Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

doi: 10.3791/53697 Published: February 10, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Filamentöst aktin protein (F-aktin) spelar en viktig roll i spinogenesis, synaptisk plasticitet, och synaptic stabilitet. Förändringar i dendritiska F-aktin rika strukturer föreslår förändringar i synaptiska integritet och anslutningsmöjligheter. Här ger vi ett detaljerat protokoll för odling primära råtta kortikala neuroner, Phalloidin färgning för F-aktin puncta, och efterföljande kvantifiering tekniker. Först den frontala cortex av E18 råttembryon dissocierade i låg densitet cellkultur, då nervceller som odlas in vitro under minst 12-14 dagar. Efter experimentell behandling, de kortikala nervceller färgas med Alexafluor 488 Phalloidin (för att märka den dendritiska F-aktin puncta) och mikrotubuli-associerat protein 2 (MAP2, att validera nervceller och dendritiska integritet). Slutligen är specialiserad programvara som används för att analysera och kvantifiera slumpmässigt utvalda neuronala dendriter. F-aktin rika strukturer identifieras på andra ordningens dendritiska grenar (längd intervall 25-75 &# 181; m) med kontinuerlig MAP2 immunofluorescens. Protokollet presenteras här kommer att bli en användbar metod för att undersöka förändringar i dendritiska synaps strukturer efterföljande experimentella behandlingar.

Introduction

Det primära målet med studien är att utveckla en tillförlitlig metod för mätning (uppskattning) av synaptisk integritet neuronala dendritiska nätverket. Här beskriver vi kvantifiering av F-aktin puncta i primär råtta odlade nervceller med hjälp av en kombination av Phalloidin färgning och immuncytokemiska (ICC) detektering av dendriter med efterföljande analys med hjälp av specialiserade (NIS-Elements) programvara.

Märkta phallotoxins har liknande affinitet för både stora och små trådar (F-aktin) men inte binder till monoklot aktin (G-aktin), till skillnad från vissa aktin antikroppar 1. Ospecifik bindning av Phalloidin är försumbar, vilket ger minimal bakgrunden under cellulär avbildning. Falloidin är mycket mindre än antikroppar som typiskt skulle kunna användas för att märka cellulära proteiner för fluorescensmikroskopi, vilket möjliggör en mycket mer intensiv märkning av F-aktin med falloidin. Således kan detaljerade bilder av F-aktin lokalisering i nervceller varaerhålls genom användning av märkt Phalloidin.

Phalloidin (F-aktin) färgning av neuronala dendriter genererar diskreta "hot spots" eller ljus "puncta", som utgör en mängd av dendritiska strukturer, inklusive mogna ryggar, icke-taggiga synapser 2 och omogna ryggar. Omogna ryggar inkluderar tunna filopodia och vissa former av plåster morfologi, och kan representera initieringen av spinogenesis 3. Omogna ryggar och icke-taggiga plåster saknar PSD95 4. Förändringar i produktionen av F-aktin leder till senare ändringar i inte bara ryggar utan också ytterligare dendritiska strukturer, vilket gör Phalloidin ett viktigt verktyg för att utreda synaptodendritic integritet 5-7. I allmänhet, antal Phalloidin-positiva (F-aktin) puncta återspeglar en balans mellan aktiva synapser (retande och hämmande), aktin dynamik och synaps stabilitet 8.

Även om det är viktigt att studera specifika types av synapser (dvs excitatoriska ryggar), när målet för en behandling är okänd är det nödvändigt att först beräkna den allmänna integriteten hos en variation av dendritiska strukturer. Eftersom F-aktin är en viktig del av Dendritutskotten och andra strukturer, inklusive hämmande synapser, en förändrad antal F-aktin puncta kan tyda på en synaptopathy. Denna synaptopathy kan sedan undersökas vidare för mer specifika förändringar. Vår kvantifiering metod för att detektera flera synaptiska typer / konstruktioner ger en övergripande uppskattning av dendritiska synaptiska förändringar (ökningar och minskningar) efter olika experimentella behandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurprotokoll har granskats och godkänts av Animal Care och användning kommittén vid University of South Carolina (försäkran Nummer: A3049-01).

1. låg densitet Embryonala Neuronala Kultur

  1. Förberedelse för primär kortikala neuron kultur
    1. lösningar:
      1. Förbereda Poly-L-Lysin förrådslösning genom att lösa upp 5 mg av poly-L-lysin i 10 ml boratbuffert.
      2. Bered arbetslösning genom att späda en ml Poly-L-lysin Stock i 49 ml boratbuffert.
      3. Förbered boratbuffert, pH 8,4 genom att starta med 395 ml dH 2 O och sedan tillsätta alla ingredienser (1,24 g borsyra + 1,9 g Borax). Justera pH till 8,4 med 1 M NaOH. Justera till 400 ml och filtrera med 0,2 um nylonmembranfilter under motorhuven.
      4. Bered HBSS lösning, pH 7,2 genom att starta med 445 ml dH 2 O och lägga alla andra ingredienser (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Justera pH till 7,2 med 1 N HCI, bring till 500 ml och filtrera med 0,2 um nylonmembranfilter under motorhuven.
      5. Förbered plätering medium: DMEM / F12 med 10% fetalt bovint serum. Filter med 0,2 ^ m nylonmembranfilter i dragskåp.
      6. Förbered komplett odlingsmedium: Till 50 ml Neurobasal medium, tillsätt tillägg (500 pl GlutaMax (100X) + 500 l Glukos + 1 ml B-27 (50 x) + 500 pl Antibiotika Antimykotisk lösning (100X) + 100 pl 7,5% natriumbikarbonat. Filtrera med 0,2 um nylonmembranfilter under motorhuven.
    2. Två dagar före kultur:
      1. Coat tolv 35 mm glasbottnade rätter med 2 ml Poly-L-lysin arbetslösning och hålla under huven O / N.
    3. En dag innan kulturen:
      1. Tom beläggningsmedlet från skålarna och skölj med DDH 2 O. Låt rätter att torka en timme under huven.
      2. Förbereda plating medium (DMEM / F12 med 10% fetalt bovint serum (10% av den totala lösningen). Pipettera 2 ml medium ivarje skål, och inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
        Obs: Det är viktigt att undvika odlingsskålar av plast vid odling. Användning av glasbottnade rätter (för inverterade mikroskop) eller glastäck (för upprätt mikroskop) ger skarpa och tydliga bilder. Jämfört med en plast nedre skålen undviker glas nedre skålen oönskade nyanser eller reflexer under fluorescensmikroskopi.
  2. Cellodlings protokoll:
    1. Sätta kyld HBSS buffert (100-150 ml), 100 mm petriskålar, pincetter, saxar, 50 ml rör och 15 ml rör under UV-ljus i huva.
    2. Avliva gravid råtta med dödlig inandning av 5% sevofluran under huven utanför odlingsrummet.
    3. Sterilisera med 70% EtOH, tält huden på nedre delen av buken med hjälp av pincett samtidigt minska från svansen upp i mitten av buken cavity.Open livmodern med sax för att exponera moderkakan.
    4. Ta bort 8-10 E18 foster. Place 8-10 foster i petriskålar innehållande HBSS lösning.
    5. Håll baksidan av huvudet av fostret med pincett, sedan använda sax för att skära av huvudet från kroppen. Placera den i en annan petriskål fylld med 5-7 ml HBSS. Överför skålen huva.
    6. Fyll två 100 mm petriskål med kallt HBSS.
    7. Peel undan skalle, och skopa hjärna i en ny petriskål fylld med HBSS.
    8. Använd vassa böjda pincett, separat lillhjärnan och hjärnstammen från hjärnan, sedan överföra hjärnan till en ny petriskål med kallt HBSS i det.
    9. Använd pincett för att säkra, separera halvkloten med böjda pincett. Avlägsna meninger; isolera frontala cortex och överföra bitar i märkta 15 ml centrifugrör.
    10. Fyll 15 ml rör med färskt 2 ml HBSS och tillsätt 20 l trypsin EDTA (10x koncentrerade blandningen med 0,5% trypsin och 5,3 mM EDTA.) Till varje 15 ml rör.
    11. Inkubera 10-15 minuter vid RT. Snurra försiktigt rör med några minuters mellanrum, inte tillåter att lösa.
    12. After 10-15 min, användning glaspipett för att avlägsna gamla HBSS och skölj två gånger med ny HBSS.
    13. Fördjupa sig i trypsininhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsininhibitor i 2 ml HBSS), blanda väl och låt det sitta fem minuter. Tvätta två gånger med färsk HBSS.
    14. Med användning av glaspipett med gummi glödlampa, Mal sönder hjärnbitar 10-15 gånger mycket långsamt för att undvika bubbles.Triturate igen med användning av en kalibrerad pipett och en steril spets med en reducerad spetsdiameter mycket långsamt tills den var homogen.
    15. Transfer dissocierade celler vid önskad densitet att förberedda belagda odlingsskålar (50 celler / mm2). Inkubera O / N vid 37 ° C, 5% CO2.
    16. Efter 24 timmar, ersätter DMEM / F12-medium med nybakade komplett tillväxtserumfritt Neurobasal medium.
    17. Bibehålla cellerna vid alla tidpunkter i en 5% CO2 / 95% rumsluft fuktad inkubator under minst 12-14 dagar före experiment. Komplettera cellerna var 5-6 dagar med färskt Neurobasal medium som ersätter cirka 50% av det gamla mediet.

2. Fluorescerande märkning och Immunocytochemistry

Obs: immunofluorescens märkning av primära kortikala cellodlingar utfördes i glas botten 35 mm cellodlingsskålar med en arbetsvolym av 1 ml.

  1. Tvätta glas nedre skålen två gånger med fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 (PBS).
  2. Fix celler med 4% paraformaldehyd under 15 min vid RT.
  3. Tvätta cellerna två gånger med PBS och permeabilisering med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
  4. Behandla cellerna under 20 min vid RT med en F-aktin-specifikt färgämne, Alexafluor 488 Phalloidin (01:40, 25 pl av Phalloidin i 1 ml PBS).
  5. Skölj cellerna två gånger med PBS och blockera med 10% normalt getserum vid rumstemperatur under 1-2 h.
  6. Späd kyckling polyklonala anti-MAP2 antikropp (1: 2500) i PBS med 2% normalt getserum och inkubera O / N vid 4 ° C
  7. Efter inkubation skölj i PBS två gånger.
  8. Späd den sekundära antikroppen (Alexa Red 594-konjugerad get-anti-kyckling IgG (1: 500) med 2% normalt getserum och inkubera i 2 h vid RT.
  9. Skölj med PBS och tillsätt 10 ul / platta av Hoescht färgämne.
  10. Inkubera 3 min vid RT och tvätta med PBS två gånger.
    Obs: De märkta cellerna nu redo för steg 3 (F-aktin puncta räkning).
  11. Bevara cellprov med 100 pl av antifad reagens som täckmedel och hålla vid 4 ° C i mörker under långtidsförvaring.
    Obs: Phalloidin är relativt stabil i PBS vid 4 ° C i mörker i upp till en vecka och fluorescens kan bevaras med antifad täck reagens. Men optimala bilder erhålls från 1-3 dagar efter färgning sedan Phalloidin kan börja diffundera ut med långtidsförvaring.

3. F-aktin puncta Counting

  1. Slå på fluorescensmikroskop och byta till 20 × mål. Öppen mikroskop programvara, och ställa in programmet på 1280 × 960 pixlar bildstorlek, och 0,17 pm / pixel upplösning på 1 x zoom.
  2. Förvärva bilder av co-märkt F-aktin / MAP2 neuroner i grönt (495 nm) / röd (613 nm) fluorescerande kanaler.
  3. Välj 5 Green (F-aktin) / Röd (MAP2) immunolabeled / Blå (Hoescht) fluorescerande bilder av enskilda neuron med klart definierade dendritiska hållare.
  4. Identifiera F-aktin rika strukturer i andra ordningens dendritiska segment (längdintervall 25-75 pm) med kontinuerlig MAP2 immunofluorescens.
  5. Rotera det markerade området av bilder till en horisontell nivå. Kopiera och klistra in som en ny bild.
  6. Subtrahera bakgrunden av bilder, med hjälp av en konsekvent justeringar för varje maträtt.
  7. Räkna den ljusa gröna F-aktin puncta och spåra längden på utvalda dendritiska segment manuellt av utbildad oberoende observatörer. Exportera data till ett kalkylark.
  8. Beräkna densiteten genom att dividera totala F-aktin märkt puncta (N) med längden (L) av MAP2 märkta dendriter. Express data som antal F-actenn puncta per 10 um av dendrit
    Notera: puncta (storlek ≤1.5 xm) av F-aktin fluorescens med en toppintensitet av minst 50% högre än den genomsnittliga intensiteten av färgning i den dendritiska axeln inkluderades i varje vald dendritisk segment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I föreliggande metoder, vi först kultur råtta kortikala neuroner vid låg densitet i 35 mm glasbottnade rätter, som gör det möjligt för oss att identifiera de dendriter av enskilda nervceller. I figur 1, differentialinterferenskontrast (DIC) bilder visar morfologiska förändringar i utvecklingen av fostrets råtta kortikala neuroner på dagarna 4, 6, 10, 14, 21 och 27 in vitro. Observera att längden och antalet dendriter ökar med mognaden av odlade rått primära nervceller. Nervceller används i försök endast efter 14 dagar mognad.

För att detektera dendritiska och synaptiska förändringar, kombinerar vi Phalloidin F-aktin märkning med MAP2 antikropp upptäckt av dendriter. Sedan Phalloidin märkning av F-aktin är mycket snabb (20-30 min), är det möjligt att visuellt uppskatta integritet synaptodendritic nätverk innan du fortsätter med ICC antikropp märkning (Figur 2

Nästa vi få högupplösta bilder samarbets märkt Phalloidin (F-aktin) / MAP2 neuroner och analyseras slumpmässigt utvalda nervceller. Fin filopodia, ryggrad utsprång och F-aktin plåster ansågs F-aktin rika strukturer och ingick i våra studier (Figur 3). Segment av andra ordningens dendriter (MAP2 positiva) valdes ut för analys av F-aktin puncta densiteter. MAP2 positiv färgning används för att bekräfta den neuronala lokalisering av F-aktin puncta. Datorstödd upptäckt och räkning av Phalloidin (F-aktin) märkt (grön fluorescens kanal) synaptiska puncta utfördes via användning av specialiserad programvara. Det är ett steg för steg detaljerat protokoll i fig 4 2 = 0,97).

Tidigare använde vi kvantifiering av F-aktin puncta att bedöma synaptodendritic skada inducerad av HIV-1 Tat 9 och återhämtning från HIV-1 Tat-inducerad synaptopathy 10. I figur 5, fanns råtta kortikala neuroner co-märkt med Phalloidin och MAP2-antikropp efter 50 nM av HIV-1 Tat-behandling. MAP2 färgning avslöjade färre dendritiska grenar och minskade F-aktin efter HIV-1 Tat-behandling.

Vi fann att F-aktin puncta kan antingen öka eller minska till följd av experimentella behandlingar. I figur 6, var odlade neuroner behandlades med the konkurrenskraftiga NMDA-receptorantagonisten memantin, avsevärt öka F-aktin positiv puncta. Däremot behandling med en kombination av Metamfetamin + HIV-1 Tat resulterade i betydande förlust av F-aktin puncta.

Figur 1
Figur 1. Fetal råtta kortikala neuroner i cellodling differential interferens kontrast (DIC) bilder av fostrets råtta kortikala neuroner mellan 4 -. 27 dagar in vitro (20X). Nervceller verkar mogna vid 14 dagar in vitro. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Phalloidin / MAP2 co-märkning i råtta kortikala neuroner. Odlade neuroner märkta med MAP2-antikropp (röd) och Phalloidin (grön). Sammanslagna bilder tillåter bestämningen att Phalloidin färgning är lokaliserad till neuronala dendriter (20X). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. F-aktin synaptiska strukturer av råtta kortikala neuroner. (A) Vänster - F-aktin positiva strukturer märkta med Phalloidin (60X). Pilarna visar F-aktin märkta strukturer innefattar svamp ryggar (lila), patch-liknande morfologi (blå) och långa filopodia (orange). USA - sammanslagna bilden visar dessa F-aktin strukturer är lokaliserade till dendriter (20X). Rätt - Box i det nedre högra hörnet visar andra ordningens dendritiska grenen ut för analys (20X) (B) Dendritiska segment av Phalloidin (F-aktin) (Grön) / MAP2. (Red) co-märkt kortikala neuroner (20X) används för att kontrollera neuronala ursprung F-aktin puncta. Den gröna enda bild (Phalloidin / F-aktin) bearbetas vidare. (C) Phalloidin / F-aktin (grön) bilder av tre dendritiska segment som valts ut för puncta räkning. Densiteterna bestäms genom att dividera N / L. N = antal puncta, L = längd dendritiska segment. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Demonstration av programpaketet. Steg för steg instruktioner Klicka här för att se en större version av denna siffra.

/53697fig5.jpg "/>
Figur 5. HIV-1 Tat-förmedlad synaptodendritic skada i råtta kortikala neuroner. Cellodlingar co-färgades för F-aktin och MAP2 efter HIV-1 Tat-proteinet behandling (50 nM). Övre panels- obehandlade neuroner visar robust F-aktin, komplexa förgreningsmönster, och omfattande fina neuronala processer. Lägre paneler - HIV-1 Tat protein behandlade nervceller med minskad F-aktin och minskad dendritiska förgrening. (20X) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. F-aktin puncta i råtta kortikala neuroner. Olika effekter som Memantine vs. Metamfetamin + Tat behandling bilder (20X) av obehandlade odlade nervceller, neuroner som behandlats med Memantine (10 M), och neuroner behandlades med MethamphEtamine (20 ^ M) 10 nM av Tat (10 nM). Memantinbehandling ökade F-aktin färgning, medan Metamfetamin + HIV-1 Tat behandling minskade F-aktin färgning och minskad dendritiska förgrening. Memantinbehandling signifikant ökad F-aktin puncta densitet, jämfört med obehandlade kontrollodlingar. Däremot Metamfetamin + HIV-1 Tat behandlingar minskade signifikant F-aktin puncta densitet, jämfört med obehandlade kontrollodlingar. Medelvärde + SEM, * p <0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll, beskriver vi odling råtta kortikala neuroner vid låg densitet i 35 mm glasbottnade rätter som gör det möjligt för oss att identifiera dendriter av enskilda nervceller. Nästa använder vi Phalloidin och MAP2 färgning att upptäcka dendritiska förändringar. Sedan använde vi specialiserad programvara för att kvantifiera förändringar i F-aktin puncta.

För att bestämma förändringar i F-aktin puncta hela neuronala nätverket av en enskild neuron måste vara tydligt, gör detta val av lämpliga andra ordningens dendritiska segment från en enda neuron. Low-density bordläggningen är avgörande för att både visualisera enskilda nervceller samt för att minimera förekomsten av gliaceller. Astrocyter innehåller också F-aktin och utan en neuronal markör kan förbrylla analys av F-aktin positiv puncta. Låg densitet kulturer och användningen av Neurobasal-medium är till hjälp för att minska astrocytisk proliferation i cellkulturerna. Men med tanke på förbehållet att F-aktin-proteinet ärinte specifika för neuroner, specifika neuronala proteinmarkörer, såsom MAP2, bör användas tillsammans med Phalloidin. Andra protein antikroppar kan också användas i samband med Phalloidin, såsom TH (tyrosinhydroxylas) för identifiering av specifika neuronala populationer i odling.

En allmän teknik för att studera synapser och synaptisk morfologi är immuncytokemi (ICC). ICC är populär eftersom många antikroppar för synaptiska proteiner är lätt tillgängliga, inklusive PSD 95, NMDAR (postsynaptisk) samt synaptophysin, fagott och synapsin I (presynaptisk) 11. Vissa strukturer kan inte upptäckas av ICC (t.ex. tunn filopodia), men en kombination av F-aktin Phalloidin märkning med detektionsantikropp (eller dubbel märkning med två olika antikroppar) kan medge specifik och komplicerad utredning av synaptiska subpopulationer och differential svar på experimentella behandlingar.

F-aktin puncta kan vara particbundet känslig för experimentella behandlingar. Vi rapporterade nyligen att behandling med HIV-1 Tat-protein produceras en minskning av F-aktin puncta (24 timmar) innan några bevis för öppen neuronal död (48 h) 10. Det är anmärkningsvärt att experimentella behandlingar kan antingen öka (memantin) eller minskning (metamfetamin + HIV-1 Tat) F-aktin puncta. Vi fann också att F-aktin puncta förlust är en reversibel reaktion efter specifika experimentella behandlingar 10. Som sådan, är F-aktin puncta kvantifiering ett värdefullt verktyg för att övervaka inte bara akut synaptopathy, men också för att studera synaptiska återhämtning och experimentella neurorestoration processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Boric acid Sigma B0252
Borax Sigma B9876
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
Glucose VWR 101174Y
HBSS Sigma H4641 10X
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
ProLong Gold Life Technologies P36930
Paraformaldehyde  Sigma P6148
Cover glass VWR 631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin Life Technologies A12379
Normal horse serum Life Technologies 26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2 abcam Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG Life Technologies A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 Life Technologies R37605
NIS-Elements software package Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope  Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter Fishersci 151-4020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heller, E. A., et al. The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses. PLoS One. 7, e39572 (2012).
  2. Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters. Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).
  3. Johnson, O. L., Ouimet, C. C. A regulatory role for actin in dendritic spine proliferation. Brain Res. 1113, 1-9 (2006).
  4. Rao, A., Craig, A. M. Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines. Hippocampus. 10, (5), 527-541 (2000).
  5. Matus, A., Ackermann, M., Pehling, G., Byers, H. R., Fujiwara, K. High actin concentrations in brain dendritic spines and postsynaptic densities. Proc Natl Acad Sci USA. 79, 7590-7594 (1982).
  6. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  7. Sekino, Y., Kojima, N., Shirao, T. Role of actin cytoskeleton in dendritic spine morphogenesis. Neurochem Int. 51, 92-104 (2007).
  8. Zhang, W., Benson, D. L. Stages of synapse development defined by dependence on F-actin. J Neurosci. 21, (14), 5169-5181 (2001).
  9. Bertrand, S. J., Aksenova, M. V., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 Tat protein variants: Critical role for the cysteine region in synaptodendritic injury. Exp Neurol. 248, 228-235 (2013).
  10. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Aksenova, M. V., Espensen-Sturges, T. D., Booze, R. M. Synaptodendritic recovery following HIV Tat exposure: neurorestoration by phytoestrogens. J Neurochem. 128, (1), 140-151 (2014).
  11. Lau, P. M., Zucker, R. S., Bentley, D. Induction of filopodia by direct local elevation of intracellular calcium ion concentration. J Cell Biol. 145, 1265-1275 (1999).
Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).More

Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (108), e53697, doi:10.3791/53697 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter