længde range 25-75 &# 181; m) med kontinuerlig MAP2 immunofluorescens. Protokollen præsenteres her vil være en nyttig metode til undersøgelse af ændringer i dendritiske synapse strukturer efterfølgende til eksperimentelle behandlinger.

Introduction

Det primære mål med denne undersøgelse er at udvikle en pålidelig målemetode (skøn) af synaptisk integritet neuronale dendritiske netværk. Her beskriver vi kvantificering af F-actin puncta i primær rotte dyrkede neuroner ved hjælp af en kombination af Phalloidin farvning og immuncytokemisk (ICC) påvisning af dendritter med efterfølgende analyse ved hjælp af specialiserede (NIS-elementer) software.

Mærkede phallotoxins har lignende affinitet for både store og små filamenter (F-actin), men ikke binder til monomer kugleformede actin (G-actin), i modsætning til nogle actin antistoffer 1. Ikke-specifik binding af Phalloidin er ubetydelig, hvilket giver minimal baggrund under cellulært billeddannelse. Phalloidin er meget mindre end antistoffer, som typisk vil blive anvendt til at mærke cellulære proteiner til fluorescerende mikroskopi, som tillader en langt mere intens mærkning af F-actin ved phalloidin. Således kan detaljerede billeder af F-actin lokalisering i neuroner væreopnås ved anvendelse af mærket Phalloidin.

Phalloidin (F-actin) farvning af neuronale dendritter genererer diskrete "hot spots" eller lyse "puncta", som repræsenterer en bred vifte af dendritiske strukturer, herunder modne pigge, ikke-tornede synapser 2 og umodne pigge. Umodne pigge omfatter tynde filopodia og nogle former for patch morfologi, og kan repræsentere indledningen af spinogenesis 3. Umodne pigge og ikke-tornede patches mangler PSD95 4. Ændringer i produktionen af F-actin fører til efterfølgende ændringer i ikke kun pigge men også yderligere dendritiske strukturer, og dermed gøre Phalloidin et vigtigt redskab til at undersøge synaptodendritic integritet 5-7. Generelt antal Phalloidin-positive (F-actin) puncta afspejler en balance mellem aktive synapser (stimulerende og hæmmende), aktin dynamik og synapse stabilitet 8.

Selv om det er vigtigt at studere specifikke types af synapser (dvs. excitatoriske spines), når målet for en behandling er ukendt, er det nødvendigt først at estimere den generelle integritet af en række dendritiske strukturer. Da F-actin er en vigtig del af dendritiske Torner og andre strukturer, herunder hæmmende synapser, et ændret antal F-actin puncta kan indikere en synaptopathy. Denne synaptopathy kan derefter undersøges yderligere for mere specifikke ændringer. Vores kvantificering metode til påvisning af flere synaptiske typer / strukturer giver et samlet overslag over dendritiske synaptiske ændringer (stigninger og fald) efter forskellige eksperimentelle behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr protokoller blev revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg ved University of South Carolina (forsikring nummer: A3049-01).

