Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

חלבון אקטין פילמנטיות (F- אקטין) ממלא תפקיד מרכזי spinogenesis, הפלסטיות הסינפטית, ויציבות הסינפטי. שינויים במבנים להציע שינויים עשירים F- יקטינו הדנדריטים ביושרה הסינפטי וקישוריות. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש העיקרי, מכתים Phalloidin עבור puncta F- אקטין, וטכניקות כימות שלאחר מכן. ראשית, קליפת המוח הקדמית של עוברי חולדה E18 הם ניתק לתוך תרבית תאים בצפיפות נמוכה, אז הנוירונים לגדל במבחנה עבור 12-14 ימים לפחות. בעקבות הטיפול הניסיוני, הנוירונים בקליפת המוח מגואלות AlexaFluor 488 Phalloidin (לתייג את puncta F- אקטין הדנדריטים) ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2; כדי לאמת את תאים עצביים ויושרה הדנדריטים). לבסוף, תוכנה מיוחדת משמשת כדי לנתח ולכמת שנבחרו באקראי דנדריטים עצביים. F- תקטין מבנים עשירים מזוהים על ענפי הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 &# 181; מ ') עם immunofluorescence MAP2 הרציף. הפרוטוקול המובא כאן יהיה שיטה שימושית חוקר שינויים במבני סינפסה הדנדריטים לאחר טיפולים ניסיוניים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המטרה העיקרית של המחקר היא לפתח שיטה אמינה של מדידה (אמידה) של שלמות הסינפטי של רשת הדנדריטים העצבית. כאן אנו מתארים כימות של puncta F- אקטין ב נוירונים בתרבית עכברוש ראשוני באמצעות שילוב של מכתים Phalloidin ו immunocytochemical (ICC) זיהוי של דנדריטים עם לניתוח שלאחר מכן באמצעות מיוחדים (ש"ח- Elements) תוכנה.

יש תווית phallotoxins זיקה דומה חוטים גדולים וקטנים כאחד (F- אקטין) אבל לא להיקשר אקטין כדוריים monomeric (G אקטין), בניגוד לכמה נוגדנים אקטין 1. ספציפי המחייב של Phalloidin זניח, ובכך לספק רקע מינימלי במהלך הדמיה הסלולר. Phalloidin הוא קטן בהרבה נוגדנים יאפיין לתייג חלבונים תאיים עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המאפשר תיוג הרבה יותר אינטנסיבי של F- אקטין ידי Phalloidin. לפיכך, תמונות מפורטות של לוקליזציה F- אקטין בנוירונים יכול להיותהמושגים תוך כדי שימוש של Phalloidin שכותרתו.

Phalloidin (F- יקטין) מכתים של דנדריטים עצביים מייצר "נקודות חמות" בדידות או בהיר "puncta", אשר מייצגות מגוון הרחב של מבנים הדנדריטים, כוללים קוצים בוגרים, סינפסות הלא קוצניות 2 קוצים בשלה. הקוצים בשלה כוללים filopodia דק וכמה צורות של מורפולוגיה תיקון, עשוי לייצג את החניכה של spinogenesis 3. קוצים בשלה וטלאים הלא קוצניים חסרי PSD95 4. שינויים בייצור של F- אקטין להוביל לשינויים שלאחר מכן לא הקוצים, אלא גם מבנים הדנדריטים נוספים, ובכך Phalloidin כלי חשוב לחקירת שלמות synaptodendritic 5-7. באופן כללי, מספר Phalloidin החיובי (F- יקטין) puncta לשקף איזון בין הסינפסות פעילה (מעורר ו מעכבות), דינמיקה תקטין סינפסה יציבות 8.

למרות שחשוב ללמוד t הספציפיypes של סינפסות (כלומר, קוצים מעוררים), כאשר היעד של הטיפול אינו ידוע יש צורך להעריך את היושרה הכללית הראשונה של מגוון מבנים הדנדריטים. מאז F- אקטין מהווה מרכיב מרכזי של הקוצים הדנדריטים ומבנים אחרים, כולל סינפסות מעכבות, מספר שינו של F- אקטין puncta עשוי להצביע על synaptopathy. synaptopathy לאחר מכן יהיה אפשר מתחקיר לשינויים ספציפיים יותר. שיטת כימות שלנו לאיתור סוגים הסינפטי מרובים / מבנים מניבים הערכה כללית של שינויי סינפטיים הדנדריטים (עליות וירידות) בעקבות טיפולים ניסיוניים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הפרוטוקולים החיה היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר אבטחת: A3049-01).

1. צפיפות נמוכה עוברית תרבות העצבית

  1. הכנה תרבות נוירון קורטיקלי ראשוני
    1. פתרונות:
      1. הכן פתרון המניות פולי- L- ליזין על ידי המסת 5 מ"ג של פולי- L- ליזין ב 10 מ"ל חיץ Borate.
      2. הכן פתרון עובד על ידי דילול 1 מ"ל פולי- L- ליזין לניירות ערך 49 מ"ל Borate הצפת.
      3. הכן חיץ borate, pH 8.4 ידי מתחיל עם 395 מ"ל DH 2 O ולאחר מכן להוסיף את כל החומרים (1.24 חומצה בורית g + 1.9 גרם של בורקס). התאם ל- pH 8.4 ידי 1 M NaOH. התאם ל -400 מ"ל ולסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      4. הכן פתרון HBSS, pH 7.2 ידי מתחיל עם 445 מ"ל DH 2 O ולהוסיף את כל שאר החומרים (50 מ"ל 10X HBSS במלאי + 1.2 גרם HEPES). התאם ל- pH 7.2 ידי 1 N HCl, BRIng 500 מ"ל ולסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      5. כן בינוני ציפוי: DMEM / F12 עם 10% בסרום שור עובר. מסנן עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
      6. הכן בינוני צמיחה מלא: 50 מ"ל בינוני Neurobasal, להוסיף תוספי (500 μl Glutamax (100X) + 500 גלוקוז μl + 1 מ"ל B-27 (50X) + 500 μl של לאנטיביוטיקה Antimycotic פתרון (100X) + 100 μl 7.5% סודיום ביקרבונט. סינון עם מסנן קרום ניילון 0.2 מיקרומטר מתחת למכסה המנוע.
    2. יומיים לפני התרבות:
      1. מעיל עשר 35 מ"מ צלחות זכוכית התחתונה עם 2 מ"ל של תמיסת פולי- L- ליזין עובד, ולשמור תחת O ברדס / N.
    3. יום אחד לפני התרבות:
      1. סוכן ציפוי רוקן את הכלים ולשטוף עם DDH 2 O. אפשר מנות להתייבש במשך שעה מתחת למכסה המנוע.
      2. הכן בינוני ציפוי (DMEM / F12 עם 10% בסרום שור העובר (10% של פתרון כולל). פיפטה 2 מ"ל בינוני לתוךכל מנה, דגירה O / N ב 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2.
        הערה: חשוב להימנע מנות תרבות הפלסטיק כאשר culturing. שימוש בצלחות זכוכית תחתונה (עבור מיקרוסקופים הפוכים) או זכוכית coverslips (עבור מיקרוסקופים זקופים) מניבים תמונות חדות וברורות. לעומת צלחת פלסטיק תחתונה, מנת הזכוכית התחתונה נמנעה גוונים לא רצויים או בוהק במהלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. תא פרוטוקול תרבות:
    1. לשים בקירור מאגר HBSS (100-150 מ"ל), 100 מ"מ פטרי מנות, מלקחיים, מספריים, 50 מ"ל צינורות, ו -15 מ"ל צינורות תחת אור UV במנדף.
    2. להרדים חולדה בהריון עם שאיפה קטלני של sevoflurane 5% מתחת למכסה המנוע מחוץ לחדר התרבות.
    3. לעקר עם 70% EtOH, אוהל העור של הבטן התחתונה באמצעות מלקחיים תוך צמצום מזנב עד באמצע הבטן cavity.Open הרחם באמצעות מספריים לחשוף את השליה.
    4. הסר 8-10 עוברים E18. PlaCe 8-10 עוברים בצלחות פטרי המכילה פתרון HBSS.
    5. החזק את האחורי של הראש של העובר עם מלקחיים, ולאחר מכן להשתמש במספריים לנתק את הראש מהגוף. מניח אותו עוד צלחת פטרי מלאה 5-7 מיליליטר של HBSS. עבר צלחת מכסה מנוע.
    6. מלאו שתי בצלחת פטרי נוספת 100 מ"מ עם HBSS קר.
    7. גולגולת פיל הצידה, סקופ המוח לתוך צלחת פטרי חדש מלא HBSS.
    8. שימוש במלקחיים מעוקל חדה, המוח הקטן וגזע המוח נפרד מהמוח, ולאחר מכן להעביר המוח כדי בצלחת פטרי חדשה עם HBSS קר בו.
    9. להשתמש בפינצטה כדי לאבטח, להפריד בין ההמיספרות עם מלקחיים מעוקלים. סר קרום מוח; לבודד קליפת המוח הקדמית וחתיכות העברת לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל מסומן.
    10. מלאו את צינור 15 מ"ל עם 2 טריים מ"ל HBSS ולהוסיף 20 μl טריפסין EDTA (10x תערובת מרוכזת עם 0.5% טריפסין ו -5.3 מ"מ EDTA.) על צינור אחד 15 מ"ל.
    11. דגירה 10-15 דקות ב RT. מערבולת בעדינות צינור כל כמה דקות, לא לאפשר ליישוב.
    12. באפter 10-15 דקות, פיפטה זכוכית לשימוש, שנועד להסיר הישן HBSS ולשטוף פעמיים עם חדש HBSS.
    13. לטבול מעכב טריפסין (1 מ"ג / מ"ל, 2 מ"ג מעכב טריפסין ב 2 מ"ל HBSS), ומערבבים היטב ולתת לו לשבת 5 דקות. שטוף פעמים עם HBSS הטרי.
    14. באמצעות פיפטה זכוכית עם נורת גומי, חתיכות המוח triturate 10-15 פעמים מאוד לאט כדי להימנע bubbles.Triturate שוב בעזרת פיפטה מכויל טיפ סטרילי בקוטר טיפ מופחת מאוד לאט עד הומוגניות.
    15. העברת תאים ניתקה בצפיפות רצויה מראש הכינו מנות תרבות מצופות (50 תאים / מ"מ 2). O / N לדגור על 37 מעלות צלסיוס, 5% CO2.
    16. לאחר 24 שעות, להחליף בינוני DMEM / F12 עם מדיום Neurobasal סרום ללא צמיחה להשלים טרי.
    17. לשמור על התאים בכל עת בתוך חממה humidified אוויר 5% CO 2/95% מקום 12-14 ימים לפחות לפני ניסויים. להשלים את התאים כל 5-6 ימים עם בינוני טרי Neurobasal החליף כ -50% של המדיום הישן.

2. פלורסנט סימון Immunocytochemistry

הערה: תיוג immunofluorescent של תרביות תאים בקליפת המוח העיקרי בוצע במנות תרבית תאים תחתית זכוכית 35 מ"מ עם נפח העבודה של 1 מ"ל.

  1. שטפו את צלחת זכוכית התחתונה פעמיים עם pH מלוחים שנאגרו פוספט 7.4 (PBS).
  2. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות ב RT.
  3. פעמיים שטפו תאים עם PBS permeabilize עם 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 5 דקות.
  4. פנקו את התאים במשך 20 דקות ב RT עם כתם ספציפי F- אקטין, AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40, 25 μl של Phalloidin ב 1 מ"ל PBS).
  5. יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולחסום עם 10% עז בסרום נורמלי ב RT במשך 1-2 שעות.
  6. לדלל את נוגדן אנטי MAP2 polyclonal עוף (1: 2,500) ב- PBS עם 2% נסיוב עז נורמלי דגירה O / N ב 4 מעלות צלסיוס
  7. לאחר דגירה, לשטוף ב PBS פעמיים.
  8. לדלל את הנוגדנים משני (Alexa Red 594 מצומדות עז IgG אנטי-עוף (1: 500) עם 2% נסיוב עז נורמלי דגירה במשך שעה 2 ב RT.
  9. לשטוף עם PBS ולהוסיף 10 μl / תבשיל של צבע Hoescht.
  10. דגירה 3 דקות ב RT ולשטוף עם PBS פעמיים.
    הערה: תאים שכותרתו עכשיו מוכן לעבור לשלב 3 (F- אקטין ספירת puncta).
  11. שמור על מדגם התא עם 100 μl של antifade מגיב כסוכן coverslipping ולשמור על 4 o C בחושך עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: Phalloidin יציב יחסית PBS ב +4 ° C בחושך עד 1 בשבוע הקרינה יכול להישמר עם antifade ריאגנטים coverslipping. עם זאת, תמונות אופטימליות מתקבלות 1-3 ימים לאחר צביעה מאז Phalloidin יכול להתחיל לפזר את עם אחסון ממושך.

ספירת 3. F- אקטין puncta

  1. הפעל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולעבור 20 × אובייקטיבי. תוכנת מיקרוסקופ להרחיב, ולהקים תוכנית בגודל תמונה 1280 × 960 פיקסלים, ו -0.17 מיקרומטר / פיקסל רזולוציית תמונה 1 × זום.
  2. לרכוש תמונות של שכותרתו שיתוף F- אקטין / נוירונים MAP2 תחת ירוק (495 ננומטר) / אדום (613 ננומטר) ערוצי ניאון.
  3. בחר 5 גרין (F- אקטין) / אדום (MAP2) immunolabeled / כחול (Hoescht) תמונות ניאון של נוירון יחיד עם סוכות דנדריטים מוגדרים בבירור.
  4. זהה את המבנים העשירים F- יקטין במגזר הדנדריטים מסדר השני (טווח אורך 25-75 מיקרומטר) עם immunofluorescence MAP2 הרציף.
  5. סובב את האזור של תמונות נבחרות לרמה אופקית. העתק והדבק כתמונה חדשה.
  6. תפחית את הרקע של תמונות, באמצעות התאמות עקביות לכל צלחת.
  7. ספירת puncta F- יקטין ירוק הבהיר ואת עקבות אורך קטע הדנדריטים שנבחר באופן ידני על ידי משקיפים עצמאיים מאומנים. לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני.
  8. חשב את צפיפות על ידי חלוקת puncta שכותרתו F- אקטין הכולל (N) לפי אורך (L) של MAP2 שכותרתו דנדריטים. נתונים אקספרס כמספר של F-acpuncta פח לכל 10 מיקרומטר של דנדריט
    הערה: puncta (גודל ≤1.5 מיקרומטר) של הקרינה F- אקטין עם עוצמת שיא של 50% לפחות מעל העוצמה הממוצעת של מכתים בפיר הדנדריטים נכללו בכל מגזר הדנדריטים שנבחרו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשיטות הנוכחיות, אנו עכברוש התרבות הראשונה נוירונים בקליפת מוח בצפיפות נמוך ב -35 מ"מ צלחות זכוכית תחתונים, אשר מאפשרת לנו לזהות את דנדריטים של נוירונים בודדים. באיור 1, ניגוד התערבות ההפרש (DIC) התמונות להראות את השינויים המורפולוגיים בפיתוח נוירונים בקליפת מוח עכברוש העובר על ימי 4, 6, 10, 14, 21 ו -27 במבחנה. ראוי לציין, כי האורך ומספרם של הדנדריטים להגדיל ככל שמתבגרים של נוירונים עיקרי עכברוש תרבותי. נוירונים משמשים בניסויים רק לאחר הבשלת 14 ימים.

כדי לזהות שינויים הדנדריטים הסינפטי, אנו משלבים את תיוג Phalloidin F- אקטין עם זיהוי נוגדן MAP2 של דנדריטים. מאז תיוג Phalloidin של אקטין F הוא מאוד מהיר (20-30 דקות), אפשר חזותית להעריך את היושרה של רשת synaptodendritic לפני שתמשיך עם תיוג נוגדן ICC (איור 2

לאחר מכן, אנו רוכשים תמונות ברזולוציה גבוהה של שיתוף שכותרתו Phalloidin (F- אקטין) / MAP2 נוירונים ונותחו נוירונים שנבחרו באקראי. Filopodia פיין, בליטות עמוד שדרה, ו- F יקטין טלאים נחשבו מבנים עשירים F יקטין שהשתתפו במחקרים שלנו (איור 3). מגזרי של דנדריטים מסדר שני (MAP2 חיובית) נבחרו לניתוח צפיפויות puncta F- אקטין. מכתים חיובי MAP2 משמש כדי לאשר את הלוקליזציה העצבית של puncta F- יקטין. בסיוע מחשב איתור ספירת Phalloidin (F- יקטין) שכותרתו (ערוץ פלואורסצנטי ירוק) puncta הסינפטי בוצע באמצעות שימוש בתוכנות מיוחד. יש צעד אחר צעד פרוטוקול מפורט באיור 4 2 = 0.97).

בעבר, השתמשנו כימות של puncta F- אקטין להעריך פגיעה synaptodendritic המושרה על ידי HIV-1 טאט 9 והתאוששות מ- HIV-1 טאט-induced synaptopathy 10. באיור 5, נוירונים בקליפת המוח עכברוש היו שיתוף שכותרתו עם הנוגדן Phalloidin ו MAP2 לאחר 50 ננומטר של הטיפול ב- HIV-1 טאט. מכתים MAP2 גילה פחות סניפים הדנדריטים והפחיתו F- אקטין הבאים HIV-1 טאט-טיפול.

מצאנו כי F- אקטין puncta רשאי לעלות או לרדת בתגובה טיפולים ניסיוניים. באיור 6, נוירונים בתרבית טופלו הממנטין דואר אנטגוניסט לרצפטור NMDA התחרותי, להגדיל באופן משמעותי F- יקטין puncta החיובית. לעומת זאת, טיפול עם שילוב של מתאמפטמין + HIV-1 טאט הביאה לירידה משמעותית של puncta F- אקטין.

איור 1
איור 1. נוירונים בקליפת המוח עכברוש והעובר בבית תרבית תאים התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש העובר בין 4 -. 27 ימים במבחנה (20X). נוירונים מופיעים בוגרים בגיל 14 ימים במבחנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. Phalloidin / MAP2 שיתוף תיוג ב נוירונים בקליפת המוח חולדה. נוירונים בתרבית שכותרתו עם MAP2 נוגדן (אדום) ו Phalloidin (ירוק). תמונות הממוזגת לאפשר קביעה כי מכתים Phalloidin הוא מקומי דנדריטים עצביים (20X). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. F- אקטין מבנים סינפטיים של נוירונים בקליפת המוח עכברוש. (א) שמאל - F- יקטין מבנים חיוביים שכותרתו עם Phalloidin (60X). ראשי חץ עולה מבנים שכותרתו F- אקטין כוללים קוצים פטריות (סגול), תיקון- כמו מורפולוגיה (כחול) filopodia ארוך (כתום). תיכון - תמונה ממוזגת הוכחת מבנים אלה F- יקטינו הם נקודות כדי דנדריטים (20X). עכבר - התיבה בפינה ימנית תחתונה מציינת את הסניף השני כדי הדנדריטים שנבחר לניתוח (20X) (B) מגזרים דנדריטים של Phalloidin (F- יקטין) (ירוק) / MAP2. (אדום) שכותרתו שיתוף נוירונים בקליפת מוח (20X) משמש לאימות מקור עצבי של puncta F- יקטין. התמונה רק ירוק (Phalloidin / F- אקטין) עוברת תהליכי עיבוד נוספים. (ג) Phalloidin / F- אקטין (ירוק) תמונות של שלושה מגזרים הדנדריטים שנבחרו עבור ספירת puncta. צפיפויות נקבעות על ידי חלוקת N / L. N = מספר puncta, L = אורך של קטע הדנדריטים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. הפגנה של חבילת תוכנה:. שלב שלב לפי הוראות אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/53697fig5.jpg "/>
איור 5. HIV-1 טאט בתיווך פציעה synaptodendritic ב נוירונים בקליפת המוח חולדה. בתרביות תאים היו שיתוף מוכתם עבור F אקטין MAP2 לאחר HIV-1 טאט טיפול חלבון (50nm). עליון panels- נוירונים מטופל מראים F- תקטין חזק, דפוסי הסתעפות מורכבים, תהליכים עצביים בסדר נרחבים. לוחות תחתונים - HIV-1 טאט נוירונים מטופלי חלבון עם הסתעפות פחתה F- יקטין וירידה הדנדריטים. (20X) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. F- אקטין puncta בנוירונים חולדה קליפת המוח:. אפקטים שונים המיוצרים על ידי אביקסה לעומת מתאמפטמין + טאט טיפול תמונות (20X) של נוירונים בתרבית מטופל, נוירונים שטופלו אביקסה (10 מיקרומטר), ונוירונים שטופלו Methamphetamine (20 מיקרומטר) +10 ננומטר של טאט (10nm). טיפול אביקסה הגדילה את מכתים F- אקטין, ואילו מתאמפטמין + HIV-1 תאת הטיפול ירד F- אקטין מכתים וירידה הסתעפות הדנדריטים. טיפול אביקסה גדל באופן משמעותי צפיפות puncta F- אקטין, ביחס לתרבויות קבוצת הביקורת. לעומת זאת, מתאמפטמין + HIV-1 טאט טיפולים ירידה משמעותית בצפיפות puncta F- אקטין, ביחס לתרבויות קבוצת הביקורת. ממוצע + SEM, * p <0.05. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בפרוטוקול זה, אנו מתארים culturing נוירונים בקליפת המוח עכברוש בצפיפות נמוכה במנות 35 מ"מ זכוכית התחתונה אשר מאפשר לנו לזהות דנדריטים של נוירונים בודדים. לאחר מכן, אנו משתמשים Phalloidin ו MAP2 מכתים כדי לזהות שינויים הדנדריטים. לאחר מכן, השתמשנו בתוכנה מיוחדת כדי לכמת שינויים puncta F- אקטין.

כדי להבחין בשינויי F- יקטין puncta הרשת העצבית כולה של נוירון יחיד חייבת להיות ברורה לעין, זה מאפשר מבחר קטעי הדנדריטים מסדר השנייה מתאים מתוך תא העצב יחיד. ציפוי בצפיפות נמוכה היא קריטית על מנת הן לדמיין נוירונים בודדים כמו גם כדי למזער את הנוכחות של תאי גליה. האסטרוציטים גם מכילים F- תקטין וללא סמן עצבי, יכולים לבלבל בניתוח puncta החיובית F- יקטין. תרבויות בצפיפות נמוכה ושימוש בינוני Neurobasal מועילים בהפחתת התפשטות astrocytic ב בתרביות תאים. עם זאת, בהתחשב אזהרה כי חלבון ה- F- אקטין הואלא ספציפית נוירונים, סמני חלבון מסוימים עצביים, כגון MAP2, צריך לשמש יחד עם Phalloidin. נוגדנים לחלבון אחרים עשויים גם לשמש בשילוב עם Phalloidin, כגון TH (hydroxylase טירוזין) לזיהוי של אוכלוסיות נוירונים ספציפיים בתרבות.

טכניקה כללית אחת ללימוד הסינפסות מורפולוגיה הסינפטי הוא immunocytochemistry (ICC). ICC הוא פופולרי מאז נוגדנים רבים עבור חלבונים סינפטיים זמינים כולל PSD 95, NMDAR (הפוסט סינפטי) וכן synaptophysin, בסון ו synapsin לי (מראש הסינפטי) 11. עם זאת, כמה מבנים לא יכול להיות מזוהים על ידי בית הדין הפלילי הבינלאומי (כגון filopodia הדק), אלא שילוב של תיוג Phalloidin F- יקטין עם זיהוי נוגדנים (או תיוג כפול עם שני נוגדנים שונים) עשוי לאפשר חקירה פרטנית והמורכבת של תת-אוכלוסיות הסינפטי ותגובות משתנות טיפולים ניסיוניים.

F- אקטין puncta עשוי להיות particularly רגיש טיפולים ניסיוניים. דיווחנו לאחרונה כי טיפול ב- HIV-1 טאט חלבון המיוצר ירידה puncta F- אקטין (24 שעות) לפני כל ראיות התומכות ומוות עצבי גלויה (48 שעות) 10. יש לשים לב כי טיפולים ניסיוניים יכול גם עלייה (ממנטין) או ירידה (מתאמפטמין + HIV-1 Tat) puncta F- אקטין. גם מצאנו כי F- יקטין אובדן puncta הוא תגובה הפיכה בעקבות טיפולים ניסיוניים ספציפיים 10. ככזה, כימות puncta F- יקטין הוא כלי רב ערך כדי לפקח לא רק synaptopathy חריפה, אלא גם ללימוד התאוששות הסינפטי ותהליכי neurorestoration הניסיונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
כימות פילמנטיות אקטין (F- אקטין) puncta ב עכברוש נוירונים קליפתיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter