Abstract
proteína actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na spinogenesis, plasticidade sináptica, e estabilidade sináptica. Mudanças nas estruturas ricas F-actina dendríticas sugerem alterações na integridade sináptica e conectividade. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de rato primária neurônios corticais, coloração faloidina para puncta F-actina, e técnicas de quantificação subsequentes. Em primeiro lugar, o córtex frontal de embriões de rato E18 são dissociados em cultura celular de baixa densidade, em seguida, os neurónios cultivados in vitro durante pelo menos 12-14 dias. Após o tratamento experimental, os neurônios corticais estão manchadas com AlexaFluor 488 faloidina (para rotular o puncta F-actina dendrítica) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2; para validar as células neuronais e integridade dendrítica). Finalmente, software especializado é usado para analisar e quantificar dendrites neuronais selecionados aleatoriamente. F-actina estruturas ricas são identificados na segunda ordem ramos dendríticas (variação de comprimento 25-75 &# 181; m) com imunofluorescência MAP2 contínua. O protocolo apresentado aqui vai ser um método útil para investigar mudanças nas estruturas sinapse dendríticas subsequentes aos tratamentos experimentais.
Introduction
O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método fiável de medição (estimativa) de integridade sináptica da rede dendrítica neuronal. Aqui nós descrevemos quantificação de puncta F-actina em ratos primário neurônios cultivados usando uma combinação de coloração faloidina e detecção imunocitoquímica (ICC) de dendrites com posterior análise usando software especializado (NIS-Elements).
Falotoxina rotulados têm afinidade semelhante tanto para grandes e pequenos filamentos (F-actina), mas não se ligam a monomérica actina globular (G-actina), ao contrário de alguns anticorpos de actina 1. A ligação não específica de faloidina é insignificante, proporcionando assim fundo mínima durante imagiologia celular. Faloidina é muito menor do que os anticorpos que seria normalmente usado para marcar as proteínas celulares para a microscopia de fluorescência, o que permite muito mais intensa marcação da actina F por faloidina. Assim, imagens detalhadas de localização F-actina em neurônios pode serobtida através do uso de faloidina etiquetada.
Phalloidin (F-actina) coloração das dendrites neuronais gera discretos "pontos quentes" ou brilhante "puncta", que representam uma variedade de estruturas dendríticas, incluindo espinhas maduras, sinapses não-espinhosos 2 e espinhas imaturos. Espinhos imaturos incluem filopódios finas e algumas formas de morfologia remendo, e pode representar o início de spinogenesis 3. Espinhos imaturos e patches não-espinhosos falta PSD95 4. Mudanças na produção de chumbo F-actina para alterações subsequentes não só espinhos, mas também estruturas dendríticas adicionais, tornando assim faloidina uma ferramenta importante para a investigação de integridade synaptodendritic 5-7. Em geral, o número de (F-actina) puncta faloidina-positivos refletem um equilíbrio entre as sinapses ativas (excitatórios e inibitórios), dinâmica de actina e estabilidade sinapse 8.
Embora seja importante para o estudo específico tYpes de sinapses (isto é, espinhas excitatórios), quando o alvo de um tratamento é desconhecido, é necessário primeiro estimar a integridade geral de uma variedade de estruturas dendríticas. Uma vez que a actina F é um componente importante das espinhas dendriticas e outras estruturas, incluindo sinapses inibitórias, um número alterado de pontos lacrimais F-actina pode indicar um synaptopathy. Este synaptopathy pode então ser mais investigada para alterações mais específicos. O nosso método de quantificação para a detecção de vários tipos / sinápticas estruturas produz uma estimativa global das alterações sinápticas dendríticas (aumentos e diminuições) após vários tratamentos experimentais.
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Protocol
Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia: A3049-01).
1. baixa densidade Embryonic Neuronal Cultura
- Preparação para a primária neurônio cultura cortical
- soluções:
- Preparar a solução da poli-L-lisina por dissolução de 5 mg de poli-L-lisina em 10 ml de tampão de borato.
- Preparar uma solução de trabalho por diluição de 1 ml de poli-L-lisina em 49 ml da tampão de Borato.