1. Lav-density Embryonale Neuronal Kultur

  1. Forberedelse til primær kortikal neuron kultur
    1. Løsninger:
      1. Forbered Poly-L-Lysin-stamopløsning ved at opløse 5 mg poly-L-lysin i 10 ml boratpuffer.
      2. Forbered arbejdet ved at fortynde 1 ml Poly-L-lysin Stock i 49 ml Borat Buffer.
      3. Forbered boratbuffer, pH 8,4 ved at starte med 395 ml dH2O og derefter tilsætte alle bestanddele (1,24 g borsyre + 1,9 g Borax). Indstil pH til 8,4 med 1 M NaOH. Juster til 400 ml og filtreres med 0,2 um nylon membranfilter under udsugning.
      4. Forbered HBSS opløsning, pH 7,2 ved at starte med 445 ml dH2O og tilsætte alle andre ingredienser (50 ml 10X HBSS lager + 1,2 g HEPES). Indstil pH til 7,2 med 1 N HCI, bring til 500 ml og filtreres med 0,2 um nylon membranfilter under udsugning.
      5. Forbered plating medium: DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum. Filter med 0,2 um nylon membranfilter under udsugning.
      6. Forbered komplet vækstmedium: Til 50 ml Neurobasal medium, tilføje kosttilskud (500 pi GlutaMax (100X) + 500 pi Glukose + 1 ml B-27 (50X) + 500 pi af antibiotika-antimykotisk opløsning (100X) + 100 pi 7,5% natriumbicarbonat. filter med 0,2 um nylon membranfilter under udsugning.
    2. To dage før kultur:
      1. Coat tolv 35 mm glas-bottom retter med 2 ml Poly-L-lysin brugsopløsning og holde under kølerhjelmen O / N.
    3. En dag før kultur:
      1. Tom belægning agent fra skålene og skyl med Hedeselskabet 2 O. Lad retter tørre i en time under udsugning.
      2. Forbered plating medium (DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (10% af den samlede opløsning). Afpipetteres 2 ml medium indhver skål, og inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
        Bemærk: Det er vigtigt at undgå plastik petriskåle, når dyrkning. Anvendelse af glas-bottom retter (for omvendte mikroskoper) eller dækglas (til opretstående mikroskoper) giver skarpe og klare billeder. Sammenlignet med en plast-bund skålen, glasbund skålen undgår uønskede nuancer eller blænding under fluorescerende mikroskopi.
  2. Cellekultur protokol:
    1. Put nedkølet HBSS Buffer (100-150 ml), 100 mm petriskåle, pincet, saks, 50 ml rør, og 15 ml rør under UV-lys i hætte.
    2. Afliv gravid rotte med dødelig indånding af 5% sevofluran under kølerhjelmen uden for kultur rum.
    3. Sterilisere med 70% EtOH, telt huden af ​​underlivet ved anvendelse af pincetter, mens der skæres fra halen op i midten af ​​abdominal cavity.Open livmoderen med en saks for at blotlægge placenta.
    4. Fjern 8-10 E18 fostre. Place 8-10 fostre i petriskåle, der indeholder HBSS løsning.
    5. Hold bagsiden af ​​hovedet af fosteret med pincet, og derefter bruge en saks til at skille hovedet fra kroppen. Placer den i en anden petriskål fyldt med 5-7 ml HBSS. Overfør parabol til hætte.
    6. Fyld to yderligere 100 mm petriskål med koldt HBSS.
    7. Skræl bort kraniet, og scoop hjerne ind i en ny petriskål fyldt med HBSS.
    8. Brug skarpe buede pincet, separat lillehjernen og hjernestammen fra hjernen, derefter overføre hjernen til en ny petriskål med koldt HBSS i det.
    9. Brug en pincet til at sikre, adskille halvkugler med buede pincet. Fjern meninges; isolere frontale cortex og overføre stykker ind markerede 15 ml centrifugerør.
    10. Fyld 15 ml rør med frisk 2 ml HBSS, og der tilsættes 20 pi Trypsin EDTA (10x koncentreret blanding med 0,5% trypsin og 5,3 mM EDTA.) Til hver 15 ml rør.
    11. Inkuber 10-15 min ved stuetemperatur. Forsigtigt swirl rør hvert par minutter, tillader ikke afregning.
    12. After 10-15 min, brug glaspipette for at fjerne gammel HBSS og skyl to gange med nye HBSS.
    13. Fordybe i trypsininhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsininhibitor i 2 ml HBSS), bland godt og lad det sidde 5 min. Vask to gange med frisk HBSS.
    14. Brug af glaspipette med gummi pære, Mal hjerne stykker 10-15 gange meget langsomt for at undgå bubbles.Triturate igen med en kalibreret pipette og en steril spids med en reduceret spids diameter meget langsomt indtil homogenitet.
    15. Overførsel dissocierede celler på den ønskede tæthed til at pre-forberedt belagt kultur retter (50 celler / mm2). Inkuber O / N ved 37 ° C, 5% CO2.
    16. Efter 24 timer, erstatter DMEM / F12 medium med frisklavet komplet vækst serumfrit Neurobasal medium.
    17. Opretholde cellerne på alle tidspunkter i en 5% CO2 / 95% luft i rummet fugtig inkubator i mindst 12-14 dage før eksperimenter. Supplement cellerne hver 5-6 dag med frisk Neurobasal medium, der erstatter ca. 50% af det gamle medie.

2. Fluorescerende Mærkning og Immuncytokemi

Bemærk: immunfluorescerende mærkning af primære corticale cellekulturer blev udført i glasbund 35 mm celle dyrkningsskåle med et arbejdsvolumen på 1 ml.

  1. Vask glasbund skålen to gange med phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS).
  2. Fix celler med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Vask cellerne to gange med PBS og permeabilisere med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  4. Behandle celler i 20 minutter ved stuetemperatur med en F-actin specifik farvning, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 25 pi Phalloidin i 1 ml PBS).
  5. Skyl celler to gange med PBS og blokere med 10% normalt gedeserum ved stuetemperatur i 1-2 timer.
  6. Fortynd kylling polyklonalt anti-MAP2-antistof (1: 2.500) i PBS med 2% normalt gedeserum og inkuber O / N ved 4 ° C.
  7. Efter inkubation skylles i PBS to gange.
  8. Fortynd det sekundære antistof (Alexa RED 594-konjugeret gede-anti-kylling IgG (1: 500) med 2% normalt gedeserum og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur.
  9. Skyl med PBS, og der tilsættes 10 ul / skål Hoescht farvestof.
  10. Inkuber 3 minutter ved stuetemperatur og vaskes med PBS to gange.
    Bemærk: De mærkede celler nu klar til trin 3 (F-actin puncta optælling).
  11. Bevare celleprøve med 100 pi antifade reagens som et dækglas middel og holde ved 4 ° C i mørke til langtidsopbevaring.
    Bemærk: Phalloidin er relativt stabil i PBS ved +4 ° C i mørke i op til 1 uge og fluorescens kan bevares med antifade dækglas reagenser. Men optimale billeder opnås, fra 1-3 dage efter farvning siden Phalloidin kan begynde at diffundere ud med langtidslagring.

3. F-actin puncta Counting

  1. Tænd fluorescerende mikroskop og skifte til 20 × mål. Open mikroskop software, og oprette program på 1280 × 960 pixel billedstørrelse, og 0,17 um / pixel billedopløsning på 1 × zoom.
  2. Anskaf billeder af co-mærket F-actin / MAP2 neuroner under grøn (495 nm) / rød (613 nm) fluorescerende kanaler.
  3. Vælg 5 Green (F-actin) / Rød (MAP2) immunolabeled / Blå (Hoescht) fluorescerende billeder af individuelle neuron med klart definerede dendritiske dorne.
  4. Identificer F-actin-rige strukturer i anden rækkefølge dendritiske segment (længde interval 25-75 um) med kontinuerlig MAP2 immunofluorescens.
  5. Roter det valgte område af billeder til en vandret niveau. Kopier og indsæt som et nyt billede.
  6. Fratræk baggrund af billeder, ved hjælp af en konsistent justeringer for hver skål.
  7. Tæl lysegrønne F-actin puncta og spore længden af ​​udvalgte dendritiske segment manuelt af uddannede uafhængige observatører. Eksportere data til et regneark fil.
  8. Beregn massefylden ved at dividere den samlede F-actin mærket puncta (N) med længden (L) af MAP2 mærkede dendritter. Express data som antallet af F-actin puncta pr 10 um af dendritceller
    Bemærk: puncta (størrelse ≤1.5 um) af F-actin fluorescens med en topintensitet på mindst 50% over den gennemsnitlige intensitet af farvning i dendritiske akslen blev inkluderet i hver udvalgt dendritiske segment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de foreliggende fremgangsmåder, vi først kultur rotte corticale neuroner ved lav densitet i 35 mm glas-bottom retter, som tillader os at identificere de dendritter af individuelle neuroner. I figur 1 er forskellen interferens kontrast (DIC) billeder viser de morfologiske ændringer i udviklingen føtal rotte corticale neuroner på dag 4, 6, 10, 14, 21 og 27 in vitro. Bemærk, at længden og antallet af dendritter øges med modning af dyrkede rotte primære neuroner. Neuroner anvendes i forsøg først efter 14 dage modning.

For at detektere dendritiske og synaptiske ændringer kombinerer vi den Phalloidin F-actin mærkning med MAP2 antistof detektion af dendritter. Da Phalloidin mærkning af F-actin er meget hurtig (20-30 min), er det muligt visuelt at estimere integritet synaptodendritic netværk inden der fortsættes med ICC antistofmærkning (figur 2

Dernæst vi erhverve billeder af co-mærket Phalloidin (F-actin) / MAP2 neuroner høj opløsning og analyseret tilfældigt udvalgte neuroner. Fine filopodia, spine fremspring, og F-actin plastre blev betragtet F-actin rige strukturer og blev inkluderet i vores undersøgelser (figur 3). Segmenter af anden ordens dendritter (MAP2-positive) blev udvalgt til analyse af F-actin puncta tætheder. MAP2 positiv farvning anvendes til at bekræfte den neuronale lokalisering af F-actin puncta. Computer-assisteret påvisning og tælling af Phalloidin (F-actin) mærket (grøn fluorescens kanal) synaptisk puncta blev udført via brug af specialiseret software. Der er en trinvis detaljeret protokol i figur 4 (r 2 = 0,97).

Tidligere brugte vi kvantificering af F-actin puncta at vurdere synaptodendritic skade induceret af HIV-1-Tat 9 og genrejsning efter HIV-1-Tat-induceret synaptopathy 10. I figur 5 rotte corticale neuroner blev co-mærket med Phalloidin og MAP2 antistof efter 50 nM HIV-1 Tat behandling. MAP2-farvning afslørede færre dendritiske grene og formindsket F-actin følgende HIV-1-Tat-behandling.

Vi fandt, at F-actin puncta kan enten stige eller falde som reaktion på eksperimentelle behandlinger. I figur 6 blev dyrkede neuroner behandlet med the konkurrencedygtige NMDA-receptorantagonist memantin, væsentlig forøgelse F-actin positive puncta. I modsætning hertil behandling med en kombination af methamfetamin + HIV-1-Tat i signifikant tab af F-actin puncta.

Figur 1
Figur 1. rottefosterceller corticale neuroner i cellekultur Differential interferens kontrast (DIC) billeder af føtal rotte corticale neuroner mellem 4 -. 27 dage in vitro (20X). Neuroner synes moden på 14 dage in vitro. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Phalloidin / MAP2 co-mærkning i rotte corticale neuroner. Kulturperler neuroner mærket med MAP2-antistof (rød) og Phalloidin (grøn). Flettede billeder tillader bestemmelse, at Phalloidin farvningen er lokaliseret til neuronale dendritter (20X). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. F-actin synaptiske strukturer af rotte corticale neuroner. (A) Venstre - F-actin positive strukturer mærket med Phalloidin (60X). De pilespidser indikerer F-actin mærkede strukturer omfatter champignon pigge (lilla), patch-lignende morfologi (blå) og lange filopodia (orange). Mellemøsten - Flettet billede viser disse F-actin strukturer lokaliseret til dendritter (20X). Right - Box i nederste højre angiver den anden ordens dendritiske gren udvalgt til analyse (20X) (B) Dendritiske segmenter af Phalloidin (F-actin) (Grøn) / MAP2. (Red) co-mærket kortikale neuroner (20X) bruges til at verificere neuronal oprindelse F-actin puncta. Den grønne eneste billede (Phalloidin / F-actin) videreforarbejdes. (C) Phalloidin / F-actin (grøn) billeder af tre dendritiske segmenter udvalgt til puncta optælling. Densiteter bestemmes ved at dividere N / l. N = antal puncta, L = længden af dendritiske segment. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Demonstration af softwarepakke:. Trin for trin instruktioner Klik her for at se en større version af dette tal.

/53697fig5.jpg "/>
Figur 5. HIV-1-Tat-medieret synaptodendritic skade i rotte corticale neuroner. Cellekulturer blev co-farvet for F-actin og MAP2 efter HIV-1 Tat-protein behandling (50nM). Øvre panels- ubehandlede neuroner viser robust F-actin, komplekse forgrening mønstre, og omfattende fine neuronale processer. Lavere paneler - HIV-1 Tat-protein behandlede neuroner med formindsket F-actin og nedsat dendritiske forgreninger. (20X) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. F-actin puncta i rotte corticale neuroner:. Forskellige effekter frembragt af Memantine vs. methamfetamin + Tat behandling Billeder (20X) af ubehandlede dyrkede neuroner, neuroner behandlet med Memantine (10 uM), og neuroner behandlet med MethamphEtamine (20 uM) +10 nM Tat (10 nM). Memantin behandling øgede F-actin farvning, mens metamfetamin + HIV-1 Tat behandling faldt F-actin farvning og nedsat dendritiske forgrening. Memantin behandling signifikant forøget F-actin puncta densitet, i forhold til ubehandlede kontrolkulturer. I modsætning hertil methamfetamin + HIV-1-Tat-behandlinger faldt betydeligt F-actin puncta densitet, i forhold til ubehandlede kontrolkulturer. Middel + SEM, * p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokol, beskriver vi dyrkning rotte kortikale neuroner ved lav tæthed i 35 mm glas-bottom retter, som gør det muligt for os at identificere dendritter af individuelle neuroner. Dernæst bruger vi Phalloidin og MAP2-farvning til påvisning dendritiske ændringer. Derefter brugte vi specialiseret software til at kvantificere ændringer i F-actin puncta.

For at bestemme ændringer i F-actin puncta hele neuronale netværk af en individuel neuron skal være tydeligt synlige, dette gør det muligt valg af passende anden ordens dendritiske segmenter fra en enkelt neuron. Low-density plating er kritisk for både at visualisere individuelle neuroner samt for at minimere forekomsten af ​​gliaceller. Astrocytter indeholder også F-actin og uden en neuronal markør, kunne forvirre analysen af ​​F-actin positive puncta. Lav massefylde kulturer og anvendelse af Neurobasal medium er nyttige i faldende astrocytisk proliferation i cellekulturerne. Men i betragtning det forbehold, at F-actin protein erikke specifikke for neuroner, specifikke neuronale proteinmarkører, såsom MAP2, bør anvendes sammen med Phalloidin. Andre protein antistoffer kan også anvendes sammen med Phalloidin, såsom TH (tyrosin hydroxylase) til identifikation af specifikke neuronale populationer i kultur.

En generel teknik til at studere synapser og synaptisk morfologi er immuncytokemi (ICC). ICC er populær, da mange antistoffer til synaptiske proteiner er let tilgængelige, herunder PSD 95, NMDAR (postsynaptisk) samt synaptophysin, fagot og synapsin I (præ-synaptisk) 11. Nogle strukturer ikke kan påvises ved ICC (såsom tynd filopodia), men en kombination af F-actin Phalloidin mærkning med antistof detektion (eller dobbelt mærkning med to forskellige antistoffer) kan tillade specifik og kompleks undersøgelse af synaptiske subpopulationer og differential reaktioner på eksperimentelle behandlinger.

F-actin puncta kan være particmæssigt følsomme over for eksperimentelle behandlinger. Vi har for nylig rapporteret, at behandling med HIV-1 Tat-protein produceret et fald i F-actin puncta (24 timer) før noget bevis for åbenlys neuronal død (48 timer) 10. Det er at bemærke, at eksperimentelle behandlinger kan enten stige (memantin) eller fald (metamfetamin + HIV-1 Tat) F-actin puncta. Vi fandt også, at F-actin puncta tab er en reversibel reaktion efter specifikke eksperimentelle behandlinger 10. Som sådan, F-actin puncta kvantificering er et værdifuldt værktøj til at overvåge ikke kun akut synaptopathy, men også for at studere synaptiske genopretning og eksperimentelle neurorestoration processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Kvantificering af Filamentøs actin (F-actin) puncta i Rat kortikale neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter