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Neuroscience

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F - 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F - 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 - 관련 단백질 2 (수지상 F - 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.

Introduction

본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F - 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다.

레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 ​​가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F - 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F - 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을.

Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F - 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의 다양한 표현 이산 "핫스팟"또는 밝은 "puncta에"를 생성합니다. 미성숙 등뼈 얇은 filopodia 패치 형태의 일부 형태를 포함하고 spinogenesis 3의 개시를 나타낼 수있다. 미성숙 가시 및 비 - 가시 패치 PSD95 4 부족하다. 뿐만 아니라 등뼈의 후속 변경뿐만 아니라 추가 수지상 구조에 F - 굴지의 납 생산의 변화, 따라서 synaptodendritic 무결성 5-7을 조사하기위한 중요한 도구 Phalloidin의 제작. 일반적으로, Phalloidin의 양성 (F - 굴지) puncta의의 수는 활성 시냅스 사이의 균형 (흥분성과 억제), 굴지 역학과 시냅스 안정성 (8)을 반영한다.

특정 t을 연구하는 중요하지만치료의 대상이 알려지지 않은 경우에 시냅스 (즉, 흥분성 등뼈)의 씨네마 스테이션 먼저 수지상 구조의 다양한 일반 무결성을 추정 할 필요가있다. F - 굴지는 억제 시냅스, synaptopathy을 나타낼 수 F - 굴지 puncta에의 변경 번호를 포함 돌기 쪽과 다른 구조의 주요 구성 요소이기 때문에. 이 synaptopathy는보다 구체적인 변경에 대한 추가 조사를 할 수있다. 여러 시냅스 유형 / 구조를 검출하기위한 우리의 정량화 방법은 다양한 실험적인 치료 다음과 같은 돌기 시냅스 변화 (증가 및 감소)의 전체 추정치를 산출한다.

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Protocol

모든 동물 프로토콜을 검토하고 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호 : A3049-01)에 의해 승인되었다.

1. 저밀도 배아 신경 문화

  1. 기본 대뇌 피질의 신경 세포 배양을위한 준비
    1. 솔루션 :
      1. 10 ml의 보레이트 완충액에 폴리 -L- 리신 5mg을 용해시켜 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 제조 하였다.
      2. 49 ml의 붕산염 완충액 1 ml의 폴리 - L - 라이신 주식을 희석하여 솔루션을 작동 준비합니다.
      3. 395 ml의 DH 2 O로 시작하고 모든 재료 (붕사의 1.24 g의 붕산 + 1.9 g)을 추가하여 붕산 완충액, pH가 8.4을 준비합니다. 1 M의 NaOH로 pH를 8.4로 조정합니다. 400 ml의 조정 및 후드 아래에 0.2 μm의 나일론 멤브레인 필터로 필터링 할 수 있습니다.
      4. 445 ml의 DH 2 O로 시작하는 다른 모든 성분을 추가하여 HBSS 용액의 pH 7.2을 준비합니다 (50 ㎖ 10X HBSS 재고 + 1.2 g HEPES). 1 N 염산, 브리에 의해 7.2의 pH를 조정NG 500 ㎖의 후드 아래에 0.2 ㎛의 나일론 멤브레인 필터로 필터링.
      5. 10 % 소 태아 혈청 DMEM / F12 : 도금 매체를 준비합니다. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 필터링.
      6. 전체 성장 매체를 준비 : 50 ㎖로 Neurobasal 매체에, 보충 교재를 추가 (500 μL 루타 (100X) + 500 μL 포도당 항생제 - 안티 곰팡이 솔루션 (100X의 + 1 ML의 B-27 (50X) + 500 μL) + 100 ㎕의 7.5 % 중탄산 나트륨. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 여과.
    2. 이틀 문화 전 :
      1. 2 폴리 - L - 라이신 작업 용액 ㎖의, 그리고 후드 O / N에서 유지와 코트 열두 35mm의 유리 바닥 요리.
    3. 문화 전 어느 날 :
      1. DDH 2 O와 빈 코팅 요리에서 에이전트와 린스 요리 후드 아래 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
      2. 10 % 소 태아 혈청 (총 용액의 10 %)와 도금 배지 (DMEM은 / F12를 준비한다. 피펫 2ml의 배지 내로각각의 요리는, 37 O를 C, 5 % CO 2에서 O / N을 품어.
        참고 : 배양 할 때 플라스틱 문화 요리를 방지하는 것이 중요하다. 유리 바닥 (반전 현미경) 요리 또는 (직립 현미경) 커버 글라스의 사용은 샤프하고 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 플라스틱 바닥 접시에 비해 유리 바닥 접시 형광 현미경 동안 원치 않는 색상이나 눈부심을 방지 할 수 있습니다.
  2. 세포 배양 프로토콜 :
    1. HBSS 버퍼 (100 ~ 150 ㎖), 냉장 넣어 100mm 배양 접시, 집게, 가위, 50 ㎖ 튜브 및 후드 UV 빛 아래 15 ml의 튜브.
    2. 문화 실의 외부 후드 5 % 세보의 치명적인 흡입 임신 쥐를 안락사.
    3. 70 %의 EtOH 텐트 복부 cavity.Open 태반을 노출 가위를 이용하여 자궁 중간 꼬리로부터 절단하면서 집게를 사용하여 복부의 피부를 소독.
    4. 8-10 E18 태아를 제거합니다. 놀이터HBSS 솔루션을 포함하는 배양 접시에 8-10 태아를 CE.
    5. 집게로 태아의 머리 뒤쪽을 잡고, 다음 몸에서 머리를 절단 가위를 사용합니다. HBSS의 5-7 ml를 가득 다른 배양 접시에 넣습니다. 후드에 접시를 전송합니다.
    6. 차가운 HBSS와 두 개의 추가 100mm 페트리 접시를 입력합니다.
    7. 껍질 옆으로 두개골, 그리고 HBSS로 가득 찬 새로운 배양 접시에 머리를 특종.
    8. 다음에 차가운 HBSS로 새로운 배양 접시에 두뇌를 전송, 뇌에서 날카로운 곡선 집게, 별도의 소뇌와 뇌간을 사용합니다.
    9. 곡선 집게와 반구를 분리, 고정 핀셋을 사용합니다. 수막을 제거; 표시 15 ML의 원심 분리기 튜브에 정면 피질 및 전송 조각을 격리 할 것.
    10. 신선한 2 ml의 HBSS로 15 ML 튜브를 입력하고 각 15 ML 튜브에 20 μL 트립신 EDTA (0.5 % 트립신 및 5.3 mM의 EDTA.와 10 배 농축 혼합물)를 추가합니다.
    11. RT에서 10 ~ 15 분을 품어. 부드럽게 관에게 몇 분마다 소용돌이, 정착 허용하지 않습니다.
    12. AF터 10 ~ 15 분 사용 유리 피펫 오래된 HBSS를 제거하고 새로운 HBSS로 두 번 씻어합니다.
    13. (2 ml의 HBSS 1 ㎎ / ㎖, 2 mg을 트립신 억제제) 트립신 억제제에 빠져, 잘 혼합하고 5 분 앉아 보자. 신선한 HBSS로 두 번 씻으십시오.
    14. 다시 보정 피펫 매우 균질해질 때까지 서서히 감소 팁 직경 멸균 팁을 사용 bubbles.Triturate을 피하기 위해 매우 천천히 씹다 뇌 피스 고무 전구 10-15 번 유리 피펫을 사용.
    15. 전송 원하는 농도에서 세포를 해리에 코팅 된 배양 접시 (50 셀 / mm2 인) 준비된 사전. 37 O C, 5 % CO2에서 O / N을 품어.
    16. 24 시간 후, 갓 만든 완전한 성장 혈청 무료로 Neurobasal 매체 DMEM / F12 매체를 교체합니다.
    17. 실험 전에 적어도 12~14일 대해 5 % CO 2 / 95 %의 실내 공기의 가습 인큐베이터에서 항상 세포를 유지한다. 신선한 배지로 Neurobasal 이전 매체의 약 50 %를 교체하는 모든 5-6일 세포를 보완.

2. 형광 라벨링 및 면역 세포 화학

주 : 일차 대뇌 피질 세포 배양의 면역 라벨 1 ㎖가 작동 부피 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 행했다.

  1. 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)로 두 번 유리 바닥 접시를 씻으십시오.
  2. 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 수정.
  3. PBS로 두 번 세포를 씻으 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 Permeabilize 하시려면.
  4. F - 굴지 특정 얼룩 실온에서 20 분 동안 세포 치료, AlexaFluor 488 Phalloidin의 (1시 40분, 1 ml의 PBS에서 Phalloidin의 25 μL).
  5. PBS로 두 번 세포를 씻어 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단합니다.
  6. 2 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 4 O ℃에서 O / N을 부화 : 닭 항 MAP2 클론 항체 (2500 1) 희석
  7. 배양 한 다음, 두 번 PBS에 헹군다.
  8. 이차 항체 (알렉사 R 희석ED 594 - 복합 염소 항 - 닭 IgG를 (1 : 500) 2 % 정상 염소 혈청와 실온에서 2 시간 동안 품어.
  9. PBS로 헹구고 10 μL / Hoescht 염료의 요리를 추가합니다.
  10. RT에서 3 분을 품어 PBS로 2 회 씻는다.
    참고 : 3 단계 (F - 굴지 puncta의 계산) 이제 표지 세포가 준비.
  11. coverslipping 제로 antifade 시약 100 ㎕로 세포 샘플을 보존 및 장기 저장을 위해 어둠 속에서 4 ℃로 유지한다.
    참고 : Phalloidin의이 antifade coverslipping 시약으로 보존 할 수 일주 형광까지의 어둠 속에서 4 ℃에서 PBS에서 상대적으로 안정적이다. Phalloidin의 확장 된 스토리지 밖으로 확산 시작할 수 있기 때문에, 최적의 이미지는 염색 후 1-3일를 얻을 수있다.

3. F - 굴지 puncta의 카운팅

  1. 형광 현미경의 전원을 켜고 20 × 목표로 전환합니다. 오픈 현미경 소프트웨어, 1280 × 960 화소의 화상 사이즈에 프로그램을 설정하고, 0.11 배 줌에 7 μm의 / 픽셀 이미지 해상도.
  2. 빨강, 녹색 (495 ㎚) / (613 ㎚) 형광 채널에서 공동 표지 F - 굴지 / MAP2 뉴런의 이미지를 획득.
  3. 5 그린 (F - 굴지) / 레드 (MAP2) immunolabeled / 블루 (Hoescht) 명확하게 정의 된 수지상 아버 개별 신경 세포의 형광 이미지를 선택합니다.
  4. 연속 MAP2의 면역와 두 번째 순서 수지상 세그먼트 (길이 범위 25 ~ 75 μm의)에서 F - 굴지 풍부한 구조를 확인합니다.
  5. 수평 수준으로 이미지의 선택 영역을 돌립니다. 새로운 이미지로 복사 및 붙여 넣기.
  6. 각 접시에 대한 일관성을 조정하여, 이미지의 배경을 뺀다.
  7. 밝은 녹색 F - 굴지 puncta의 카운트 수동으로 훈련 된 독립적 인 관찰자에 의해 선택 수지상 세그먼트의 길이를 추적. 스프레드 시트 파일에 데이터를 보냅니다.
  8. MAP2는 수상 돌기 레이블의 길이 (L)에 의해 총 F - 굴지 라벨 puncta에 (N)을 나누어 밀도를 계산합니다. F-교류의 수와 같은 고속 데​​이터수상 돌기의 10 μm의 당 주석 puncta의
    참고 puncta의 수지상 샤프트 염색의 평균 강도보다 최소한 50 %의 피크 강도 F 액틴 형광 (크기 ≤1.5 것이 μm의) 각각의 선택된 수지상 세그먼트에 포함되었다.

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Representative Results

본 발명의 방법에서, 우리는 첫 번째 문화 쥐 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 대뇌 피질의 뉴런. 도 1에있어서, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 일 4, 6, 10, 시험관 내에서 14, 21 및 27에서 태아 래트 피질 뉴런 개발 형태 변화를 나타낸다. 길이와 수상 돌기의 수는 배양 된 쥐 주 신경 세포의 성숙에 따라 증가합니다. 뉴런은 단지 14 일 숙성 한 후 실험에 사용된다.

수상 및 시냅스 변화를 감지하기 위해, 우리는 수상 돌기의 MAP2 항체 검출을 Phalloidin의 F - 굴지 라벨을 결합한다. F 액틴의 Phalloidin의 라벨링 (20-30 분)이 매우 빠르게되기 때문에 시각적 ICC 항체 표지 (도 2를 계속하기 전에 synaptodendritic 네트워크의 무결성을 추정하는 것이 가능하다

다음으로, 공동 - 표지 Phalloidin의 (F 액틴) / MAP2 뉴런의 높은 해상도 이미지를 획득하고 임의로 선택 뉴런을 분석 하였다. 파인 filopodia, 척추 돌기, 및 F - 굴지 패치는 F - 굴지 풍부한 구조를 고려하고, 우리의 연구 (그림 3)에 포함되었다. (MAP2 양수) 2 차 덴 드라이트의 세그먼트 F 액틴 puncta의 밀도 분석을 위해 선별 하였다. MAP2 긍정적 인 염색은 F - 굴지 puncta에의 신경 현지화를 확인하는 데 사용됩니다. 컴퓨터를 이용한 감지 및 Phalloidin의 (F - 굴지) 표시 (녹색 형광 채널)의 계산은 시냅스 puncta의는 전문 소프트웨어의 사용을 통해 수행되었다. 그림 4의 단계 자세한 프로토콜에 의해 단계가있다 2 = 0.97) 매우 높은 것으로보고있다.

이전에, 우리는 HIV-1 문신 유도 synaptopathy (10)로부터 HIV-1 문신 9 및 복구에 의해 유도 synaptodendritic 부상을 평가하기 위해 F - 굴지 puncta에의 정량을 사용했다. 그림 5에서, 쥐의 대뇌 피질의 뉴런은 공동 표시했다 HIV-1 문신 치료의 50 nM의 후 Phalloidin의 및 MAP2 항체. MAP2 염색 적은 수지상 가지를 공개하고 HIV-1 문신 처리 다음 F - 굴지을 감소.

우리는 발견 F - 굴지 puncta의 실험적 치료에 응답하여 증가 또는 감소하거나 할 수있다. 도 6에서 배양 된 뉴런 번째로 처리E 경쟁력 NMDA 수용체 길항제 메만 틴은 크게 F 액틴 양성 puncta의 증가. 대조적으로, 암페타민 + HIV-1 타트의 조합 치료는 F 액틴 puncta에 상당한 손실을 초래.

그림 1
그림 세포 배양 1. 태아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 (4) 사이의 태아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 -. 체외에서 27 일 (20 배). 신경 세포는 시험관 14 일째 성숙 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
쥐의 대뇌 피질의 뉴런 그림 2. Phalloidin의 / MAP2 공동 라벨. MAP으로 표시 배양 된 뉴런2 항체 (적색)과 Phalloidin의 (녹색). 병합 된 이미지는 Phalloidin의 얼룩은 신경 세포의 수상 돌기 (20 배)에 지역화 결정. 허용 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 그림 3. F - 굴지 시냅스 구조. (A) 왼쪽 - Phalloidin의 (60X)로 표시된 F - 굴지 긍정적 인 구조. 화살촉은 F - 굴지 라벨 구조 버섯 쪽이 (보라색), 패치와 같은 형태 (파란색)과 긴 filopodia (오렌지)를 포함 나타냅니다. 중동 -이 F - 굴지 구조를 보여 병합 된 이미지는 수상 돌기 (20 배)로 현지화되어있다. 마우스 오른쪽 - 오른쪽 아래에있는 박스 분석 (20X) 선택 2 차 수지상 분기를 나타냅니다 (B) Phalloidin의 (F-액틴) (녹색) / MAP2의 수지상 세그먼트. (레드) 공동 표지 대뇌 피질의 뉴런 (20X)는 F - 굴지 puncta에의 신경 출처를 확인하는 데 사용됩니다. 녹색 전용 이미지 (Phalloidin의 / F - 굴지)을 추가로 처리됩니다. puncta의 계산으로 선택 세 수지상 세그먼트 (C) Phalloidin의 / F - 굴지 (녹색) 이미지. 밀도는 N / L 분할에 의해 결정됩니다. N = puncta에, L = 수지상 세그먼트의 길이의 수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
소프트웨어 패키지의 4 데모도 :. 단계별 지침을 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5. HIV-1 문신은 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에 synaptodendritic 부상을 매개. 세포 배양은 HIV-1 문신 단백질 처리 (50 나노) 후 F - 굴지 및 MAP2에 대한 공동 염색 하였다. 위는 강력한 F - 굴지 복잡한 분기 패턴 및 광범위한 미세 신경 처리를 나타내는 치료 신경을 panels-. 낮은 패널 - F - 굴지 감소 및 감소 수지상 분기와 HIV-1 문신 단백질 처리 신경. (20X)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6. F - 굴지 쥐의 대뇌 피질의 뉴런에서 puncta의 :. 메스 암페타민 + 문신 처리 대 메만 틴에 의해 생성 된 다양한 효과 처리되지 않은 배양 된 신경 세포의 이미지 (20 배), 메만 틴 (10 μM)로 처리 뉴런과 뉴런 Methamph 처리etamine (20 μM) 문신 (10 ㎚)의 10 nM의. 메스 암페타민 + HIV-1 문신 처리가 F - 굴지 염색을 감소 수지상 분기 감소하는 반면 메만 틴 치​​료, F - 굴지 염색 증가했다. 메만 틴 치​​료 크게되지 않은 대조군 배양액에 대하여 F-액틴 puncta의 밀도를 증가. 반면, 메스 암페타민 + HIV-1 문신의 치료는 크게 치료 컨트롤 문화에 대해 F - 굴지 puncta의 밀도를 감소. + SEM 평균, * P <0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F - 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다.

F - 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네트워크가 명확하게 볼 수 있어야 변화를 확인하려면,이 하나의 신경 세포에서 적절한 번째 순서 수지상 세그먼트를 선택할 수 있습니다. 저밀도 도금 개별 뉴런을 시각화뿐 아니라 아교 세포의 존재를 최소화하기 위해 모두 중요하다. 성상 세포는 F - 굴지을 포함하고 신경 세포 마커없이, F - 굴지 긍정적 인 puncta의 분석을 혼동 할 수있다. 저밀도 문화로 Neurobasal 배지의 사용은 세포 배양에서 성상 세포의 증식을 감소 시키는데 도움이된다. 그러나, F-액틴 단백질임을주의 주어진뉴런 등 MAP2 같은 특정 신경 단백질 마커에 특이하지 Phalloidin의 병용한다. 기타 단백질 항체는 배양 신경 세포 집단의 특정 식별 이러한 TH 등 Phalloidin의 (티로신 히드 록 실라 제)와 함께 사용될 수있다.

시냅스와 시냅스 형태를 연구하기위한 하나의 일반적인 기술은 면역 세포 (ICC)입니다. 시냅스 단백질에 대한 많은 항체가 PSD (95)을 포함하여 쉽게 사용할 수 있기 때문에 ICC가 인기가있다, (포스트 시냅스)과 synaptophysin에, 바순과 I (사전 시냅스) synapsin NMDAR은 그러나 일부 구조는 ICC (예 : 감지 할 수 없습니다 (11) 얇은 filopodia), 그러나 항체 검출 (또는 두 개의 서로 다른 항체를 두 번 표시와 F - 굴지 Phalloidin의 라벨의 조합) 시냅스 소집단 실험 치료에 차동 응답의 특정 복잡한 조사를 허용 할 수있다.

F - 굴지 puncta에이 partic 수있다실험적인 치료에 ularly 민감한. 우리는 최근 HIV-1 문신 단백질 치료가 명백한 신경 세포의 죽음 (48 시간) 10 증거 이전에 F - 굴지 puncta에 (24 시간)의 감소를 생산 보도했다. 그것은 참고 그 실험 처리 할 수​​있다 하나 증가 (메만 틴) 또는 감소 (필로폰 + HIV-1 문신) F - 굴지 puncta에이다. 우리는 또한 F - 굴지 puncta의 손실이 특정 실험 치료 (10) 다음 가역 반응 것으로 나타났습니다. 따라서, F - 굴지 puncta의 정량 급성 synaptopathy뿐만 아니라, 시냅스 복구 및 실험 신경 복원 과정을 공부뿐만 아니라 모니터링하는 유용한 도구입니다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량
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Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

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