- Preparar tampão de borato, pH 8,4, iniciando com 395 ml de dH 2 O e em seguida a adição de todos os ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar o pH para 8,4 com NaOH 1 M. Ajustar a 400 ml e filtrar com filtro de membrana de nylon 0,2 m sob o capô.
- Preparar a solução de HBSS, pH 7,2, iniciando com 445 ml de dH 2 O e a adição de todos os outros ingredientes (50 mL de Stock 10X HBSS + 1,2 g de HEPES). Ajustar o pH para 7,2 com HCl 1 N, BRIng para 500 ml e filtrar com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
- Prepare meio de plaqueamento: DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10%. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
- Preparar o meio de crescimento completo: Para 50 mL de meio Neurobasal, adicionar os suplementos (500 ul de GlutaMax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 ul de solução de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 ul de 7,5% Bicarbonato de sódio. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
- Dois dias antes da cultura:
- Brasão de doze 35 mm pratos com fundo de vidro com 2 ml de solução de trabalho de poli-L-lisina, e manter sob o capô O / N.
- Um dia antes da cultura:
- Agente de revestimento vazio dos pratos e enxaguar com DDH 2 O. Permitir pratos para secar por uma hora sob o capô.
- Prepare meio de plaqueamento (DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10% (10% da solução total). Pipeta 2 ml de meio emcada prato, e incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO 2.
Nota: É importante evitar a pratos de cultura de plástico, quando a cultura. Use de pratos com fundo de vidro (para microscópios invertidos) ou lamelas de vidro (para microscópios verticais) produz imagens nítidas e claras. Comparado a um prato de plástico de baixo, o prato com fundo de vidro evita tons indesejados ou brilho durante microscopia fluorescente.
- soluções:
- Protocolo de cultura celular:
- Colocar refrigerado Tampão HBSS (100-150 ml), 100 mm pratos de petri, fórceps, tesouras, tubos de 50 ml e 15 ml tubos sob luz UV na capa.
- Euthanize rato grávida de inalação letal de 5% sevoflurano sob o capô fora da sala de cultura.
- Esterilizar com 70% de EtOH, tenda a pele da parte inferior do abdômen, utilizando fórceps durante o corte da cauda para cima no meio da cavity.Open abdominal do útero usando uma tesoura para expor a placenta.
- Remover 8-10 E18 fetos. Place 8-10 fetos em placas de Petri contendo solução de HBSS.
- Segure a parte de trás da cabeça do feto com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para cortar a cabeça do corpo. Coloque-o em uma outra placa de petri preenchida com 5-7 ml de HBSS. Transferir prato para capuz.
- Encha dois prato adicional petri 100 mm, com HBSS frio.
- Peel lado crânio, e colher cérebro em uma nova placa de petri preenchida com HBSS.
- Use uma pinça curvas acentuadas, cerebelo separada e tronco cerebral do cérebro, em seguida, transferir cérebro para uma nova placa de Petri com HBSS frio nele.
- Use uma pinça para fixar, separar os hemisférios com uma pinça curva. Remover meninges; isolar córtex frontal e peças de transferência para marcados tubos de centrífuga de 15 ml.
- Encha o tubo de 15 ml com frescos 2 ml HBSS e adicionar 20 ul de tripsina EDTA (10x mistura concentrada com 0,5% de tripsina e EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml.
- Incubar 10-15 min à temperatura ambiente. Agite cuidadosamente tubo a cada poucos minutos, não permitem resolver.
- After 10-15 min, o uso pipeta de vidro para remover velho HBSS e lavar duas vezes com HBSS novo.
- Mergulhe na inibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg Inibidor de tripsina em 2 ml de HBSS), misture bem e deixe descansar 5 min. Lavar duas vezes com HBSS fresco.
- Usando uma pipeta de vidro com bulbo de borracha, pedaços de cérebro Triturar 10-15 vezes muito lentamente, de modo a evitar bubbles.Triturate novamente utilizando uma pipeta calibrada e uma ponta estéril com um diâmetro de ponta reduzida muito lentamente até à homogeneidade.
- Transferência dissociada células a densidade desejada para pré-preparados pratos de cultura revestidos (50 células / mm2). Incubar O / N a 37 ° C, 5% de CO2.
- Após 24 h, substitua meio DMEM / F12 com meio Neurobasal sem soro crescimento completo feitos na hora.
- Manter as células em todos os momentos em CO 2/95% ar ambiente incubadora humidificada de 5% de, pelo menos, 12-14 dias antes da experimentação. Suplemento as células a cada 5-6 dias com meio Neurobasal fresco substituindo aproximadamente 50% do meio velho.
2. Labeling fluorescentes e Imunocitoqu�ica
Nota: A marcação imunofluorescente de culturas de células corticais primárias foi realizado em pratos de vidro de fundo de cultura de células de 35 mm com um volume de trabalho de 1 ml.
- Lava-se a placa com fundo de vidro duas vezes com tampão fosfato salino pH 7,4 (PBS).
- Fixar as células com paraformaldeído a 4% durante 15 min à TA.
- Lavar as células duas vezes com PBS e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min.
- Tratar as células durante 20 minutos à TA com uma coloração específica F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (01:40, 25 ul de faloidina em 1 mL de PBS).
- Lavar as células duas vezes com PBS e bloquear com soro de cabra normal a 10% à temperatura ambiente durante 1-2 h.
- Dilui-se o anticorpo policlonal anti-galinha MAP2 (1: 2500) em PBS com soro de cabra normal a 2% e incubar O / N a 4 o C.
- Após a incubação, lavar duas vezes em PBS.
- Dilui-se o anticorpo secundário (R AlexaEd cabra-594 conjugado anti-IgG de galinha (1: 500) com soro de cabra normal a 2% e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Lavar com PBS e adicionar 10 mL / prato de Hoescht corante.
- Incubar 3 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS.
Nota: As células marcadas agora pronto para o passo 3 (contagem de pontos lacrimais F-actina). - Preservar amostra de células com 100 ml de reagente Antifade como um agente de lamínula e manter a 4 ° C no escuro para armazenamento a longo prazo.
Nota: faloidina é relativamente estável em PBS a 4 ° C no escuro durante 1 semana e fluorescência podem ser preservados com antifade reagentes lamínulas. No entanto, imagens óptimas são obtidas a partir de 1-3 dias após coloração com faloidina desde pode começar a difundir para fora com o armazenamento prolongado.
Contando puncta 3. F-actina
- Ligue microscópio de fluorescência e mudar para 20 × objetiva. microscópio software Open, e configurar programa em 1280 × 960 pixels tamanho da imagem, e 0,1resolução de imagem / pixel 7 mm a 1 × zoom.
- Adquirir imagens de co-marcado F-actina / neurônios MAP2 sob verde (495 nm) / vermelho (613 nm) canais fluorescentes.
- Escolha 5 Green (F-actina) / vermelho (MAP2) immunolabeled / Blue (Hoescht) imagens fluorescentes de neurônio individual com mandris dendríticas claramente definidos.
- Identificar os F-actina estruturas ricas em segunda ordem segmento dendríticas (gama de comprimento 25-75 mm) com imunofluorescência MAP2 contínua.
- Gire a região selecionada de imagens para um nível horizontal. Copie e cole como uma nova imagem.
- Subtrair o fundo das imagens, usando uma ajustes consistentes para cada prato.
- Contar o puncta verde brilhante F-actina e traçar o comprimento do segmento dendrítica selecionados manualmente por observadores independentes treinados. Exportar os dados para um arquivo de planilha.
- Calcula-se a densidade dividindo F-actina total de pontos lacrimais marcada (N) por o comprimento (L) da MAP2 marcado dendritos. Dados expressos como o número de F-acpontos lacrimais estanho por 10 uM de dendrite
Nota: puncta (tamanho ≤1.5 uM) de fluorescência F-actina com uma intensidade de pico de pelo menos 50% superior à média de intensidade de coloração no eixo dendríticas foram incluídos em cada segmento seleccionado dendrítica.
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Representative Results
Nos presentes métodos, primeiro cultura rato neurônios corticais em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar os dendritos de neurônios individuais. Na Figura 1, o contraste interferência diferencial (DIC) imagens mostram as alterações morfológicas no desenvolvimento de rato fetal neurônios corticais nos dias 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Note-se que o comprimento e o número de dendritos aumentar com a maturação de neurónios primários de rato cultivadas. Os neurónios são utilizados em experiências só depois de 14 dias a maturação.
Para detectar alterações dendríticas e sinápticas, nós combinamos a rotulagem faloidina F-actina com a detecção de anticorpos MAP2 dos dendritos. Desde faloidina rotulagem de F-actina é muito rápida (20-30 min), é possível calcular visualmente a integridade da rede synaptodendritic antes de prosseguir com marcação com anticorpos TPI (Figura 2
Em seguida, vamos adquirir imagens de alta resolução de faloidina co-marcado (F-actina) / MAP2 neurônios e analisados neurônios selecionados aleatoriamente. Fina filopios, saliências da coluna, e os remendos de F-actina foram consideradas estruturas ricas F-actina e foram incluídos nos nossos estudos (Figura 3). Foram seleccionados os segmentos de segunda ordem dendritos (MAP2 positivas) para a análise de densidades de pontos lacrimais F-actina. coloração positiva MAP2 é utilizada para confirmar a localização neuronal os pontos lacrimais de F-actina. detecção e contagem de faloidina (F-actina) marcado (canal de fluorescência verde) assistida por computador puncta sináptica foi realizada através da utilização de software especializado. Há um passo a passo detalhado protocolo na Figura 4 2 = 0,97).
Anteriormente, foi utilizada a quantificação dos pontos lacrimais F-actina para avaliar a lesão synaptodendritic induzida pelo vírus HIV-1 Tat 9 e a recuperação da synaptopathy induzida por Tat de HIV-1 10. Na Figura 5, rato neurónios corticais foram co-marcadas com anticorpo faloidina e MAP2 depois de 50 nM de tratamento do HIV-1 Tat. MAP2 coloração revelou menos ramificações dendríticas e diminuiu F-actina seguinte HIV-1 Tat-tratamento.
Descobrimos que pontos lacrimais F-actina pode aumentar ou diminuir em resposta aos tratamentos experimentais. Na Figura 6, os neurónios em cultura foram tratados com the NMDA não competitivo antagonista do receptor da memantina, aumentando significativamente puncta positiva F-actina. Em contraste, o tratamento com uma combinação de Metanfetamina + Tat do HIV-1 resultaram em perda significativa de pontos lacrimais F-actina.
Figura 1. ratos neurônios corticais fetais em cultura de células imagens diferenciais de contraste de interferência (DIC) de rato fetal neurônios corticais entre 4 -. 27 dias in vitro (20x). Neurônios aparecem madura aos 14 dias in vitro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. faloidina / MAP2 co-rotulagem em neurônios corticais de rato. Neurônios cultivados marcadas com MAP2 anticorpo (vermelho) e faloidina (verde). Imagens fundidas permitir a determinação de que a coloração faloidina é localizada dendrites neuronais (20x). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. F-actina estruturas sinápticas de neurônios corticais de rato. Esquerda (A) - estruturas positivas F-actina marcada com faloidina (60X). As setas indicam F-actina estruturas rotuladas incluem espinhas de cogumelos (roxo), patch-como morfologia (azul) e longa filopódios (laranja). Médio - imagem mesclada demonstrando estas estruturas F-actina são localizados para dendritos (20x). Direito - Box no canto inferior direito indica o ramo dendríticas segunda ordem selecionada para análise (20X) (B) segmentos dendríticas de faloidina (F-actina) (verde) / MAP2. (Vermelho) neurônios corticais co-marcado (20x) são utilizados para verificar a origem neuronal de puncta F-actina. A única imagem verde (faloidina / F-actina) é processada. Imagens (C) faloidina / F-actina (verde) de três segmentos dendríticas selecionados para a contagem de pontos lacrimais. As densidades são determinados dividindo N / L. N = número de puncta, L = comprimento do segmento dendrítica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Demonstração de pacote de software:. Instruções passo a passo Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5. Tat do HIV-1 mediada lesão synaptodendritic em neurónios corticais de rato. As culturas de células foram co-coradas para a F-actina e MAP2 após o tratamento proteína HIV-1 Tat (50 nM). Alta panels- neurónios não tratados que mostram robusta F-actina, padrões de ramificações complexas e extensas processos neuronais finas. - painéis inferiores proteína HIV-1 Tat neurónios tratados com F-actina diminuída e diminuição da ramificação dendrítica. (20X) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. puncta F-actina em neurônios corticais de rato:. Diferentes efeitos produzidos pela memantina vs. tratamento Metanfetamina + Tat Imagens (20x) de neurônios cultivados não tratados, os neurônios tratados com memantina (10 mM), e neurônios tratados com MethamphEtamine (20 uM) 10 nM de Tat (10 nM). memantina aumentou a coloração de F-actina, ao passo que o tratamento Metanfetamina + Tat do HIV-1 diminuiu coloração de F-actina e diminuição da ramificação dendrítica. memantina aumentou significativamente a densidade pontos lacrimais F-actina, em relação a culturas de controlo não tratadas. Em contraste, os tratamentos Metanfetamina + Tat do HIV-1 diminuiu significativamente a densidade pontos lacrimais F-actina, em relação a culturas de controlo não tratadas. Média + SEM, * p <0,05. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, descrevemos a cultura de neurônios corticais de rato em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar dendritos de neurônios individuais. Em seguida, usamos faloidina e coloração MAP2 para detectar alterações dendríticas. Em seguida, foi utilizado um software especializado para quantificar mudanças na puncta F-actina.
Para determinar mudanças na puncta F-actina toda a rede neuronal de um neurônio individual deve ser claramente visível, o que permite a seleção de segunda ordem segmentos dendríticas adequados a partir de um único neurônio. chapeamento de baixa densidade é essencial, a fim de visualizar ambos os neurónios individuais, bem como para minimizar a presença de células da glia. Os astrócitos também conter F-actina e sem um marcador neuronal, poderia confundir a análise de pontos lacrimais positivo F-actina. culturas de baixa densidade, o uso de meio Neurobasal são úteis na diminuição da proliferação de astrócitos em culturas de células. No entanto, dada a ressalva de que a proteína F-actina énão específico para neurónios, marcadores de proteínas neuronais específicas, tais como MAP2, deve ser utilizada em conjunto com faloidina. Outros anticorpos de proteína também pode ser usado em conjunto com faloidina, tal como TH (tirosina hidroxilase) para identificação de populações neuronais específicas em cultura.
Uma técnica geral para estudar sinapses e morfologia sináptica é imunocitoquímica (ICC). ICC é popular uma vez que muitos anticorpos para proteínas sinápticas estão prontamente disponíveis, incluindo PSD 95, NMDAR (pós-sinápticos), bem como sinaptofisina, fagote e sinapsina I (pré-sinápticos) 11. No entanto, algumas estruturas podem não ser detectados por ICC (tal como filopódios fina), mas uma combinação de rotulagem faloidina F-actina com a detecção de anticorpos (ou rotulagem de casal com dois anticorpos diferentes) pode permitir uma investigação específica e complexa de subpopulações sinápticas e respostas diferenciadas aos tratamentos experimentais.
pontos lacrimais F-actina pode ser nomeadalarmente sensíveis a tratamentos experimentais. Recentemente, relatou que o tratamento com a proteína tat de HIV-1 produziu uma diminuição no ponto lacrimal F-actina (24 h) antes de qualquer evidência para a morte neuronal evidente (48 h) 10. É de notar que os tratamentos experimentais tanto podem estar aumentadas (memantina) ou diminuir (metanfetamina + HIV-1 Tat) F-actina puncta. Nós também descobrimos que a perda de puncta F-actina é uma resposta reversíveis após tratamentos experimentais específicas 10. Como tal, a F-actina pontos lacrimais quantificação é uma valiosa ferramenta para monitorizar não só synaptopathy aguda, mas também para estudar a recuperação sináptica e processos neurorestoration experimentais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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